一种快速高效稳定验证辣椒基因功能的方法及应用

技术领域

本发明属于基因功能方法研究技术领域，尤其涉及一种快速高效稳定验证辣椒基因功能的方法及应用。

背景技术

生物体内普遍存在着基因沉默，表现为抵御转座子、病毒等外来核酸的入侵，特异性地识别与抑制外源基因的表达，维持生物体基因组的稳定性。VIGS(virus-induced genesilencing)是一种由病毒载体诱导的基因沉默技术，与转基因、基因敲除和反义抑制等方法相比VIGS技术具有周期短、成本低和高通量等优势，因此，VIGS常被用作研究植物基因的功能。VIGS主要是利用病毒载体携带目的基因侵染植物，在其复制和表达过程中形成双链RNA(dsRNA)，dsRNA在细胞中被特异性核酸内切酶Dicer切割成21～24nt的小分子干扰RNA(siRNA)片段，siRNA被RNA聚合酶扩增，以单链的形式和一些蛋白结合形成RNA诱导复合体(RISC)，这些复合体与目的基因mRNA特异性互作，导致其降解，从而发生转录后水平的基因沉默。

蔬菜类作物由于种类繁多，研究水平等多方面的原因，目前蔬菜类作物的遗传转化普遍存在非常大的困难，尤其是辣椒的遗传转化已经严重影响了辣椒基因功能的研究，同时在不同寄主植物的实际运用VIGS技术中发现效率和成功率也存在非常大的差异，所以目前急需一种专门适用于辣椒的且能够快速、高效、稳定验证辣椒基因功能的方法。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种快速高效稳定验证辣椒基因功能的方法及应用。本发明基于烟草脆裂病毒(TRV)开发的VIGS技术，构建了一套可快速、高效、稳定验证辣椒基因功能的方法，并在辣椒朝天椒和薄皮椒类型中通过严格条件优化得出，辣椒在农杆菌侵染后生长温度、农杆菌侵染浓度、农杆菌接种方式等方面有较为显著的影响，且最终发现，辣椒VIGS基因沉默体系的最优条件为：侵染后生长温度24℃，农杆菌接种浓度OD600值0.01，最佳接种方法为注射法。本发明中的方法对于辣椒中各种基因功能的验证意义重大。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明提供了一种快速高效稳定验证辣椒基因功能的方法，包括以下步骤：

步骤一：病毒载体TRV的构建：

根据NCBI公布的或已克隆的辣椒基因序列设计引物，克隆得到的片段连接病毒载体，转化至大肠杆菌，摇菌PCR检测后送测；检测DNA序列比对无误后，摇菌，提质粒，双酶切得到目的基因片段；同时将pTRV2的空载体质粒转化大肠杆菌，PCR检测，再摇菌，提质粒，双酶切，氯仿、乙醇沉淀后跑胶，胶回收得到酶切后的pTRV2载体片段；将目的基因片段和pTRV2载体连接后转化大肠杆菌，PCR检测，测序无误后，摇菌，提质粒；最后将提取的构建好的病毒载体质粒转入农杆菌；

步骤二：侵染Buffer配制：

先将95～100ml的灭菌双蒸水加入到95～100ml灭菌蒸馏水中，然后加入0.5～1.5ml 1MMgcl

步骤三：侵染菌液的制备：

利用农杆菌介导法进行辣椒VIGS实验，首先将TRV1和TRV2+目的基因片段的两个质粒载体分别转入农杆菌感受态GV3101，25～30℃培养1～3d；然后挑取阳性农杆菌单克隆于含有45～55mg/mL卡那霉素和8～12mg/mL利福平的液体LB培养基中；接着2500～3500rpm离心收集菌体，弃上清，用侵染Buffer悬浮细菌，并调浓度至OD600＝0.005～0.015；最后等体积混匀TRV1+TRV2和TRV1+(TRV2+目标基因片段)，室温放置2～4h或者25～30℃摇床80～120rpm振荡培养2～4；

步骤四：辣椒的生长和准备：

辣椒播种以后20d左右，当两片真叶长出以后进行接种；且接种前要浇水，接种后要控水；

步骤五：侵染条件的控制：

包括接种方式的选择、接种位置的使用以及注射后环境条件的控制。

优选的，所述步骤一中使用的辣椒基因为辣椒PDS基因，其序列如SEQ ID NO.1所示；得到的目标基因片段序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的，所述步骤一中使用的病毒载体为TRV，酶切位点为Xba I及Kpn I，大肠杆菌菌株为Trans-5a，农杆菌菌株为GV3101。

优选的，所述步骤二的具体过程为：先将98ml的灭菌双蒸水加入到98ml灭菌蒸馏水中，然后加入1ml 1M Mgcl

优选的，所述步骤三的具体过程为：首先将TRV1和TRV2+目的基因片段的两个质粒载体分别转入农杆菌感受态GV3101，28℃培养2d；然后挑取阳性的农杆菌单克隆于含有50mg/mL卡那霉素和10mg/mL利福平的液体LB培养基中；接着3000rpm离心收集菌体，弃上清，用侵染Buffer悬浮细菌，并调浓度至OD600＝0.01；最后等体积混匀TRV1+TRV2，TRV1+(TRV2+目标基因片段)，室温放置3h或者28℃摇床100rpm振荡培养3h；

优选的，所述步骤四中接种前1d浇水，接种后3d控水。

优选的，所述步骤五中选择的接种方式为注射接种，使用的接种位置为真叶背面。

优选的，所述步骤五中注射后环境条件的控制方式为：注射后置于18℃，黑暗条件生长2天，然后在24℃/18℃、16h day/8h night条件下正常培养。

优选的，所述方法还包括侵染完成后基因沉默效果的检测步骤。

本发明还提供了一种所述方法在辣椒PDS基因以外其他辣椒基因功能检测中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：

(1)在本发明中，首先VIGS可以用来沉默目标基因，从而观察在该基因静默的情况下植物的表现，通过比较沉默和非沉默植株之间的差异，研究人员可以推断出目标基因在植物的生长、发育、代谢等方面的功能；同时VIGS可以用于快速筛选大量基因，以确定它们在特定生物过程中的作用，这对于鉴定关键调控基因或新药物靶点非常有用；其次VIGS可以用来研究植物对病原体的抗性，通过沉默与病原体互作的基因，可以了解这些基因在植物的免疫反应中的作用，有助于改善植物品种的抗病性；最后VIGS还可用于验证特定基因在基因工程中的功能，目标基因与其他基因之间的相互作用，可以揭示基因调控网络和信号传导途径，从而更深入地理解生物体内复杂的基因调控机制。VIGS可以在作物当代快速检验目标基因的功能，对于作物研究中高效、稳定、高通量的优势非常显著。

(2)本发明在辣椒朝天椒和薄皮椒类型中，通过严格的条件优化得出，辣椒在农杆菌侵染后生长温度、农杆菌侵染浓度、农杆菌接种方式等方面都有较为显著的影响，且最终发现，辣椒VIGS基因沉默体系的最优条件为：侵染后生长温度为24℃，农杆菌接种浓度的OD600值为0.01，最佳接种方法为注射法。

附图说明

图1为本发明实施例1中接种前后辣椒植株的生长情况；

图2为本发明实施例1中已经发生基因沉默导致白化的辣椒叶片中PDS基因的相对表达量情况，其中包含野生型(WT)和发生白花的辣椒株系株系1-株系4；

图3为本发明实施例2中不同接种温度对辣椒PDS基因沉默效率的影响结果；

图4为本发明实施例3中不同农杆菌侵染浓度对辣椒PDS基因沉默效率的影响结果；

图5为本发明实施例4中不同接种方法对辣椒PDS基因沉默效率的影响结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。以下实施例中使用的试剂、试剂盒和仪器均可由市售获得，实施例中使用的方法如无特别说明，与常规使用的方法一致。

本实施例选用的辣椒品种为辣椒测序品种Zunla-1，病毒载体为TRV，酶切位点选用Xba I及Kpn I，大肠杆菌(Escherichia coli)菌株为Trans-5a，农杆菌菌株为GV3101。

下面结合实施例，对本发明的技术方案进行进一步详细阐述。

实施例1基于PDS基因VIGS沉默体系的建立及沉默效果验证

TRV系统主要包括两个载体：TRV1和TRV2。TRV1是一个辅助载体，而TRV2则携带着目的基因的干扰片段。

八氢番茄红素脱氢酶(PDS)是类胡萝卜素合成途径中的关键酶。当该基因表达受阻被沉默后，类胡萝卜素合成途径被阻断，植物便丧失了类胡萝卜素的光保护作用，从而使得植物产生光漂白现象，即叶片变白。因此，PDS基因被作为报告基因在VIGS沉默体系中普遍应用。为了更好地评价VIGS的沉默株率，利用VIGS对辣椒植株中PDS基因进行沉默，通过统计具有白花现象的植株数计算VIGS的沉默株率。

本实施例采用如下方法建立基于PDS基因的VIGS沉默体系：

步骤一：病毒载体TRV的构建：

先根据序列如SEQ ID NO.1所示的辣椒PDS基因设计引物，克隆得到的片段连接TRV病毒载体，转化至大肠杆菌Trans-5a，摇菌PCR检测后送测；检测DNA序列比对无误后，摇菌，提质粒，选择酶切位点Xba I及Kpn I，双酶切得到目的基因片段；同时将pTRV2的空载体质粒转化大肠杆菌，PCR检测，再摇菌，提质粒，双酶切，氯仿、乙醇沉淀后跑胶，胶回收得到酶切后的pTRV2载体片段；将目的基因片段和pTRV2载体连接后转入大肠杆菌感受态，PCR检测，测序无误后，摇菌，提质粒；最后将提取的构建好的病毒载体质粒转入农杆菌GV3101(Kan)；其中得到的目标基因片段序列如SEQ ID NO.2所示。

步骤二：侵染Buffer配制：

先将98ml的灭菌双蒸水加入到98ml灭菌蒸馏水中，然后加入1ml 1M Mgcl

步骤三：侵染菌液的制备：

首先将TRV1和TRV2+目的基因片段的两个质粒载体分别转入农杆菌感受态GV3101，28℃培养2d；然后挑取阳性的农杆菌单克隆于含有50mg/mL卡那霉素和10mg/mL利福平的液体LB培养基中；接着3000rpm离心收集菌体，弃上清，用侵染Buffer悬浮细菌，并调浓度至OD600＝0.01；最后等体积混匀TRV1+TRV2，TRV1+(TRV2+目标基因片段)，室温放置3h或者28℃摇床100rpm振荡培养3h；

步骤四：辣椒的生长和准备：

辣椒播种以后20d左右，当两片真叶长出以后进行接种，为了使菌液侵染更加高效完成，需要对辣椒苗进行控水处理，即接种前1d浇水，接种后3d控水处理更加有利于农杆菌的侵染发挥作用；

步骤五：侵染条件的控制：

辣椒苗生长出来20d左右，利用一次性注射器注射辣椒真叶背面，使整个叶片充满农杆菌溶液，但是为了提高侵染效果，接种侵染前1d浇水，接种后3d控水有利于农杆菌的侵染，注射后至于18℃，黑暗条件生长2天，然后在24℃/18℃、16h day/8h night条件下正常培养最有利于VIGS高效稳定的发挥功能。

辣椒PDS基因序列(SEQ ID NO.1)：

ATGCCCCAAATTGGACTTGTTTCTGCTGTCAACTTGAGAGTCCAAGGTAATTCAGCTTATCTTTGGAGCTCGAGGTCTTCTTTGGGAACTGATAGTCAAGATGGTTGCTCGCAAAGGAATTCGTTATGTTTTGGTGGTAGTGACTCAATGAGTCATAGGTTAAAGATTCGTAATCCCCATTCCATAACGAGAAGATTGGCTAAGGATTTCCGGCCTTTAAAGGTTGTTTGCATTGATTATCCAAGGCCAGAGCTAGACAATACAGTTAACTATTTGGAGGCTGCATTCTTATCATCATCATTCCGATCTTCTCCGCGCCCAACCAAACCACTGGAGATTGTTATTGCTGGTGCAGGTTTGGGTGGTTTGTCTACAGCAAAATATTTGGCAGATGCTGGTCACAAACCAATACTGCTGGAGGCAAGGGATGTTCTAGGTGGAAAGGTAGCTGCATGGAAAGATGATGATGGAGATTGGTATGAGACTGGTTTGCACATATTCTTTGGGGCTTACCCAAATATGCAGAACCTATTTGGAGAATTAGGGATAAATGATCGATTGCAATGGAAGGAACATTCGATGATATTTGCAATGCCAAACAAGCCAGGAGAATTCAGCCGCTTTGATTTCCCCGAAGCTTTACCTGCTCCTTTAAATGGAATTTTGGCAATCCTAAAGAACAATGAAATGCTTACATGGCCAGAAAAAGTCAAATTTGCAATTGGACTCTTGCCAGCAATGCTTGGTGGGCAATCTTATGTTGAAGCTCAAGACGGGATAAGTGTTAAGGACTGGATGAGAAAACAAGGTGTGCCGGATAGGGTGACGGATGAGGTGTTCATCGCCATGTCAAAGGCACTTAACTTCATAAATCCTGATGAGCTTTCGATGCAGTGCATCTTGATCGCGTTGAACAGATTTCTTCAGGAGAAACATGGTTCAAAAATGGCCTTTTTAGATGGTAATCCTCCTGAGAGACTTTGCATGCCGATTGTTGAACATATCGAGTCAAAAGGTGGACAAGTCAGACTGAACTCACGAATAAAAAAGATTGAGCTGAATGAGGATGGAAGTGTCAAGTGTTTTATACTGAACGATGGTAGTACAATTGAGGGAGATGCTTTTGTGTTTGCGACTCCAGTGGATATTTTCAAGCTTCTTTTGCCTGAAGACTGGAAAGAGATTCCATATTTCCAAAAGTTGGAGAAGTTAGTCGGAGTACCTGTGATAAATGTCCATATATGGTTTGACAGAAAACTGAAGAACACATCTGATAATTTGCTCTTCAGCAGAAGCCCACTGCTCAGTGTGTATGCTGACATGTCCGTCACATGTAAGGAATATTACGACCCCAACAAGTCCATGTTGGAATTGGTCTTTGCGCCTGCAGAAGAGTGGGTATCTCGCAGTGACTCTGAAATTATTGATGCTACAATGAAGGAACTAGCAAAGCTATTTCCTGATGAAATTTCGGCGGATCAGAGCAAAGCAAAAATATTGAAGTATCATGTTGTCAAAACTCCAAGGTCTGTATATAAAACTGTGCCAGGTTGTGAACCCTGTCGGCCCTTGCAAAGATCCCCTGTAGAGGGGTTTTATTTAGCTGGTGACTACACGAAACAGAAATACTTGGCTTCAATGGAAGGTGCTGTCTTATCAGGAAAGCTTTGTGCACAAGCTATTGTACAGTTAGCAGTCTCCGTTTCTCATGAATCTGGTGTGAGGAGAGCGGTTGTCAAG

目标基因片段序列(SEQ ID NO.2)：

AGGTCTTCTTTGGGAACTGATAGTCAAGATGGTTGCTCGCAAAGGAATTCGTTATGTTTTGGTGGTAGTGACTCAATGAGTCATAGGTTAAAGATTCGTAATCCCCATTCCATAACGAGAAGATTGGCTAAGGATTTCCGGCCTTTAAAGGTTGTTTGCATTGATTATCCAAGGCCAGAGCTAGACAATACAGTTAACTATTTGGAGGCTGCATTCTTATCATCATCATTCCGATCTTCTCCGCGCCCAACCAAACCACTGGAGATTGTTATTGCTGGTGCAGGTTTGGGTGGTTTGTCT

采用注射法接种15d前后的辣椒的生长情况如图1所示。

结果显示：采用注射法接种15d后，辣椒植株出现了光漂白现象。

将已经发生基因沉默导致白化的辣椒叶片提取RNA进行辣椒反转录用于RT-PCR分析辣椒PDS基因的相对表达量，结果如图2所示。

结果显示：与对照野生材料相比较，表现出白化的辣椒材料中辣椒PDS基因的相对表达量非常低，说明本沉默体系能对辣椒中的相应的目标基因进行基因沉默。

实施例2辣椒VIGS体系中侵染后生长温度对沉默效率的影响

辣椒属于喜温蔬菜作物，由此接种侵染以后得生长温度可能对辣椒VIGS的沉默效率存在影响。本实施例设置了不同的侵染后生长温度，其他方法与实施例1相同。不同侵染后生长温度对沉默效率的影响情况如图3所示。

结果显示：当辣椒温度处于20℃时，侵染沉默效率为11％；当侵染后生长温度处于24℃时，侵染沉默效率为40％；当侵染后的生长温度为28℃时，辣椒基因沉默效率为13％。由此表明接种侵染后的生长温度对辣椒VIGS的基因沉默效率有较大影响，且最佳的侵染接种后的生长温度为24℃。

实施例3农杆菌接种浓度多与辣椒VIGS沉默效率的影响

农杆菌介导的病毒侵染以及遗传转化对于不同作物的耐受程度并不相同，由此探索辣椒最适的VIGS的农杆菌侵染浓度对于提高辣椒VIGS沉默效率不同作物对于农杆菌的耐受程度农杆菌的不同接菌浓度对番茄的VIGS沉默株率有显著影响。本实施例设置了不同的农杆菌侵染浓度，其他方法与实施例1相同。不同农杆菌侵染浓度对沉默效率的影响情况如图4所示。

结果显示：当农杆菌菌液OD600＝0.01时，PDS基因的沉默比例最高，为15％；当农杆菌菌液OD600＝0.005时，PDS基因的沉默比例次之，为13％；而农杆菌菌液OD600＝0.001和0.5时沉默比例仅为5％和3％。由此表明农杆菌侵染浓度对辣椒VIGS的基因沉默效率也有很大影响，且最佳的农杆菌侵染浓度为OD600＝0.01。

实施例4辣椒VIGS基因沉默中侵染方法对沉默效率的影响

农杆菌的活体接种目前主要有真空浸润法和注射法，同时还有两种方法的叠加使用来提高农杆菌的侵染效率。本实施例分别研究了真空浸润法和注射法对沉默效率的影响，其他方法与实施例1相同，结果如图5所示。

结果显示：对于播种后15d左右的辣椒苗，利用真空浸润法和注射法导致辣椒PDS基因沉默的效率分别为8％和21％，当两种方法叠加以后对于辣椒的基因沉默效率反而降低至6％，可能是由于辣椒苗前期生长较弱真空浸润的条件下对于辣椒的损伤过大，因此该方法并不适用辣椒的VIGS验证。

综上所述，本发明在辣椒朝天椒和薄皮椒类型中，通过严格的条件优化，得出了辣椒在农杆菌侵染后生长温度、农杆菌侵染浓度、农杆菌接种方式等方面都有较为显著影响的结论，研究发现，辣椒VIGS基因沉默体系的最优条件为侵染后生长温度为24℃，注射前1天浇水，注射后3天控水，注射后至于18℃，黑暗条件生长2天，然后在24℃/18℃、16h day/8h night条件，农杆菌接种浓度的OD600值为0.01，最佳的接种方法为注射法。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。