表达嵌合抗原受体的病毒特异性免疫细胞

相关申请的交叉引用

本申请要求2021年4月27日提交的第63/201,384号美国临时申请的优先权，该申请通过引用整体并入本文。

技术领域

本发明涉及分子和细胞生物学，还涉及医学治疗和预防方法。

背景技术

尽管自体嵌合抗原受体(CAR)T细胞在血液系统恶性肿瘤中取得了成功，但这种潜在的治疗方法的更广泛使用仍存在障碍。制备失败、输注前疾病进展以及高昂的成本对许多人来说都是令人望而却步的。迫切需要一种立即可用的CAR T细胞选择。

来自健康供体的“现成”T细胞产品可以快速施用，这将改善可获得性并降低过继细胞免疫疗法的成本。然而，“现成”CAR T细胞疗法的发展受到两个主要陷阱的阻碍：来自无关供体的多克隆激活的CAR T细胞可能导致移植物抗宿主病(GVHD)，以及接受体同种反应性T细胞对同种异体CAR T细胞的排斥。

发明内容

在第一方面，本公开提供了一种生成或扩增对病毒有特异性的免疫细胞群体的方法，所述方法包括：通过在下述的存在下：(i)对应于病毒的一种或多种抗原的全部或部分的一种或多种肽；或(ii)呈递对应于病毒的一种或多种抗原的全部或部分的一种或多种肽的抗原呈递细胞(APC)，在包含人血小板裂解物的细胞培养基中培养外周血单核细胞(PBMC)来刺激对病毒有特异性的免疫细胞。

在一些实施方案中，细胞培养基包含1-20％v/v的人血小板裂解物，任选地其中细胞培养基包含5％v/v的人血小板裂解物。

在一些实施方案中，所述PBMC被清除了CD45RA阳性细胞，任选地其中所述方法包括在先步骤：清除PBMC群体的CD45RA阳性细胞以获得清除了CD45RA阳性细胞的PBMC。

在一些实施方案中，病毒是EB病毒(EBV)，任选地其中一种或多种EBV抗原包括选自由以下组成的组的EBV抗原：EBNA1、LMP1、LMP2、BARF1、BZLF1、BRLF1、BMLF1、BMRF1、BMRF2、BALF2、BNLF2A和BNLF2B。

在一些实施方案中，细胞培养基包含5至15ng/ml IL-7，任选地其中细胞培养基包含约10ng/ml IL-7。

在一些实施方案中，细胞培养基包含5至15ng/ml IL-15，任选地其中细胞培养基包含约10ng/ml IL-15。

在一些实施方案中，所述方法还包括将编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸引入对病毒有特异性的免疫细胞中，任选地其中CAR包含特异性结合CD30的抗原结合结构域。

在一些实施方案中，将编码CAR的核酸引入对病毒有特异性的免疫细胞包括使对病毒有特异性的免疫细胞与组合物接触，所述组合物包含：(a)编码CAR的病毒载体，和(b)Vectofusin-1。

在一些实施方案中，所述方法还包括在人白细胞抗原-阴性淋巴母细胞(HLA阴性LCL)的存在下，培养对病毒有特异性的免疫细胞、或者包含嵌合抗原受体(CAR)或编码CAR的核酸的对病毒有特异性的免疫细胞。

在一些实施方案中，对病毒有特异性的免疫细胞与HLA阴性LCL的比率、或者包含CAR或编码CAR的核酸的对病毒有特异性的免疫细胞与HLA阴性LCL的比率为1:1至1:10，任选地其中所述比率为1:2至1:5，任选的其中所述比率为1:3。

在一些实施方案中，在HLA阴性LCL存在下的培养是在不存在添加的对应于病毒的一种或多种抗原的全部或部分的外源肽的情况下进行的。

本公开还提供了一种生成或扩增对病毒有特异性的免疫细胞群体的方法，所述方法包括在人白细胞抗原-阴性淋巴母细胞(HLA阴性LCL)的存在下，在不存在添加的对应于病毒的一种或多种抗原的全部或部分的外源肽的情况下，培养对病毒有特异性的免疫细胞。

在一些实施方案中，所述方法包括：

通过在下述的存在下：(i)对应于病毒的一种或多种抗原的全部或部分的一种或多种肽；或(ii)呈递对应于病毒的一种或多种抗原的全部或部分的一种或多种肽的抗原呈递细胞(APC)，培养外周血单核细胞(PBMC)来刺激对病毒有特异性的免疫细胞；和

在HLA阴性LCL的存在下，在不存在添加的对应于病毒的一种或多种抗原的全部或部分的外源肽的情况下，培养对病毒有特异性的免疫细胞。

在一些实施方案中，所述方法包括：

通过在下述的存在下：(i)对应于病毒的一种或多种抗原的全部或部分的一种或多种肽；或(ii)呈递对应于病毒的一种或多种抗原的全部或部分的一种或多种肽的抗原呈递细胞(APC)，培养外周血单核细胞(PBMC)来刺激对病毒有特异性的免疫细胞；

将编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸引入对病毒有特异性的免疫细胞中，任选地其中CAR包含特异性结合CD30的抗原结合结构域；和

在HLA阴性LCL存在下，培养包含嵌合抗原受体(CAR)或编码CAR的核酸的对病毒有特异性的免疫细胞。

在一些实施方案中，对病毒有特异性的免疫细胞与HLA阴性LCL的比率、或者包含CAR或编码CAR的核酸的对病毒有特异性的免疫细胞与HLA阴性LCL的比率为1:1至1:10，任选地其中所述比率为1:2至1:5，任选地其中所述比率为1:3。

在一些实施方案中，所述方法包括通过在包含人血小板裂解物的细胞培养基中培养PBMC来刺激对病毒有特异性的免疫细胞。

在一些实施方案中，细胞培养基包含1-20％v/v的人血小板裂解物，任选地其中细胞培养基包含5％v/v的人血小板裂解物。

在一些实施方案中，所述PBMC被清除了CD45RA阳性细胞，任选地其中所述方法包括在先步骤：清除PBMC群体的CD45RA阳性细胞的以获得清除了CD45RA阳性细胞的PBMC。

在一些实施方案中，病毒是EB病毒(EBV)，任选地其中一种或多种EBV抗原包括选自由以下组成的组的EBV抗原：EBNA1、LMP1、LMP2、BARF1、BZLF1、BRLF1、BMLF1、BMRF1、BMRF2、BALF2、BNLF2A和BNLF2B。

在一些实施方案中，细胞培养基包含5至15ng/ml IL-7，任选地其中细胞培养基包含约10ng/ml IL-7。

在一些实施方案中，细胞培养基包含5至15ng/ml IL-15，任选地其中细胞培养基包含约10ng/ml IL-15。

在一些实施方案中，将编码CAR的核酸引入对病毒有特异性的免疫细胞包括使对病毒有特异性的免疫细胞与组合物接触，所述组合物包含：(a)编码CAR的病毒载体，和(b)Vectofusin-1。

本公开还提供了一种产生包含嵌合抗原受体(CAR)或编码CAR的核酸的对病毒有特异性的免疫细胞的方法，所述方法包括：通过包括使对病毒有特异性的免疫细胞与包含(a)编码CAR的病毒载体和(b)Vectofusin-1的组合物接触的方法，将编码CAR的核酸引入对病毒有特异性的免疫细胞中；

任选地，其中CAR包含特异性结合CD30的抗原结合结构域。

在一些实施方案中，所述方法包括：

通过在下述的存在下：(i)对应于病毒的一种或多种抗原的全部或部分的一种或多种肽；或(ii)呈递对应于病毒的一种或多种抗原的全部或部分的一种或多种肽的抗原呈递细胞(APC)，培养外周血单核细胞(PBMC)来刺激对病毒有特异性的免疫细胞；和

通过包括使对病毒有特异性的免疫细胞与包含(a)编码CAR的病毒载体和(b)Vectofusin-1的组合物接触的方法，将编码CAR的核酸引入对病毒有特异性的免疫细胞中。

在一些实施方案中，所述方法包括通过在包含人血小板裂解物的细胞培养基中培养PBMC来刺激对病毒有特异性的免疫细胞。

在一些实施方案中，细胞培养基包含1-20％v/v的人血小板裂解物，任选地其中细胞培养基包含5％v/v的人血小板裂解物。

在一些实施方案中，所述PBMC被清除了CD45RA阳性细胞，任选地其中所述方法包括在先步骤：清除PBMC群体的CD45RA阳性细胞以获得清除了CD45RA阳性细胞的PBMC。

在一些实施方案中，病毒是EB病毒(EBV)，任选地其中一种或多种EBV抗原包括选自由以下组成的组的EBV抗原：EBNA1、LMP1、LMP2、BARF1、BZLF1、BRLF1、BMLF1、BMRF1、BMRF2、BALF2、BNLF2A和BNLF2B。

在一些实施方案中，细胞培养基包含5至15ng/ml IL-7，任选地其中细胞培养基包含约10ng/ml IL-7。

在一些实施方案中，细胞培养基包含5至15ng/ml IL-15，任选地其中细胞培养基包含约10ng/ml IL-15。

在一些实施方案中，所述方法还包括在人白细胞抗原-阴性淋巴母细胞(HLA阴性LCL)的存在下，培养对病毒有特异性的免疫细胞、或者包含嵌合抗原受体(CAR)或编码CAR的核酸的对病毒有特异性的免疫细胞。

在一些实施方案中，对病毒有特异性的免疫细胞与HLA阴性LCL的比率、或者包含CAR或编码CAR的核酸的对病毒有特异性的免疫细胞与HLA阴性LCL的比率为1:1至1:10，任选地其中所述比率为1:2至1:5，任选的其中所述比率为1:3。

在一些实施方案中，在HLA阴性LCL存在下的培养是在不存在添加的对应于病毒的一种或多种抗原的全部或部分的外源肽的情况下进行。

本公开还提供了一种生成或扩增包含嵌合抗原受体(CAR)或编码CAR的核酸的对病毒有特异性的免疫细胞群体的方法，所述方法包括：

通过在下述的存在下：(i)对应于病毒的一种或多种抗原的全部或部分的一种或多种肽；或(ii)呈递对应于病毒的一种或多种抗原的全部或部分的一种或多种肽的抗原呈递细胞(APC)，在包含人血小板裂解物的细胞培养基中培养外周血单核细胞(PBMC)来刺激对病毒有特异性的免疫细胞；

通过包括使对病毒有特异性的免疫细胞与包含(a)编码CAR的病毒载体和(b)Vectofusin-1的组合物接触的方法，将编码CAR的核酸引入对病毒有特异性的免疫细胞中，任选地其中CAR包含特异性结合CD30的抗原结合结构域；和

在HLA阴性LCL的存在下，培养包含嵌合抗原受体(CAR)或编码CAR的核酸的对病毒有特异性的免疫细胞。

在一些实施方案中，细胞培养基包含1-20％v/v的人血小板裂解物，任选地其中细胞培养基包含5％v/v的人血小板裂解物。

在一些实施方案中，所述PBMC被清除了CD45RA阳性细胞，任选地其中所述方法包括在先步骤：清除PBMC群体的CD45RA阳性细胞以获得清除了CD45RA阳性细胞的PBMC。

在一些实施方案中，病毒是EB病毒(EBV)，任选地其中一种或多种EBV抗原包括选自以下组成的组的EBV抗原：EBNA1、LMP1、LMP2、BARF1、BZLF1、BRLF1、BMLF1、BMRF1、BMRF2、BALF2、BNLF2A和BNLF2B。

在一些实施方案中，细胞培养基包含5至15ng/ml IL-7，任选地其中细胞培养基包含约10ng/ml IL-7。

在一些实施方案中，细胞培养基包含5至15ng/ml IL-15，任选地其中细胞培养基包含约10ng/ml IL-15。

在一些实施方案中，包含CAR或编码CAR的核酸的对病毒有特异性的免疫细胞与HLA阴性LCL的比率为1:1至1:10，任选地其中所述比率为1:2至1:5，任选地其中所述比率为1:3。

在一些实施方案中，在HLA阴性LCL存在下的培养是在不存在添加的对应于病毒的一种或多种抗原的全部或部分的外源肽的情况下进行。

本公开还提供了通过根据本公开的方法获得或可获得的细胞或细胞群体。

本公开还提供了一种药物组合物，其包含根据本公开的细胞或细胞群体，以及药学上可接受的运载体、佐剂、赋形剂或稀释剂。

本公开还提供了根据本公开的细胞、细胞群体或药物组合物，用于医学治疗或预防的方法。

本公开还提供了根据本公开的细胞、细胞群体或药物组合物，用于治疗或预防癌症的方法。

本公开还提供了根据本公开的细胞、细胞群体或药物组合物在制备用于治疗或预防癌症的药物中的用途。

本公共还提供了一种治疗或预防癌症的方法，所述方法包括向受试者施用治疗或预防有效量的根据本公开的细胞、细胞群体或药物组合物。

在一些实施方案中，癌症选自由以下组成的组：CD30-阳性癌症、EBV-相关的癌症、血液学癌症、髓系血液系统恶性肿瘤、造血系统恶性肿瘤、淋巴母细胞血液系统恶性肿瘤、骨髓增生异常综合征、白血病、T细胞白血病、急性髓系白血病、慢性髓系白血病、急性淋巴母细胞白血病、淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、B细胞非霍奇金淋巴瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤，EBV相关淋巴瘤、EBV阳性B细胞淋巴瘤、EBV阳性弥漫性大B细胞淋巴瘤、与X连锁淋巴增生性病症相关的EBV阳性淋巴瘤、与HIV感染/AIDS相关的EBV阳性淋巴瘤、口腔毛状白斑、伯基特淋巴瘤、移植后淋巴增生性疾病、中枢神经系统淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、ALK阳性间变性T细胞淋巴瘤、ALK阴性间变性T细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、NK-T细胞淋巴瘤、结外NK-T细胞性淋巴瘤、胸腺瘤、多发性骨髓瘤、实体性癌症、上皮细胞癌症、胃部癌症、胃癌、胃腺癌、胃肠腺癌、肝癌症、肝细胞癌、胆管癌、头颈癌症、头颈鳞状细胞癌、口腔癌症、口咽部癌症、口咽癌、口部癌症、喉癌症、鼻咽癌、食管癌症、结直肠部癌症、结直肠癌、结肠部癌症、结肠癌，宫颈癌、前列腺癌症、肺癌症、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺腺癌、鳞状肺细胞癌、膀胱癌症、尿路上皮癌、皮肤癌症、黑色素瘤、晚期黑色素瘤，肾细胞癌症、肾细胞癌、卵巢癌症、卵巢癌、间皮瘤、乳腺癌症、脑癌症、胶质母细胞瘤、前列腺癌症、胰腺癌症、肥大细胞增多症、晚期全身肥大细胞增多病、生殖细胞肿瘤或睾丸肿瘤。

本公开还提供了根据本公开的细胞、细胞群体或药物组合物，用于治疗或预防以同种反应性免疫应答为特征的疾病或病症的方法。

本公开还提供了根据本公开的细胞、细胞群体或药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防以同种反应性免疫应答为特征的疾病或病症。

本公开还提供了一种治疗或预防以同种反应性免疫应答为特征的疾病或病症的方法，所述方法包括向受试者施用治疗或预防有效量的根据本公开的细胞、细胞群体或药物组合物。

在一些实施方案中，以同种反应性免疫应答为特征的疾病或病症是与同种异体移植相关的疾病或病况。

在一些实施方案中，疾病或病症是移植物抗宿主病(GVHD)。

在一些实施方案中，疾病或病症是移植物排斥。

在一些实施方案中，所述方法包括在收获所述同种异体移植物之前，将治疗或预防有效量的细胞、细胞群体或药物组合物施用给相对于同种异体移植物而言的供体受试者。

在一些实施方案中，所述方法包括将治疗或预防有效量的细胞、细胞群体或药物组合物施用给相对于同种异体移植物而言的接受体受试者。

在一些实施方案中，所述方法包括使同种异体移植物与治疗或预防有效量的对病毒有特异性的免疫细胞或组合物接触。

本公开还提供了根据本公开的细胞、细胞群体或药物组合物，用于通过同种异体移植来治疗或预防疾病或病症的方法。

本公开还提供了根据本公开的细胞、细胞群体或药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于通过同种异体移植来治疗或预防疾病或病症。

本公开还提供了一种通过同种异体移植来治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包括向受试者施用治疗或预防有效量的根据本公开的细胞、细胞群体或药物组合物。

在一些实施方案中，所述方法包括在收获同种异体移植物之前，将治疗或预防有效量的细胞、细胞群体或药物组合物施用给相对于同种异体移植物而言的供体受试者。

在一些实施方案中，所述方法包括将治疗或预防有效量的细胞、细胞群体或药物组合物施用给相对于同种异体移植物而言的接受体受试者。

在一些实施方案中，所述方法包括使同种异体移植物与治疗或预防有效量的细胞、细胞群体或药物组合物接触。

在一些实施方案中，同种异体移植包括同种异体免疫细胞的过继转移。

在一些实施方案中，疾病或病症是T细胞功能失调病症、癌症或传染病。

本公开还提供了一种杀死同种反应性免疫细胞的方法，所述方法包括将同种反应性免疫细胞与根据本公开的细胞或细胞群体，或药物组合物接触。

具体实施方式

本发明人开发了一种CAR修饰的病毒特异性T细胞(CAR-VST)方法，用于消除血液系统恶性肿瘤而不引起GVHD，并避免同种异体排斥。

本公开提供了一种消除同种反应性T细胞的策略，以保护包括现成细胞疗法在内的同种异体组织免受移植物排斥，或治疗GVHD。

CD30已被鉴定为同种反应性T细胞的标志物，因此本发明人通过工程化治疗性T细胞以表达针对CD30的嵌合抗原受体(CAR)(CD30.CAR)来靶向它们。表达CD30.CAR的VST可用于使用同种异体疗法的方法中，以减少接受体受试者的同种异体反应免疫应答。

将同种异体T细胞施用给HLA不匹配的接受体会带来同种反应性免疫应答(例如GVHD)的风险，因为一定比率的T细胞将固有地具有同种反应性。本发明人使用病毒特异性T细胞(VST)作为表达CD30.CAR的平台细胞，因为它们已被证明很少在同种异体接受体中引起GVHD，这可能是其TCR库受限的结果。特别是，EB病毒特异性T细胞(EBVST)已被施用给300多名同种异体接受体，但没有任何GVHD的证据。

此外，表达CD30.CAR的VST本身受到保护而不被接受体中的同种反应性T细胞的排斥，因此可以直接用作现成的疗法，例如用于CD30+癌症的治疗。

因此，CD30.CAR VST将(i)消除它们在同种异体宿主中引发的同种反应性T细胞，以及(ii)持续足够的时间并具有消除CD30阳性癌症所需的活性，而不引起GVHD。

表达CD30.CAR的VST也可以被工程化以靶向额外的靶抗原，例如通过工程化以表达对CD30以外的一种或多种额外靶抗原有特异性的CAR。这种细胞可用作治疗例如表达一种或多种相关靶抗原的癌症的现成疗法，因为它们能够杀死表达一种或多种靶抗原的细胞，并且还能够消除表达CD30的同种异体T细胞。

本公开提供了用于生产表达CAR的病毒特异性免疫细胞的改善的方法，通过简化的过程产生具有增强功能的细胞。

产生表达CAR的病毒特异性免疫细胞

本公开的方面和实施方案涉及用于产生表达CAR的病毒特异性免疫细胞的方法，包括用于生成、产生和/或扩增这种细胞群体的方法。

用于在体外/离体生成/扩增病毒特异性免疫细胞群体的方法是本领域技术人员公知的。典型的培养条件(即细胞培养基、添加剂、温度、气体气氛)、细胞数量、培养期等可以通过参考例如Ngo等人,J Immunother.(2014)37(4):193–203来确定，通过引用将其整体并入本文。

方便地，根据本公开的细胞培养物可以维持在37℃在含有5％CO

培养物可以在适合培养物体积的任何容器中进行，例如在细胞培养板的孔、细胞培养瓶、生物反应器等中。在一些实施方案中，细胞在生物反应器中培养，例如在Somerville和Dudley,Oncoimmunology(2012)1(8):1435-1437中描述的生物反应器，通过引用将其请整体并入本文。在一些实施方案中，细胞在GRex细胞培养容器中培养，例如GRex烧瓶或GRex100生物反应器。

所述方法通常包括在呈递病毒抗原肽：MHC复合物的抗原呈递细胞(APC)存在下，在提供适当的共刺激和信号放大以引起激活和扩增的条件下，培养包含具有抗原特异性受体的细胞的免疫细胞群体(例如免疫细胞的异质群体，例如外周血单核细胞，PBMC)。APC可被编码病毒抗原/肽的病毒所感染或可包含/表达病毒抗原/肽，并在MHC分子的背景下呈递病毒抗原肽。刺激引起T细胞激活，并促进细胞分裂(增殖)，导致生成和/或扩增对病毒抗原有特异性的T细胞群体。T细胞激活的过程是本领域技术人员公知的，并在例如Immunobiology,第5版.Janeway CAJr,Travers P,Walport M,等人New York:GarlandScience(2001),Chapter 8中详细描述，通过引用将其整体并入本文。

与刺激前的群体相比，刺激后获得的细胞群体富集了对病毒有特异性的T细胞(即，病毒特异性T细胞在刺激后的群体中以增加的频率存在)。以这种方式，从具有不同特异性的异质性T细胞群体中扩增/生成对病毒有特异性的T细胞群体。通过刺激和随后的细胞分裂，可以从单个T细胞生成对病毒有特异性的T细胞群体。对病毒有特异性的现有T细胞群体可以通过对病毒特异性T细胞群体的刺激和随后的细胞分裂来扩增。

本公开的方面和实施方案特别涉及EBV特异性免疫细胞。因此，在一些实施方案中，病毒可以是EBV，并且病毒抗原可以是EBV抗原。用于生成/扩增EBV特异性免疫细胞群体的方法描述于例如WO 2013/088114 A1、Lapteva和Vera,Stem Cells Int.(2011):434392,Straathof等人,Blood(2005)105(5):1898–1904,WO 2017/202478 A1,WO 2018/052947 A1和WO 2020/214479A1中，所有这些都通过引用将其整体并入本文。

该方法包括这样的步骤，其中包含对EBV抗原肽:MHC复合物有特异性的T细胞受体(TCR)的T细胞被呈递TCR对其有特异性的EBV抗原多肽:MHC复合体的APC所刺激。APC可被编码EBV抗原/肽的病毒感染或可包含/表达EBV抗原/肽，并在MHC分子的背景下呈递EBV抗原肽。刺激引起T细胞激活，并促进细胞分裂(增殖)，导致对EBV抗原有特异性的T细胞群体的生成和/或扩增。

本公开的方法通常包括通过使免疫细胞群体与对应于病毒抗原的肽或呈递对应于病毒抗原的肽的APC接触来刺激对病毒/病毒抗原有特异性的免疫细胞。这种方法步骤在本文中可以称为“刺激”或“刺激步骤”。这种方法步骤通常涉及在体外/离体培养中维持细胞，并且可以被称为“刺激培养”。

在一些实施方案中，所述方法包括一个或多个额外的刺激步骤。也就是说，在一些实施方案中，所述方法包括再刺激通过刺激步骤获得的细胞的一个或多个进一步步骤。这种进一步的刺激步骤在本文中可以称为“再刺激”或“再刺激步骤”。这种方法步骤通常涉及在体外/离体培养中维持细胞，并且可以被称为“再刺激培养”。

应理解，将PBMC(用于刺激)或通过本文所述的刺激步骤获得的细胞群体(用于再刺激)与对应于病毒抗原的肽“接触”通常涉及在包含肽的细胞培养基中体外/离体培养PBMC/细胞群体。类似地，应理解将PBMC/细胞群体与呈递对应于病毒抗原的肽的APC“接触”通常涉及在细胞培养基中体外/离体共培养APC和PBMC/细胞群体。

在一些实施方案中，所述方法包括使PBMC与对应于病毒抗原(例如EBV抗原)的肽接触。在这样的实施方案中，PBMC群体内的APC(例如树突状细胞、巨噬细胞和B细胞)内化(例如通过吞噬作用、胞饮作用)、加工并呈递MHC I类分子(交叉呈递)和/或MHC II类分子上的抗原，用于PBMC群体内的CD8+和/或CD4+T细胞的随后激活。

“对应于”参考抗原的肽包含或由参考抗原的氨基序列组成。例如，“对应于”EBV的EBNA1的肽包含或由在EBNA1的氨基酸序列内发现的氨基酸序列组成(即，是EBNA1的氨基序列的子序列)。本文所用的肽通常具有5-30个氨基酸的长度，例如5-25个氨基酸、10-20个氨基酸或12-18个氨基酸中之一。在一些实施方案中，肽具有5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸中之一的长度。在一些实施方案中，肽具有约15个氨基酸的长度。本文所用的“肽”可指包含不相同肽的群体。

在一些实施方案中，所述方法使用对应于多于一种抗原的肽。在这样的实施方案中，存在至少一种对应于每种抗原的肽。例如，在所述方法使用对应于EBNA1和LMP1的肽的情况下，肽包括对应于EBNA 1的至少一种肽和对应于LMP1的至少一个肽。

在一些实施方案中，所述方法使用对应于参考抗原的全部或部分的肽。对应于给定抗原的全部的肽覆盖抗原的氨基酸序列的全长。也就是说，肽一起包含给定抗原的氨基酸序列的所有氨基酸。对应于给定抗原的部分的肽覆盖抗原的部分氨基酸序列。在肽覆盖抗原的部分氨基酸序列的一些实施方案中，肽一起可以覆盖抗原的氨基酸序列的例如大于10％，例如大于15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％中之一。

在一些实施方案中，所述方法使用重叠肽。“重叠”肽有共同的氨基酸，更典型的是氨基酸序列。举例来说，第一肽由对应于EBNA1的氨基酸序列的位置1至15的氨基酸序列组成，而第二肽由对应于EBNA1的氨基酸序列的位置5至20的氨基酸序列组成。第一肽和第二肽是对应于EBNA1的重叠肽，重叠11个氨基酸。在一些实施方案中，重叠肽重叠1-20、5-20、8-15或10-12个氨基酸之一。在一些实施方案中，重叠肽重叠1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸之一。在一些实施方案中，重叠肽重叠11个氨基酸。

在一些实施方案中，所述方法使用具有长度为5-30个氨基酸、重叠1-20个氨基酸的对应于给定参考抗原的全部或部分的肽。

在一些实施方案中，所述方法使用具有长度为15个氨基酸、重叠11个氨基酸的对应于给定参考抗原的全部的肽。此类肽的混合物在本文中可被称为给定抗原的“pepmix肽库”或“pepmix”。例如，本文实施例1中使用的“EBNA1 pepmix”是指由158个15聚体肽组成的库，所述肽重叠11个氨基酸，跨越如UniProt:P03211-1，v1中所示的EBNA1的氨基酸序列的全长。

在根据本公开的各个方面的一些实施方案中，“对应于”给定病毒抗原的肽可以是该抗原的pepmix。

在特定实施方案中，所述方法使用对应于一种或多种EBV抗原的肽。

在特定实施方案中，所述方法使用用于一种或多种EBV抗原的pepmix。在一些实施方案中，一种或多种EBV抗原选自：EBV潜伏抗原，例如III型潜伏抗原(例如EBNA1、EBNA-LP、LMP1、LMP2A、LMP2B、BARF1、EBNA2、EBNA3A、EBNA3B或EBNA3C)，II型潜伏抗原(例如EBNA1、EBNA-LP、LMP1、LMP2A、LMP2B或BARF1)，或I型潜伏抗原(例如EBNA1或BARF1)、EBV裂解抗原，例如立即早期裂解抗原(例如BZLF1、BRLF1或BMRF1)、早期裂解抗原(例如BMLF1、BMRF1、BXLF1、BALF1、BALF2、BARF1、BGLF5、BHRF1、BNLF2A、BNLF2B、BHLF1、BLLF2、BKRF4、BMRF2、FU或EBNA1-FUK)和晚期裂解抗原(例如BALF4、BILF1、BILF2、BNFR1、BVRF2、BALF3、BALF5、BDLF3或gp350)。

在根据本公开的各个方面的一些实施方案中，一种或多种EBV抗原是或包含选自BZLF1、BRLF1、BMLF1、BMRF1、BXLF1、BALF1、BALF2、BGLF5、BHRF1、BNLF2A、BNLF2B、BHLF1、BLLF2、BKRF4、BMRF2、BALF4、BILF1、BILF2、BNFR1、BVRF2、BALF3、BALF5和BDLF3的EBV裂解抗原。在一些实施方案中，一种或多种EBV抗原是或包含选自BZLF1、BRLF1、BMLF1、BMRF1、BALF2、BNLF2A、BNLF2B、BMRF2和BDLF3的EBV裂解抗原。

在一些实施方案中，一种或多种EBV抗原是或包含选自EBNA1、EBNA-LP、EBNA2、EBNA3A、EBNA3B、EBNA3C、BARF1、LMP1、LMP2A和LMP2B的EBV潜伏抗原。在一些实施方案中，一种或多种EBV抗原是或包含选自EBNA1、LMP1、LMP2A和LMP2B的EBV潜伏抗原。

在一些实施方案中，一种或多种EBV抗原选自：EBNA1、LMP1、LMP2、BARF1、BZLF1、BRLF1、BMLF1、BMRF1、BMRF2、BALF2、BNLF2A和BNLF2B。

在一些实施方案中，所述方法使用对应于EBNA1、LMP1、LMP2、BARF1、BZLF1、BRLF1、BMLF1、BMRF1、BMRF2、BALF2、BNLF2A和BNLF2B的肽。在一些实施方案中，所述方法使用关于EBNA1、LMP1、LMP2、BARF1、BZLF1、BRLF1、BMLF1、BMRF1、BMRF2、BALF2、BNLF2A和BNLF2B的pepmix。

在一些实施方案中，所述方法包括使PBMC(例如清除了CD45RA阳性细胞的PBMC)与对应于EBNA1、LMP1、LMP2、BARF1、BZLF1、BRLF1、BMLF1、BMRF1、BMRF2、BALF2、BNLF2A和BNLF2B的肽接触。在一些实施方案中，所述方法包括使PBMC(例如清除了CD45RA阳性细胞的PBMC)与EBNA1、LMP1、LMP2、BARF1、BZLF1、BRLF1、BMLF1、BMRF1、BMRF2、BALF2、BNLF2A和BNLF2B的pepmix接触。

在一些实施方案中，所述方法中使用的PBMC被清除了CD45RA阳性细胞。也就是说，在一些实施方案中，PBMC是“清除了CD45RA阳性细胞的PBMC”，或者是“CD45RA阴性PBMC”。CD45RA阳性细胞的清除旨在减少所生成/扩增的细胞群体中NK细胞和/或调节性T细胞的数量。

在一些实施方案中，所述方法包括清除PBMC的CD45RA阳性细胞的步骤，例如在根据本公开的刺激步骤之前。在一些实施方案中，所述方法包括清除通过根据本公开的刺激步骤获得的细胞的CD45RA阳性细胞的步骤，例如在再刺激步骤之前。CD45RA阳性细胞的清除可以通过任何合适的方法实现，例如通过磁性激活细胞分选(MACS)，例如使用

在一些实施方案中，用于衍生该方法中所用的APC的细胞群体被清除了CD45RA阳性细胞。也就是说，在一些实施方案中，用于衍生APC的细胞群体是“清除了CD45RA阳性细胞的”或“CD45RA阴性”群体。例如，在使用ATC作为APC的实施方案中，ATC可以衍生自清除了CD45RA阳性细胞的PBMC群体，或者衍生自CD45RA阴性PBMC群体。

在一些实施方案中，所述方法包括使通过本文所述的刺激步骤获得的细胞群体与对应于病毒抗原的肽接触。在这样的实施方案中，细胞群体内的APC(例如树突状细胞、巨噬细胞和B细胞)内化(例如通过吞噬作用、胞饮作用)、加工并呈递MHC I类分子(交叉呈递)和/或MHC II类分子上的抗原，用于随后再刺激细胞群体内的CD8+和/或CD4+T细胞。

在一些实施方案中，所述方法包括使PBMC与呈递对应于病毒抗原的肽的APC接触。在一些实施方案中，所述方法包括使通过本文所述的刺激步骤获得的细胞群体与呈递对应于病毒抗原的肽的APC接触。

在一些实施方案中，所述方法包括使PBMC与EBV LCL接触。通过用EBV-LCL刺激PBMC产生EBV特异性免疫细胞描述于例如Straathof等人,Blood(2005)105(5):1898–1904中，其通过上述引用并入。

EBV-LCL可以通过用EBV感染PBMC，并在长期培养后收集永生化的EBV感染的细胞来制备，例如在Hui-Yuen等人,J Vis Exp(2011)57:3321以及Hussain和Mulherkar,Int JMol Cell Med(2012)1(2):75-87中所述(两者均通过引用将其整体并入本文)。可以通过将从健康供体的血液样品中分离的PBMC与自体γ辐照的EBV-LCL共培养来制备EBV特异性T细胞。

在细胞培养基中进行T细胞和APC在刺激和再刺激中的共培养。细胞培养基可以是任何细胞培养基，其中根据本公开的T细胞和APC可以维持在体外/离体培养物中。适用于淋巴细胞培养的培养基是本领域技术人员公知的，并且包括例如RPMI-1640培养基、AIM-V培养基、Iscoves培养基等。

在一些实施方案中，细胞培养基可以包括RPMI-1640培养基(例如高级RPMI-1640培养基)和/或Click's培养基(也称为Eagle's Ham's氨基酸(EHAA)培养基)。这些培养基的组成对于本领域技术人员来说是众所周知的。RPMI-1640培养基的配方描述于例如Moore等人,JAMA(1967)199:519-524中，Click's培养基的配方描述于Click等人,Cell Immunol(1972)3:264-276中。RPMI-1640培养基可从例如ThermoFisher Scientific获得，并且Click's培养基可由例如Sigma-Aldrich(目录号C5572)获得。高级RPMI-1640培养基可以从例如ThermoFisher Scientific(目录号12633012)获得。

在一些实施方案中，所述方法涉及在包含RPMI-1640培养基和Click's培养基的细胞培养基中，培养PBMC，所述PBMC已与对应于病毒抗原(例如EBV抗原)的肽接触，或在呈递对应于病毒抗原的肽的APC存在下进行培养。在一些实施方案中，所述方法涉及在包含RPMI-1640培养基和Click's培养基的细胞培养基中，培养通过本文所述的刺激步骤获得的细胞群体，所述细胞群体已与对应于病毒抗原的肽接触，或在呈递对应于病毒抗原的肽的APC存在下进行培养。

在一些实施方案中，细胞培养基包含(按体积计)25-65％RPMI-1640培养基和25-65％Click’s培养基。在一些实施方案中，细胞培养基包含30-60％RPMI-1640培养基和30-60％Click’s培养基。在一些实施方案中，细胞培养基包含35-55％RPMI-1640培养基和35-55％Click’s培养基。在一些实施方案中，细胞培养基包含40-50％RPMI-1640培养基和40-50％Click’s培养基。在一些实施方案中，细胞培养基包含45％RPMI-1640培养基和45％Click’s培养基。在特定实施方案中，细胞培养基包含47.5％RPMI-1640培养基和47.5％Click’s培养基。

在一些实施方案中，细胞培养基可包含一种或多种细胞培养基添加剂。细胞培养基添加剂是本领域技术人员公知的，并且包括抗生素(例如青霉素、链霉素)、L-谷氨酰胺、细胞因子/生长因子、富含生长因子的添加剂例如血清(例如人血清、胎牛血清(FBS)、牛血清白蛋白(BSA))等。

通过体外/离体培养产生、生成和/或扩增免疫细胞群体的方法通常包括在含有生长因子的细胞培养基存在下培养细胞。生长因子通常以富含生长因子的添加剂的形式(例如胎牛血清(FBS)、牛血清白蛋白(BSA)或人AB血清)提供给细胞培养基。

在本文的实施例中，发明人出乎意料地发现，通过其中在包含人血小板裂解物(HPL)的细胞培养基中培养细胞的方法产生的表达CAR的病毒特异性免疫细胞，与通过使用传统富含生长因子的添加剂FBS的等效方法产生的表达CAR的病毒特异性免疫细胞相比，显示出针对非病毒抗原更低的背景反应性。参见实施例5.2。

人血小板裂解物及其生产描述于例如Schallmoser和Strunk J Vis Exp.(2009)(32):1523和Schallmoser等人,Trends Biotechnol.(2020)38(1):13-23中，两者通过引用将其整体并入本文。

在一些实施方案中，细胞培养基(即根据本公开的刺激步骤和/或再刺激步骤的培养基)包含人血小板裂解物。

在一些实施方案中，细胞培养基包含(按体积计)1-20％(例如5％)的人血小板裂解物，例如2.5-20％、2.5-15％、2.5-10％或～5％的人血小板裂解产物中之一。

在根据本公开的各个方面的一些实施方案中，HPL可以从SextonBiotechnologies获得。在一些实施方案中，HPL可以选自nLeven PR(目录号PL-PR-100、PL-PR-500)、Stemulate(目录号PL-SP-100、PL-SP-500、PL-NH-100、PL-NH-500)和T-Liven PR(目录号TL-PR-150C)。在一些实施方案中，可以根据Schallmoser和Strunk J Vis Exp.(2009)(32):1523或Schallmoser等人,Trends Biotechnol.(2020)38(1):13-23中描述的方法产生HPL。

在细胞培养基包含HPL的优选实施方案中，细胞培养基不包含除HPL之外的添加的富含生长因子的添加剂。也就是说，细胞培养基优选地缺乏FBS、BSA等。

在一些实施方案中，细胞培养基包含0.5-5％GlutaMax，例如1％GlutaMax。在一些实施方案中，细胞培养基包含0.5-5％Pen/Strep，例如1％Pen/Step。

在特定实施方案中，细胞培养基包含L-谷氨酰胺。在特定实施方案中，细胞培养基包含0.5-10mM L-谷氨酰胺，例如1-5mM L-谷氨酰胺、例如2mM L-谷氨酰胺。

根据本公开的APC可以是专用的APC。专用的APC专门用于向T细胞呈递抗原；它们在细胞表面有效加工和呈递MHC-肽复合物，并表达高水平的共刺激分子。专用的APC包括树突状细胞(DC)、巨噬细胞和B细胞。非专用的APC是能够向T细胞呈递MHC-肽复合物、特别是向CD8+T细胞呈递MHC I类-肽复合物的其他细胞。

在一些实施方案中，APC是能够在由APC内化(例如通过内吞作用/吞噬作用吸收)的抗原的MHC I类抗原上交叉呈递的APC。内化的抗原在MHC I类上向CD8+T细胞的交叉呈递描述于例如Alloatti等人,Immunological Reviews(2016),272(1):97-108中，通过引用将其整体并入本文。能够交叉呈递的APC包括例如树突状细胞(DC)、巨噬细胞、B细胞和窦内皮细胞。

如本文所解释的，在一些实施方案中，用于刺激对病毒抗原有特异性的免疫细胞的APC包含在包含对病毒抗原有特异性的免疫细胞的细胞群体(例如PBMC)中，从所述细胞群体中扩增对病毒抗原有特异性的细胞群体。在这样的实施方案中，APC可以是例如树突状细胞、巨噬细胞、B细胞或细胞群体中能够向对病毒抗原有特异性的免疫细胞呈递抗原的任何其他细胞类型。

在一些实施方案中，所述方法使用经修饰以表达/包含病毒抗原/其肽的APC。在一些实施方案中，APC可由于已与肽接触并已将其内化而呈递对应于病毒抗原的肽。在一些实施方案中，APC可以已经用肽“脉冲”，这通常涉及在肽存在的情况下体外培养APC一段足以使APC内化肽的时间。

在一些实施方案中，APC可作为编码抗原的核酸在细胞内表达的结果而呈递对应于病毒抗原的肽。APC可以包含编码病毒抗原的核酸，这是由于它们已经被病毒感染(例如在EBV感染的B细胞的情况下，例如LCL)。APC可包含编码病毒抗原的核酸，这是由于编码抗原的核酸已被引入细胞，例如通过转染、转导、电穿孔等引入。编码病毒抗原(一种或多种)的核酸可在质粒/载体中提供。

在一些实施方案中，APC选自激活的T细胞(ATC)、树突状细胞、B细胞(包括例如LCL、HLA-阴性LCL)和人工抗原呈递细胞(aAPC)，例如Neal等人,J Immunol Res Ther(2017)2(1):68–79以及Turtle和Riddell Cancer J.(2010)16(4):374–381中描述的那些。

在一些实施方案中，APC相对于如下细胞群体是自体的，APC将与所述细胞群体共培养以生成/扩增包含对病毒抗原有特异性的免疫细胞的免疫细胞群体。也就是说，在一些实施方案中，APC来自与从其获得要与之共培养的细胞群体的受试者相同的受试者(或衍生自从其获得的细胞)。

多克隆激活的T细胞(ATC)作为APC的用途和制备ATC的方法描述于例如Ngo等人,JImmunother.(2014)37(4):193–203中，通过上述引用并入。简言之，可以通过在IL-2存在下，用激动剂抗CD3和激动剂抗CD28抗体刺激PBMC在体外非特异性激活T细胞来生成ATC。

树突状细胞可以根据本领域公知的方法产生，例如如Ngo等人,JImmunother.(2014)37(4):193–203中所述。树突状细胞可由单核细胞制备，所述单核细胞可通过CD14选择从PBMC获得。单核细胞可在细胞培养基中培养，使其分化为未成熟树突状细胞，所述细胞培养基可包含例如IL-4和GM-CSF。未成熟树突状细胞可在IL-6、IL-1β、TNFα、PGE2、GM-CSF和IL-4存在下培养而得到成熟。

LCL可以根据本领域公知的方法产生，例如如Hui-Yuen等人,J Vis Exp(2011)57:3321以及Hussain和Mulherkar,Int J Mol Cell Med(2012)1(2):75-87中所述，两者均通过引用将其整体并入本文。简言之，可以通过在环孢菌素A存在下，将PBMC用产生EBV的细胞(例如B95-8细胞)的浓缩细胞培养上清液孵育来产生LCL。

人工抗原呈递细胞(aAPC)包括例如K562cs细胞，其被工程化以表达共刺激分子CD80、CD86、CD83和4-1BBL(例如在Suhoski等人,Mol Ther.(2007)15(5):981-8中描述)。

在一些实施方案中，刺激步骤包括使PBMC与对应于病毒抗原的肽接触。在一些实施方案中，再刺激步骤包括使对病毒抗原有特异性的免疫细胞与呈递对应于病毒抗原的肽的APC接触。在一些实施方案中，再刺激步骤包括使对病毒抗原有特异性的免疫细胞与呈递对应于病毒抗原的肽的ATC接触。

根据本公开的各个方面和实施方案，用于产生、生成和/或扩增对病毒有特异性的免疫细胞群体的方法包括使用缺乏MHC I类和/或MHC II类的基因和/或蛋白质表达的淋巴母细胞系(LCL)的细胞的刺激和/或再刺激。此类细胞在本文中可称为“人类白细胞抗原(HLA)阴性淋巴母细胞”、“HLA阴性LCL”、“通用LCL”或“ULCL”，并描述于例如US2018/0250379 A1中，通过引用将其整体并入本文。

LCL及其制备在上文中进行了描述。HLA阴性LCL可以缺乏MHC I类多肽和MHC II类多肽的表面表达。“MHC I类多肽”是指MHC I类分子(即MHC I类α链多肽和B2M多肽的多肽复合物)的组成多肽。“MHC II类多肽”是指MHC II类分子(即MHC II类α链多肽和MHC II类β链多肽的多肽复合物)的组成多肽。表面表达是指在细胞表面(即在细胞膜中或在细胞膜上)可检测到的相关多肽/多肽复合物的表达。当多肽/多肽复合物在细胞表面表达时，可以使用对多肽/多肽复合物的细胞外区域有特异性的抗原结合分子来分析例如在完整细胞上的表面表达。

在一些实施方案中，HLA阴性LCL基本上不显示MHC I类和MHC II类的基因/蛋白质表达，例如通过用于检测基因和/或蛋白质表达的适当方法所测定的。在一些实施方案中，HLA阴性LCL基本上不显示MHC I类和MHC II类的表面表达，例如通过使用能够结合MHC I类的抗体和能够结合MHC-II类的抗体通过流式细胞术进行分析所测定的。在这样的测定法中，相关抗体对HLA阴性LCL的染色水平可能不会显著高于相同同种型的适当阴性对照抗体对细胞的染色水平。

HLA阴性LCL可以通过修饰(例如对核酸修饰，例如通过插入、取代或缺失一个或多个核苷酸)来减少/阻止MHC I类分子和MHC I类分子的一种或多种多肽(例如B2M多肽、MHCI类α链多肽(例如HLA-A、HLA-B或HLA-C)、MHC II类α链多肽(例如HLA-DPA1、HLA-DQA1、HLA-DQA2或HLA-DRA)和/或MHC II类β链多肽(例如HLA-DPB1、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4或HLA-DRB5))的基因和/或蛋白质表达。在一些实施方案中，HLA阴性LCL包含修饰以减少/防止MHC I类多肽(例如B2M)的基因和/或蛋白质表达，以及包含修饰以减少或防止一种或多种MHC II类多肽(例如HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP)的基因或蛋白质表达，所述减少/防止是与通过未修饰的LCL的基因和/或蛋白质表达相比。在一些实施方案中，HLA阴性LCL包含修饰以减少/防止B2M、HLA-DRA、HLA-DQA1、HLA-DQA2和HLA-DP的基因和/或蛋白质表达。在一些实施方案中，HLA阴性LCL可以通过靶向敲除编码B2M、HLA-DRA、HLA-DQA1、HLA-DQA2和HLA-DP的基因来获得，例如使用序列特异性核酸酶(SSN)进行靶向敲除。使用SSN的基因编辑综述在例如Eid和Mahfouz,Exp Mol Med.2016October；48(10):e265，通过引用将其整体并入本文。在一些实施方案中，使用包含编码相关多肽的crRNA靶向核酸的CRISPR/Cas-9系统来实现减少/防止MHC I类多肽(例如B2M)的基因和/或蛋白质表达的修饰和/或减少/防止一种或多种MHC II类多肽(例如HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP)的基因或蛋白质表达的修饰。在一些实施方案中，HLA阴性LCL是通过顺序敲除编码B2M、HLA-DRA、HLA-DQA1、HLA-DQA2和HLA-DP的基因而获得的。

在一些实施方案中，HLA阴性LCL另外包含对编码EBV复制/感染所需的一种或多种多肽的核酸的修饰。包含减少/防止EBV复制/感染的修饰的LCL在本文中可以被描述为EBV复制缺陷的。因此，在一些实施方案中，HLA阴性LCL是EBV复制缺陷的。在一些实施方案中，HLA阴性LCL包含对编码BFLF1、BFLF2、BFRF1、BFRF2和BFRF3中的一种或多种的核酸的修饰(例如通过插入、取代或缺失一个或多个核苷酸)。在一些实施方案中，HLA阴性LCL包含对编码BFLF1的核酸和/或编码BFRF1的核酸的修饰。在一些实施方案中，通过包括在抑制病毒复制的试剂(例如阿昔洛韦)存在下进行培养的方法获得HLA阴性LCL。在一些实施方案中，与现有技术中描述的PBMC与LCL共培养后PBMC群体内的B细胞增殖水平相比，EBV复制缺陷的HLA阴性LCL刺激来自在与PBMC共培养后PBMC群体内的B细胞的较少增殖。在一些实施方案中，EBV复制缺陷的HLA阴性LCL缺乏促进在与PBMC共培养中B细胞生长的能力。与缺乏减少/防止EBV复制所需的一种或多种多肽的基因和/或蛋白质表达的修饰的LCL相比，经修饰以减少/防止EBV复制所需的一种或多种多肽的基因或蛋白质表达的HLA阴性LCL可具有改善的安全性。

在一些实施方案中，根据本公开的方法在刺激和/或再刺激中使用HLA阴性LCL。

在一些实施方案中，HLA阴性LCL被用作向待在培养中扩增的细胞提供抗原刺激的细胞。

本发明人开发了一种具有简化的再刺激步骤的方法，使用HLA阴性LCL来提供抗原刺激和对CD30.CAR EBVST的共刺激。

HLA阴性LCL表达EBV抗原，并因此可用于向EBV特异性T细胞提供EBV抗原刺激。HLA阴性LCL也表达CD30，并因此可用于向表达CD30特异性CAR的免疫细胞(例如CD30.CAREBVST)提供抗原刺激。HLA阴性LCL也表达其他共刺激分子，通过这些分子，它们能够在体外/离体培养中为待扩增的细胞提供共刺激。

在本公开的各方面和实施方案中，所述方法包括在HLA阴性LCL的存在下，培养免疫细胞(例如，对病毒有特异性的免疫细胞，或者包含嵌合抗原受体(CAR)或编码CAR的核酸的对病毒有特异性的免疫细胞)。在一些实施方案中，HLA阴性LCL被用作提供抗原刺激(例如EBV和/或CD30刺激)的细胞。在一些实施方案中，HLA阴性LCL被用作提供共刺激的细胞。在一些实施方案中，HLA阴性LCL被用作提供抗原刺激和共刺激的细胞。

在一些实施方案中，在HLA阴性LCL用于刺激/再刺激之前，对其进行辐照(例如使用铯源)或用物质(例如丝裂霉素C)进行处理以防止其增殖。根据本方法对LCL的辐照通常为50至200戈瑞，例如约100戈瑞。

在特定实施方案中，本公开的方法包括在HLA阴性LCL存在下，培养对病毒有特异性的免疫细胞(例如EBV特异性免疫细胞，例如EBVST)。在特定实施方案中，本公开的方法包括再刺激步骤，所述再刺激步骤包括在HLA阴性LCL存在下，培养对病毒有特异性的免疫细胞。在一些实施方案中，HLA阴性LCL(例如经辐照的HLA阴性LCL)可以在与对病毒有特异性的免疫细胞的共培养物中使用，其中对病毒有特异性的免疫细胞与HLA阴性LCL的比率为1:1至1:10，例如1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、1:5、1:5.5、1:6、1:6.5、1:7、1:7.5或1:8之一。在一些实施方案中，HLA阴性LCL(例如，经辐照的HLA阴性LCL)可以在与对病毒有特异性的免疫细胞的共培养中使用，其中对病毒有特异性的免疫细胞与HLA阴性LCL的比率为1:2至1:5，例如1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5或1:5之一。在一些实施方案中，对病毒有特异性的免疫细胞与HLA阴性LCL的比率为～1:3。

在特定实施方案中，本公开的方法包括在HLA阴性LCL存在下，培养包含/表达本文所述CAR(或包含/表达编码这种CAR的核酸)的对病毒有特异性的免疫细胞(例如EBV特异性免疫细胞，例如EBVST)。在特定实施方案中，本公开的方法包括再刺激步骤，所述再刺激步骤包括在HLA阴性LCL存在下，培养包含/表达本文所述CAR(或包含/表达编码这种CAR的核酸)的对病毒有特异性的免疫细胞。在一些实施方案中，HLA阴性LCL(例如经辐照的HLA阴性LCL)可用于与包含/表达本文所述CAR(或包含/表达编码这种CAR的核酸)的对病毒有特异性的免疫细胞的共培养物中，其中包含/表示本文所述的CAR(或包括/表达编码这种CAR的核苷酸)的对病毒有特异性的免疫细胞与HLA阴性LCL的比率为1:1至1:10，例如1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、1:5、1:5.5、1:6、1:6.5、1:7、1:7.5或1:8之一。在一些实施方案中，HLA阴性LCL(例如经辐照的HLA阴性LCL)可用于与包含/表达本文所述CAR(或包含/表达编码这种CAR的核酸)的对病毒有特异性的免疫细胞的共培养物中，其中包含/表示本文所述的CAR(或包括/表达编码这种CAR的核苷酸)的对病毒有特异性的免疫细胞与HLA阴性LCL的比率为1:2至1:5，例如1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5或1:5之一。在一些实施方案中，包含/表达本文所述CAR(或包含/表达编码这种CAR的核酸)的对病毒有特异性的免疫细胞与HLA阴性LCL的比率为～1:3。

在一些实施方案中，根据本公开的使用HLA阴性LCL的刺激或再刺激步骤也不使用添加的对应于病毒的一种或多种抗原的全部或部分的外源肽。在此，“添加的外源”肽可以是故意添加到培养物中的肽(例如，使用重组蛋白技术生产)，而不是由培养物中的细胞生产/表达的肽。

在一些实施方案中，在不存在添加的与病毒的一种或多种抗原的全部或部分相对应的外源肽的情况下，进行含有对病毒有特异性的免疫细胞和HLA阴性LCL(例如经辐照的HLA阴性LCL)的根据本公开的刺激或再刺激培养。在一些实施方案中，在不存在添加的与病毒的一种或多种抗原的全部或部分相对应的外源肽的情况下，进行含有包含/表达本文所述的CAR(或包含/表达编码这种CAR的核酸)的对病毒有特异性的免疫细胞和HLA阴性LCL(例如经辐照的HLA阴性LCL)的根据本公开的刺激或再刺激培养。

在一些实施方案中，所述方法进一步使用用于增强刺激和/或再刺激中的共刺激的试剂。这样的试剂包括例如表达共刺激分子(例如CD80、CD86、CD83和/或4-1BBL)的细胞，例如LCL或K562cs细胞。在一些实施方案中，表达共刺激分子的细胞是HLA阴性LCL。

用于增强共刺激的试剂的其他实例包括例如对由T细胞表达的共刺激受体(例如4-1BB、CD28、OX40、ICOS等)有特异性的激动剂抗体，以及能够激活由T细胞表达的共刺激受体(例如CD80、CD86、CD83、4-1BBL、OX40L、ICOSL等)的共刺激分子。这些试剂可以例如固定在珠子上提供。

在一些实施方案中，再刺激步骤包括在HLA阴性LCL存在下，使对病毒抗原有特异性的免疫细胞与呈递对应于病毒抗原的肽的ATC接触。

免疫细胞群体与对应于病毒抗原的肽或呈递对应于病毒抗原的肽的APC的接触可以在一种或多种细胞因子存在下进行，以促进T细胞激活和增殖。在一些实施方案中，刺激在IL-7、IL-15、IL-6、IL-12、IL-4、IL-2和/或IL-21中的一种或多种存在下进行。应当理解，细胞因子是外源性地添加到培养物中的，并且是在由培养物中细胞产生的细胞因子之外。在一些实施方案中，添加的细胞因子是重组产生的细胞因子。

因此，在一些实施方案中，所述方法涉及在IL-7、IL-15、IL-6、IL-12、IL-4、IL-2和/或IL-21中的一种或多种存在下，培养PBMC，所述PBMC已与对应于病毒抗原的肽接触，或在呈递对应于病毒抗体的肽的APC存在下培养。

在一些实施方案中，培养是在IL-7、IL-15、IL-6、IL-12、IL-4、IL-2和/或IL-21的存在下进行的。在一些实施方案中，培养是在IL-7、IL-15、IL-6和/或IL-12的存在下进行的。在一些实施方案中，培养是在IL-7和/或IL-15的存在下进行的。

在一些实施方案中，培养物中IL-7的最终浓度是1-100ng/ml，例如2-50ng/ml、5-20ng/ml或7.5-15ng/ml中之一。在一些实施方案中，培养物中IL-7的最终浓度是约10ng/ml。

在一些实施方案中，培养物中IL-15的最终浓度是1-100ng/ml，例如2-50ng/ml、5-20ng/ml或7.5-15ng/ml中之一。在一些实施方案中，培养物中IL-15的最终浓度是约10ng/ml。在一些实施方案中，培养物中IL-15的最终浓度是10-1000ng/ml，例如20-500ng/ml、50-200ng/ml或75-150ng/ml中之一。在一些实施方案中，培养物中IL-15的最终浓度是约100ng/ml。

在一些实施方案中，培养物中IL-6的最终浓度是10-1000ng/ml，例如20-500ng/ml、50-200ng/ml或75-150ng/ml中之一。在一些实施方案中，培养物中IL-6的最终浓度是约100ng/ml。

在一些实施方案中，培养物中IL-12的最终浓度是1-100ng/ml，例如2-50ng/ml、5-20ng/ml或7.5-15ng/ml中之一。在一些实施方案中，培养物中IL-12的最终浓度是10ng/ml。

在一些实施方案中，IL-7的最终浓度是1-100ng/ml(例如2-50ng/ml、5-20ng/ml或7.5-15ng/ml中之一，例如10ng/ml)，并且IL-15的最终浓度是1-100ng/ml(例如2-50ng/ml、5-20ng/ml或7.5-15ng/ml中之一，例如约10ng/ml)。

在一些实施方案中，IL-7的最终浓度是1-100ng/ml(例如2-50ng/ml、5-20ng/ml或7.5-15ng/ml中之一，例如10ng/ml)，并且IL-15的最终浓度是10-1000ng/ml(例如20-500ng/ml、50-200ng/ml或75-150ng/ml中之一，例如约100ng/ml)。

在一些实施方案中，IL-7的最终浓度是1-100ng/ml(例如2-50ng/ml、5-20ng/ml或7.5-15ng/ml中之一，例如10ng/ml)，IL-6的最终浓度是10-1000ng/ml(例如20-500ng/ml、50-200ng/ml或75-150ng/ml中之一，例如约100ng/ml)，IL-12的最终浓度是1-100ng/ml(例如2-50ng/ml、5-20ng/ml或7.5-15ng/ml中之一，例如10ng/ml)，并且IL-15的最终浓度是1-100ng/ml(例如2-50ng/ml、5-20ng/ml或7.5-15ng/ml中之一，例如10ng/ml)。

在一些实施方案中，刺激培养物中IL-7的最终浓度是1-100ng/ml(例如2-50ng/ml、5-20ng/ml或7.5-15ng/ml中之一，例如10ng/ml)，并且刺激培养物中IL-15的最终浓度是10-1000ng/ml(例如20-500ng/ml、50-200ng/ml或75-150ng/ml中之一，例如约100ng/ml)。

在一些实施方案中，刺激培养物中IL-7的最终浓度是1-100ng/ml(例如2-50ng/ml、5-20ng/ml或7.5-15ng/ml中之一，例如10ng/ml)，刺激培养物中IL-6的最终浓度是10-1000ng/ml(例如20-500ng/ml、50-200ng/ml或75-150ng/ml中之一，例如约100ng/ml)，刺激培养物中IL-12的最终浓度是1-100ng/ml(例如2-50ng/ml、5-20ng/ml或7.5-15ng/ml中之一，例如10ng/ml)，并且刺激培养物中IL-15的最终浓度是1-100ng/ml(例如2-50pg/ml、5-20ng/ml或7.5-15g/ml中之一，例如10ng/ml)。

在一些实施方案中，再刺激培养物中IL-7的最终浓度是1-100ng/ml(例如2-50ng/ml、5-20ng/ml或7.5-15ng/ml中之一，例如10ng/ml)，并且再刺激培养物中IL-15的最终浓度是10-1000ng/ml(例如20-500ng/ml、50-200ng/ml或75-150ng/ml中之一，例如约100ng/ml)。

根据本公开的刺激和再刺激通常涉及T细胞和APC的共培养一段时间，所述一段时间足以使APC刺激T细胞，并使T细胞经历细胞分裂。

在一些实施方案中，所述方法涉及培养PBMC，所述PBMC已与对应于病毒抗原的肽接触，或在呈递对应于病毒抗原的肽的APC存在下，培养持续至少1小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、4天、5天、6天或至少7天之一的时间段。在一些实施方案中，培养进行24小时至20天，例如48小时至14天、3天至12天、4至11天、或6至10天或7至9天之一的时间段。

在一些实施方案中，所述方法涉及培养通过本文所述的刺激步骤获得的细胞群体，所述细胞群体已与对应于病毒抗原的肽接触，或在呈递对应于病毒抗原的肽的APC存在下，培养至少1小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、4天、5天、6天或至少7天之一的时间段。在一些实施方案中，培养进行24小时至20天，例如48小时至14天、3天至12天、4至11天、或6至10天或7至9天之一的时间段。

可以通过将培养中的细胞与培养它们的培养基分离或稀释培养物(例如通过添加细胞培养基)来结束刺激和再刺激。在一些实施方案中，所述方法包括在刺激或再刺激培养的结束时收集细胞的步骤。在一些实施方案中，可通过添加一定量的细胞培养基(和本文所述的任何其他添加剂)来建立再刺激步骤，所述的量适合于实现用于再刺激步骤的细胞培养基、经调节的培养基(以及任何添加剂)的所需百分比/浓度。

在给定刺激或再刺激步骤的培养期结束时，可以从细胞培养上清液中收集并分离细胞。可以通过离心收集细胞，并且可以将细胞培养上清液与细胞团块分离。然后可以将细胞团块重新悬浮在细胞培养基中，例如用于再刺激步骤。在一些实施方案中，细胞可以在收集后经历洗涤步骤。洗涤步骤可以包括将细胞团块重新悬浮在等渗缓冲液如磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，通过离心收集细胞，并丢弃上清液。

生成和/或扩增对病毒抗原有特异性的免疫细胞群体的方法通常涉及多于单个刺激步骤。可以执行的刺激步骤的数量没有上限。在一些实施方案中，所述方法包括多于2、3、4或5个刺激步骤。在一些实施方案中，所述方法包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个刺激步骤中之一。所述方法中的刺激步骤可以彼此不同。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括修饰对病毒抗原有特异性的免疫细胞以增加细胞中IL-7介导的信号传导。已证明IL-7介导的信号传导可增加肿瘤特异性T细胞的存活率和抗肿瘤活性——参见例如Shum等人,Cancer Discov.(2017)7(11):1238–1247和WO 2018/038945 A1。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括将根据WO 2018/038945A1(通过引用将其整体并入本文)中描述的实施方案的核酸引入PBMC或对病毒抗原有特异性的免疫细胞中。在一些实施方案中，所述方法包括将核酸引入PBMC或对病毒抗原有特异性的免疫细胞中，其中核酸编码用于增加细胞内STAT5介导的信号传导的多肽。

在一些实施方案中，核酸编码包含(i)促进多肽的同源二聚化的结构域和(ii)IL-7Rα的细胞内结构域的多肽。

在一些实施方案中，促进多肽的同源二聚化的结构域包含或由提供在多肽的单体之间形成二硫键的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，促进多肽的同源二聚化的结构域包含或由根据WO 2018/038945A1的SEQ ID NO:1至24之一的氨基酸序列组成(参见例如WO2018/039845A1的段落[0074]至[0076])。

IL-7Rα的细胞内结构域可以包含或由对应于UniProt:P16871-1,v1的位置265至459的氨基酸序列组成。

可以通过本领域公知的方法将核酸引入细胞中，例如转导、转染、电穿孔等。在一些实施方案中，经由使用包含核酸的病毒载体(例如逆转录病毒载体)的转导将核酸引入到细胞中。

在一些实施方案中，所述方法包括用包含编码多肽的核酸的病毒载体转导对EBV抗原有特异性的PBMC或免疫细胞，所述多肽包含：(i)促进多肽的同源二聚化的结构域和(ii)IL-7Rα的细胞内结构域。

本文描述的方法的各方面和实施方案包括修饰本文描述的免疫细胞(例如本文描述的病毒特异性免疫细胞)以表达/包含根据本公开的CAR。

本文描述的方法的各方面和实施方案包括修饰本文描述的免疫细胞(例如本文描述的病毒特异性免疫细胞)以表达/包含编码本公开的CAR的核酸。

这种方法通常包括将编码CAR的核酸引入免疫细胞。

根据本领域技术人员公知的方法，免疫细胞(例如病毒特异性免疫细胞)可以被修饰以包含/表达本文所述的CAR或编码CAR的核酸。所述方法通常包括核酸转移，用于转移的核酸的永久(稳定)或瞬时表达。

根据本公开，任何合适的基因工程化平台都可以用于修饰细胞。用于修饰细胞的合适方法包括使用基因工程化平台，例如γ-逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、DNA转染、基于转座子的基因递送和RNA转染，例如Maus等人,Annu Rev Immunol(2014)32:189-225中所述，通过引用将其整体并入本文。在一些实施方案中，修饰细胞以包含CAR或编码CAR的核酸包括用包含编码CAR核酸的病毒载体转导细胞。

在一些实施方案中，本公开的方法使用编码本文所述CAR的逆转录病毒。

方法还包括例如在Wang和Rivière Mol Ther Oncolytics.(2016)3:16015中描述的那些方法，通过引用将其整体并入本文。

所述方法通常包括将编码载体的核酸/多个核酸/包含这种核酸的多个载体引入细胞中。在一些实施方案中，所述方法还包括在适合由细胞表达核酸或载体的条件下培养细胞。在一些实施方案中，所述方法在体外进行。将核酸/载体引入细胞的合适方法包括转导、转染和电穿孔。

在一些实施方案中，将核酸/载体引入细胞包括转导，例如逆转录病毒转导。因此，在一些实施方案中，核酸包含在病毒载体中，或者载体是病毒载体。用病毒载体转导免疫细胞描述于例如Simmons和Alberola-Ila,Methods Mol Biol.(2016)1323:99-108中，通过引用将其整体并入本文。

在一些实施方案中，所述方法包括在含有包含核酸的病毒载体的细胞培养基存在下，离心期望将编码CAR的核酸引入其中的细胞(在本领域中称为“自旋感染”)。

在一些实施方案中，所述方法包括通过电穿孔引入根据本公开的核酸或载体，例如如Koh等人,Molecular Therapy–Nucleic Acids(2013)2,e114中所述，通过引用将其整体并入本文。

根据本公开的将编码CAR的核酸引入细胞的方法(例如在产生/生成包含CAR或编码CAR的核酸的对病毒有特异性的免疫细胞的背景下)可以使用促进将核酸引入细胞中的试剂。

在一些实施方案中，通过用包含编码CAR的核酸的病毒转导，将编码CAR的核酸引入细胞中。在一些实施方案中，包括用编码CAR的病毒(例如逆转录病毒)转导的本公开的方法使用增强转导效率的试剂。

用于增强用病毒载体转导细胞的效率的试剂是本领域已知的，并且包括例如溴化六二甲基三烯(聚布伦)，其为一种阳离子聚合物，其通过中和病毒粒子和在细胞表面上表达的唾液酸残基之间的电荷排斥来改善转导。通常用于增强转导的其他试剂包括例如SurENTRY(Qiagen)和ViraDuctin(Cell Biolabs)、LentiBOOST(Sirion Biotech)、Retronectin(Takara)和Vectofusin-1(Miltenyi Biotec，目录号170-076-165)。

在优选实施方案中，本公开的方法在用于将编码CAR的核酸引入细胞的方法中使用Vectofusin-1。Vectofusin-1及其用于增强病毒转导的用途描述于例如Fenard等人,MolTher Nucleic Acids(2013)2(5):e90中，通过引用将其整体并入本文。Vectofusin-1是一种短的、两亲性的、富含组氨酸的阳离子肽，具有SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列。Vectofusin-1被认为通过促进病毒和细胞膜之间的粘附和融合来促进病毒进入。Vectofusin-1的变体在本领域中是已知的，并且描述在例如Lointier等人,Biochimica etBiophysica Acta:Biomembranes(2020)1862(8):183212中(通过引用将其整体整体并入本文)，例如参见其表1。

如本文所用，Vectofusin-1的“变体”可包含或由与SEQ ID NO:54具有70％或更高(例如75％、80％、90％、95％或更高)氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。Vectofusin-1的变体可以通过在合适的转导测定法中(即相对于缺乏肽的对照条件)增加用病毒载体对细胞的转导的能力来表征。

本发明人有利地发现，通过在转导中使用Vectofusin-1，他们能够从转导方案中消除耗时且费力的离心步骤(参见例如实施例2)。还发现使用Vectofusin-1的转导需要使用更少的逆转录病毒来实现通过使用离心步骤的转导所实现的相同水平的转导。Vectofusin-1还提供了在组织培养瓶中高效转导细胞的能力，而不需要转移到组织培养板的孔中进行离心，从而减少了对细胞的处理量并显著简化了转导过程。

在一些实施方案中，根据本公开将编码CAR的核酸引入细胞中采用Vectofusin-1或其变体。在一些实施方案中，所述方法包括使Vectofusin-1或其变体与编码本公开的CAR的病毒载体(例如逆转录病毒)接触。在一些实施方案中，所述方法包括将Vectofusin-1或其变体与编码根据本公开的CAR的病毒载体混合，并将混合物孵育足够的时间，以便形成Vectofusin1/变体:病毒载体复合物。在一些实施方案中，所述方法包括使待转导的细胞(例如免疫细胞，例如对病毒有特异性的免疫细胞)与组合物接触，所述组合物包含：(a)编码根据本公开的CAR的病毒载体，和(b)Vectofusin-1或其变体。在一些实施方案中，所述方法包括将待转导的细胞(例如免疫细胞，例如对病毒有特异性的免疫细胞)与Vectofusin-1/变体:病毒载体复合物接触，并将混合物温育足够的时间使病毒载体进入细胞。

在一些实施方案中，所述方法还包括纯化/分离表达CAR和/或病毒特异性的免疫细胞，例如从其他细胞(例如对病毒没有特异性的细胞和/或不表达CAR的细胞)中纯化/分离。用于从异质性细胞群体中纯化/分离免疫细胞的方法在本领域是众所周知的，并且可以采用例如基于FACS或MACS的方法用于基于免疫细胞的标志物的表达来分选细胞群体。在一些实施方案中，所述方法用于纯化/分离特定类型的细胞，例如病毒特异性T细胞(例如病毒特异性CD8+T细胞、病毒特异性CTL)或表达CAR的病毒特异性T细胞(例如表达CAR的病毒特异性D8+T细胞，表达CAR的毒体特异性CTL)。

本公开还提供通过本文所述的方法获得或可获得的细胞及其群体。

本公开提供了产生、生成和/或扩增免疫细胞群体的方法，如下所述：

(A)(i)在包含HPL的细胞培养基中，在对应于EBV的一种或多种抗原的全部或部分的一种或多种肽存在下，培养PBMC；

(ii)经由使用Vectofusin-1的方法，用编码CD30特异性CAR的病毒载体转导在步骤(i)中获得的细胞；

(iii)在包含HPL的细胞培养基中，在HLA阴性LCL存在下，培养在步骤(ii)中获得的细胞。

在(A)的一些实施方案中，PBMC是清除了CD45RA阳性细胞的PBMC。

在(A)的一些实施方案中，包含HPL的细胞培养基包含1-20％v/v HPL。在(A)的一些实施方案中，包含HPL的细胞培养基包含～5％v/v HPL。

在(A)的一些实施方案中，一种或多种EBV抗原包括选自由以下组成的组的EBV抗原：EBNA1、LMP1、LMP2、BARF1、BZLF1、BRLF1、BMLF1、BMRF1、BMRF2、BALF2、BNLF2A和BNLF2B。在(A)的一些实施方案中，步骤(i)包括在关于EBNA1、LMP1、LMP2、BARF1、BZLF1、BRLF1、BMLF1、BMRF1、BMRF2、BALF2、BNLF2A和BNLF2B的pepmixes存在下培养PBMC。

在(A)的一些实施方案中，步骤(ii)包括使在步骤(i)获得的细胞与组合物接触，所述组合物包含：(A)编码CD30特异性CAR的病毒载体，和(b)Vectofusin-1。

在(A)的一些实施方案中，CD30特异性CAR包含：(i)特异性结合CD30的抗原结合结构域，(ii)跨膜结构域，和(iii)信号传导结构域，其中信号传导结构域包含：(a)衍生自CD28的细胞内结构域的氨基酸序列，和(b)包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的氨基酸序列。在(A)的一些实施方案中，CD30特异性CAR包含与SEQ ID NO:35或36具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在(A)的一些实施方案中，步骤(iii)包括将在步骤(ii)获得的细胞与HLA阴性LCL以步骤(ii)细胞与HLA阴性LCL的比率在1:1至1:10进行培养。在(A)的一些实施方案中，步骤(iii)包括将在步骤(ii)获得的细胞与HLA阴性LCL以步骤(ii)细胞与HLA阴性LCL的比率在1:2至1:5(例如～1:3)进行培养。

在(A)的一些实施方案中，步骤(i)的细胞培养基包含5至15ng/ml IL-7。在(A)的一些实施方案中，步骤(i)的细胞培养基包含～10ng/ml IL-7。在(A)的一些实施方案中，步骤(i)的细胞培养基包含5至15ng/ml IL-15。在(A)的一些实施方案中，步骤(i)的细胞培养基包含～10ng/ml IL-15。在(A)的一些实施方案中，步骤(i)的细胞培养基包含5至15ng/mlIL-7和5至15ng/ml IL-15。在(A)的一些实施方案中，步骤(i)的细胞培养基包含～10ng/mlIL-7和～10ng/ml IL-15。

在(A)的一些实施方案中，步骤(ii)的细胞培养基包含5至15ng/ml IL-7。在(A)的一些实施方案中，步骤(ii)的细胞培养基包含～10ng/ml IL-7。在(A)的一些实施方案中，步骤(ii)的细胞培养基包含5至15ng/ml IL-15。在(A)的一些实施方案中，步骤(ii)的细胞培养基包含～10ng/ml IL-15。在(A)的一些实施方案中，步骤(ii)的细胞培养基包含5至15ng/ml IL-7和5至15ng/ml IL-15。在(A)的一些实施方案中，步骤(ii)的细胞培养基包含～10ng/ml IL-7和～10ng/ml IL-15。

在(A)的一些实施方案中，步骤(iii)的细胞培养基包含5至15ng/ml IL-7。在(A)的一些实施方案中，步骤(iii)的细胞培养基包含～10ng/ml IL-7。在(A)的一些实施方案中，步骤(iii)的细胞培养基包含5至15ng/ml IL-15。在(A)的一些实施方案中，步骤(iii)的细胞培养基包含～10ng/ml IL-15。在(A)的一些实施方案中，步骤(iii)的细胞培养基包含5至15ng/ml IL-7和5至15ng/ml IL-15。在(A)的一些实施方案中，步骤(iii)的细胞培养基包含～10ng/ml IL-7和～10ng/ml IL-15。

在(A)的一些实施方案中，步骤(i)的细胞培养基包含33-55％高级RPMI和33-55％Click’s培养基。在(A)的一些实施方案中，步骤(i)的细胞培养基包含47.5％高级RPMI和47.5％Click’s培养基。

在(A)的一些实施方案中，步骤(ii)的细胞培养基包含33-55％高级RPMI和33-55％Click’s培养基。在(A)的一些实施方案中，步骤(ii)的细胞培养基包含47.5％高级RPMI和47.5％Click’s培养基。

在(A)的一些实施方案中，步骤(iii)的细胞培养基包含33-55％高级RPMI和33-55％Click’s培养基。在(A)的一些实施方案中，步骤(iii)的细胞培养基包含47.5％高级RPMI和47.5％Click’s培养基。

在(A)的一些实施方案中，步骤(i)的细胞培养基包含1-5mM L-谷氨酰胺。在(A)的一些实施方案中，步骤(i)的细胞培养基包含～2mM L-谷氨酰胺。

在(A)的一些实施方案中，步骤(ii)的细胞培养基包含1-5mM L-谷氨酰胺。在(A)的一些实施方案中，步骤(ii)的细胞培养基包含～2mM L-谷氨酰胺。

在(A)的一些实施方案中，步骤(iii)的细胞培养基包含1-5mM L-谷氨酰胺。在(A)的一些实施方案中，步骤(iii)的细胞培养基包含～2mM L-谷氨酰胺。

在(A)的一些实施方案中，步骤(i)的培养进行3至10天。在(A)的一些实施方案中，步骤(i)的培养进行4至8天。在(A)的一些实施方案中，步骤(i)的培养进行～5至6天。

在(A)的一些实施方案中，步骤(ii)的培养进行1至5天。在(A)的一些实施方案中，步骤(ii)的培养进行2至4天。在(A)的一些实施方案中，步骤(ii)的培养进行～3至4天。

在(A)的一些实施方案中，步骤(iii)的培养进行6至14天。在(A)的一些实施方案中，步骤(iii)的培养进行7至12天。在(A)的一些实施方案中，步骤(iii)的培养进行～8至10天。

病毒特异性免疫细胞

本公开涉及病毒特异性免疫细胞，特别是EB病毒(EBV)特异性免疫细胞。应当理解的是，在本文中以单数(即“一个/该细胞”)指代细胞的情况下，也可以考虑这种细胞的多个/群体。

本文所用的“病毒特异性免疫细胞”是指对病毒具有特异性的免疫细胞。病毒特异性免疫细胞表达/包含能够识别病毒抗原的肽(例如当由MHC分子呈递时)的受体(优选地T细胞受体)。病毒特异性免疫细胞可以表达/包含这样的受体，这是编码这种抗原受体的内源性核酸表达的结果，或者是已经被工程化以表达这种受体的结果。病毒特异性免疫细胞优选地表达/包含对病毒抗原的肽有特异性的TCR。

免疫细胞可以是造血来源的细胞，例如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、碱性粒细胞、树突状细胞、淋巴细胞或单核细胞。淋巴细胞可以是例如T细胞、B细胞、NK细胞、NKT细胞或先天性淋巴细胞(ILC)，或其前体。免疫细胞可以表达例如CD3多肽(例如CD3γCD3εCD3ζ或CD3δ)、TCR多肽(TCRα或TCRβ)、CD27、CD28、CD4或CD8。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞，例如CD3+T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD3+、CD4+T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD3+、CD8+T细胞。在一些实施方案中，T细胞是T辅助细胞(T

病毒特异性T细胞可响应T细胞对其有特异性的病毒抗原、或响应包含/表达病毒/抗原的细胞而显示T细胞的某些功能特性。在一些实施方案中，所述特性是与效应T细胞(例如细胞毒性T细胞)相关的功能特性。

在一些实施方案中，病毒特异性T细胞可显示以下特性中的一种或多种：对包含/表达T细胞对其有特异性的病毒/病毒抗原的细胞的细胞毒性；增殖、IFNγ表达、CD107a表达、IL-2表达、TNFα表达、穿孔素表达、颗粒酶表达、颗粒溶素表达和/或FAS配体(FASL)表达，这些响应于T细胞对其有特异性的病毒/病毒抗原的刺激，或响应于暴露于包含/表达T细胞对其有特异性的病毒/病毒抗原的细胞。

病毒特异性T细胞表达/包含TCR，该TCR能够识别当由适当的MHC分子呈递时T细胞对其有特异性的病毒抗原的肽。病毒特异性T细胞可以是CD4+T细胞和/或CD8+T细胞。

病毒特异性免疫细胞对其有特异性的病毒可以是任何病毒。例如，病毒可以是dsDNA病毒(例如腺病毒、疱疹病毒、痘病毒)、ssRNA病毒(例如细小病毒)、dsRNA病毒(例如呼肠孤病毒)、(+)ssRNA病毒(例如小核糖核酸病毒、披盖病毒(togavirus))、(-)ssRNA病毒(例如正粘病毒、弹状病毒)、ssRNA-RT病毒(例如逆转录病毒)或dsDNA-RT病毒(例如嗜肝病毒)。特别地，本公开涉及腺病毒科、疱疹病毒科、乳头瘤病毒科、多瘤病毒科，痘病毒科、嗜肝病毒科、细小病毒科、星形病毒科、杯状病毒科、小核糖核酸病毒科、冠状病毒科、黄病毒科、披盖病毒科、肝炎病毒科、逆转录病毒科、正粘病毒科、沙粒病毒科、布尼亚病毒科、丝状病毒科、副粘病毒科，弹状病毒科和呼肠孤病毒科的病毒。在一些实施方案中，病毒选自EB病毒、腺病毒、单纯疱疹1型病毒、单纯性疱疹2型病毒、水痘-带状疱疹病毒、人巨细胞病毒、人疱疹病毒8型、人乳头瘤病毒、BK病毒、JC病毒、天花、乙型肝炎病毒、细小病毒B19、人星形病毒、诺沃克病毒、柯萨奇病毒、甲型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、严重急性呼吸综合征病毒、丙型肝炎病毒、黄热病病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒、TBE病毒、风疹病毒、戊型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、流感病毒、拉沙病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、汉坦病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、小核糖核酸病毒、呼吸道合胞病毒，狂犬病病毒、丁型肝炎病毒、轮状病毒、环状病毒、科罗拉多壁虱热病毒(coltivirus)和版纳病毒。

在一些实施方案中，病毒选自EB病毒(EBV)、腺病毒、巨细胞病毒(CMV)、人乳头瘤病毒(HPV)、流感病毒、麻疹病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)或单纯疱疹病毒(HSV)。

在一些实施方案中，病毒特异性免疫细胞可以对病毒的肽/多肽具有特异性，病毒例如选自EB病毒(EBV)、腺病毒、巨细胞病毒(CMV)、人乳头瘤病毒(HPV)、流感病毒、麻疹病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)或单纯疱疹病毒(HSV)。

对病毒抗原具有特异性的T细胞在本文中可称为病毒特异性T细胞(VST)。对特定病毒的抗原具有特异性的T细胞可以被描述为对相关病毒具有特异性；例如，对EBV抗原具有特异性的T细胞可被称为EBV特异性T细胞或“EBVST”。

因此，在一些实施方案中，病毒特异性免疫细胞是EB病毒特异性T细胞(EBVST)、腺病毒特异性T细胞(AdVST)、巨细胞病毒特异性T细胞(CMVST)、人乳头瘤病毒(HPVST)、流感病毒特异性T细胞、麻疹病毒特异性T细胞、乙型肝炎病毒特异性T细胞(HBVST)、丙型肝炎病毒特异性T细胞(HCVST)、人类免疫缺陷病毒特异性T细胞(HIVST)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒特异性T细胞(LCMVST)或单纯疱疹病毒特异性T细胞(HSVST)。

在一些优选实施方案中，病毒特异性免疫细胞对EBV抗原的肽/多肽具有特异性。在优选实施方案中，病毒特异性免疫细胞是EB病毒特异性T细胞(EBVST)。

EBV病毒学描述于例如Stanfield和Luftiq,F1000Res.(2017)6:386和Odumade等人,Clin Microbiol Rev(2011)24(1):193-209中，这两篇文章通过引用整体并入本文。

EBV经由病毒蛋白BMFR2与β1整合素的结合以及病毒蛋白gH/gL与整合素avβ6和avβ8的结合感染上皮细胞。EBV通过病毒糖蛋白gp350与CD21和/或CD35的相互作用、然后病毒gp42与MHC II类的相互作用感染B细胞。这些相互作用触发病毒包膜与细胞膜的融合，使病毒进入细胞。一旦进入，病毒衣壳溶解，并且病毒基因组就会被运送到细胞核。

EBV有两种复制模式：潜伏和裂解。潜伏周期不会产生病毒粒子，可以在B细胞和上皮细胞中发生。EBV基因组环状DNA以附加体的形式存在于细胞核中，并由宿主细胞的DNA聚合酶复制。在潜伏过程中，只有一部分EBV基因被表达，这是被称为潜伏程序的三种不同模式之一，它们产生不同组的病毒蛋白和RNA。例如，在Amon和Farrell,Reviews in MedicalVirology(2004)15(3):149–56中描述了潜伏周期，该文献通过引用整体并入本文。

EBNA1蛋白和非编码RNA EBER在潜伏程序I-III的每一个中表达。潜伏程序II和III进一步涉及EBNALP、LMP1、LMP2A和LMP2B蛋白的表达，潜伏程序III进一步涉及EBNA2、EBNA3A、EBNA3B和EBNA3C的表达。

EBNA1是多功能的，并且通过病毒启动子的正调控和负调控在基因调节、染色体外复制和维持EBV附加体基因组中发挥作用(Duellman等人,JGen Virol.(2009)；90(Pt 9):2251–2259)。EBNA2参与潜伏病毒转录的调节，并有助于感染EBV的细胞的永生化(Kempkes和Ling,Curr Top Microbiol Immunol.(2015)391:35-59)。EBNA-LP是天然B细胞转化所必需的，并募集转录因子用于病毒复制(Szymula等人,PLoS Pathog.(2018)；14(2):e1006890)。EBNA3A、3B和3C与RBPJ相互作用以影响基因表达，有助于感染细胞的存活和生长(Wang等人,J Virol.(2016)90(6):2906–2919)。LMP1调节参与B细胞激活的基因的表达(Chang等人,J.Biomed.Sci.(2003)10(5):490–504)。LMP2A和LMP2B通过模拟激活的B细胞受体来抑制正常的B细胞信号转导(Portis和Longnecker,Oncogene(2004)23(53):8619–8628)。EBER与宿主细胞蛋白形成核糖核蛋白复合物，并被认为在细胞转化中发挥作用。

潜伏周期可以根据B细胞中的潜伏程序I至III中的任何一个进行，并且通常从III至II至I进行。在感染静息幼稚B细胞时，EBV进入潜伏程序III。潜伏期III基因的表达激活B细胞，B细胞成为增殖母细胞(proliferating blast)。随后EBV通常通过限制基因亚群的表达而进展到潜伏期II，这会导致母细胞向记忆B细胞的分化。基因表达的进一步限制导致EBV进入潜伏期I。EBNA1的表达允许EBV在记忆B细胞分裂时复制。在上皮细胞中，只出现潜伏期II。

在原发性感染中，EBV在口咽上皮细胞中复制，并在B淋巴细胞中建立潜伏期III、II和I感染。B淋巴细胞的EBV潜伏感染是病毒持续存在、随后在上皮细胞中复制以及将感染性病毒释放到唾液中所必需的。B淋巴细胞的EBV潜伏期III和II感染、口腔上皮细胞的潜伏期II感染以及NK-或T细胞的潜伏II感染可导致恶性肿瘤，其特征是EBV基因组存在和基因表达一致。

B细胞中的潜伏EBV可以被重新激活以转换为裂解复制。裂解周期导致感染性病毒粒子的产生，并且可以在B细胞和上皮细胞的位置发生，并且例如由Kenney在Arvin等人,Human Herpesviruses:Biology,Therapy and Immunoprophylaxis；CambridgeUniversity Press(2007)中第25章所综述，该文献通过引用整体并入本文。

裂解复制需要EBV基因组是线性的。潜伏EBV基因组是附加型的，并且因此必须对其进行线性化以进行裂解再激活。在B细胞中，裂解复制通常只有在从潜伏期重新激活后才会发生。

即时早期裂解基因产物如BZFL1和BRLF1作为反式激活剂，增强其自身的表达和后期裂解周期基因的表达。

早期裂解基因产物在病毒复制(例如EBV DNA聚合酶催化组分BALF5；DNA聚合酶加工因子BMRF1、DNA结合蛋白BALF2、解旋酶BBLF4、引发酶BSLF1和引发酶相关蛋白BBLF2/3)和脱氧核苷酸代谢(例如胸苷激酶BXLF1、dUTPase BORF2)中发挥作用。其他早期裂解基因产物作用于转录因子(例如BMRF1、BRRF1)，在RNA稳定性和加工中发挥作用(例如BMLF1)，或参与免疫逃避(例如BHRF1，其抑制细胞凋亡)。

晚期裂解基因产物传统上被归类为在病毒复制开始后表达的产物。它们通常编码病毒粒子的结构成分，例如核衣壳蛋白，以及介导EBV结合和融合的糖蛋白(例如gp350/220、gp85、gp42、gp25)。其他晚期裂解基因产物在免疫逃避中发挥作用；BCLF1编码IL-10的病毒同源物，并且BALF1编码与抗凋亡蛋白Bcl2同源的蛋白质。

本文所用的“EBV特异性免疫细胞”是指对EB病毒(EBV)具有特异性的免疫细胞。EBV特异性免疫细胞表达/包含能够识别EBV的抗原的肽(例如当由MHC分子呈递时)的受体(优选T细胞受体)。EBV特异性免疫细胞优选地表达/包含对由MHC I类呈递的EBV抗原的肽特异性的TCR。

在一些实施方案中，EBV特异性免疫细胞是T细胞，例如CD3+T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD3+、CD4+T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD3+、CD8+T细胞。在一些实施方案中，T细胞是T辅助细胞(T

EBV特异性T细胞可响应于T细胞对其具有特异性的EBV抗原、或响应于包含/表达EBV(例如感染EB病毒的细胞)或相关EBV抗原的细胞而显示T细胞的某些功能特性。在一些实施方案中，所述特性是与效应T细胞(例如细胞毒性T淋巴细胞(CTL))相关的功能特性。

在一些实施方案中，EBV特异性T细胞可显示以下特性中的一种或多种：对包含/表达T细胞对其有特异性的EBV/EBV抗原的细胞的细胞毒性；增殖、IFNγ表达、CD107a表达、IL-2表达、TNFα表达、穿孔素表达、颗粒酶表达、颗粒溶素表达和/或FAS配体(FASL)表达，这些响应于T细胞对其有特异性的EBV/EBV抗原的刺激，或响应于暴露于包含/表达T细胞对其有特异性的EBV/EBV抗原的细胞。

EBV特异性T细胞优选地表达/包含TCR，所述TCR能够识别当由适当的MHC分子呈递时T细胞对其有特异性的EBV抗原的肽。EBV特异性T细胞可以是CD4+T细胞和/或CD8+T细胞。

对EBV有特异性的免疫细胞可以对任何EBV抗原(例如本文所述的EBV抗原)具有特异性。对EBV有特异性的免疫细胞群体，或包含对EBV有特异性的多个免疫细胞的组合物，可包含对一种或多种EBV抗原有特异性的免疫细胞。

在一些实施方案中，EBV抗原是EBV潜伏抗原，例如III型潜伏期抗原(例如EBNA1、EBNA-LP、LMP1、LMP2A、LMP2B、BARF1、EBNA2、EBNA3A、EBNA3B或EBNA3C)、II型潜伏期抗原(例如EBNA1、EBNA-LP、LMP1、LMP2A、LMP2B或BARF1)、或I型潜伏期抗原(例如EBNA1或BARF1)。在一些实施方案中，EBV抗原是EBV裂解抗原，例如立即早期裂解抗原(例如BZLF1、BRLF1或BMRF1)、早期裂解抗原(例如BMLF1、BMRF1、BXLF1、BALF1、BALF2、BARF1、BGLF5、BHRF1、BNLF2A、BNLF2B、BHLF1、BLLF2、BKRF4、BMRF2、FU或EBNA1-FUK)或晚期裂解抗原(例如BALF4、BILF1、BILF2、BNFR1、BVRF2、BALF3、BALF5、BDLF3或gp350)。

嵌合抗原受体

本公开涉及包含/表达嵌合抗原受体(CAR)的病毒特异性免疫细胞。

嵌合抗原受体(CAR)是提供抗原结合和T细胞激活功能两者的重组受体分子。例如，CAR结构和工程化在例如Dotti等人,Immunol Rev(2014)257(1)中进行了综述，通过引用将其整体并入本文。

CAR包括经由跨膜结构域连接到信号传导结构域的抗原结合结构域。任选的铰链或间隔子结构域可以提供抗原结合结构域和跨膜结构域之间的分隔，并且可以充当柔性接头。当由细胞表达时，抗原结合结构域提供在细胞外空间中，而信号传导结构域是细胞内的。

抗原结合结构域介导与CAR对其有特异性的靶抗原的结合。CAR的抗原结合结构域可以基于抗体的抗原结合区，该抗原结合区对CAR所靶向的抗原具有特异性。例如，CAR的抗原结合结构域可以包含特异性结合靶抗原的抗体的互补决定区(CDR)的氨基酸序列。CAR的抗原结合结构域可以包含或由特异性结合靶抗原的抗体的轻链和重链可变区氨基酸序列组成。抗原结合结构域可以作为单链可变片段(scFv)提供，所述单链可变片段包含抗体的轻链和重链可变区氨基酸序列的序列。CAR的抗原结合结构域可以基于其他蛋白质:蛋白质相互作用靶向抗原，例如配体:受体结合；例如已经使用基于IL-13的抗原结合结构域开发了IL-13Rα2-靶向CAR(参见例如Kahlon等人2004Cancer Res 64(24):9160-9166)。

跨膜结构域提供在CAR的抗原结合结构域和信号传导结构域之间。跨膜结构域提供将CAR锚定到表达CAR的细胞的细胞膜上，其中抗原结合结构域在细胞外空间中，信号传导结构域在细胞内。CAR的跨膜结构域可以衍生自细胞膜结合蛋白(例如CD28、CD8等)的跨膜区序列。

在本说明书中，“衍生自”参考多肽/结构域/氨基酸序列的多肽、结构域和氨基酸序列与参考多肽/区域/氨基酸序列具有至少60％，优选地70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性之一。“衍生自”参考多肽/结构域/氨基酸序列的多肽、结构域和氨基酸序列优选地保留参考多肽/域/氨基酸的功能和/或结构特性。

举例来说，衍生自CD28的胞内结构域的氨基酸序列可包含与CD28的细胞内结构域(例如如SEQ ID NO:26所示)具有60％，优选地70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性之一的氨基酸序列。此外，衍生自CD28的细胞内结构域的氨基酸序列优选地保留SEQ ID NO:26的氨基酸序列的功能特性，即激活CD28介导的信号传导的能力。

给定多肽或其结构域的氨基酸序列可以从本领域技术人员已知的数据库中检索，或从从该数据库中检索的核酸序列中确定。这样的数据库包括GenBank、EMBL和UniProt。

信号传导结构域包括激活免疫细胞功能所需的氨基酸序列。CAR信号传导结构域可以包含CD3-ζ的细胞内结构域的氨基酸序列，其为表达CAR的细胞的磷酸化和激活提供基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。包含其他含ITAM蛋白质序列的信号传导结构域也已用于CAR中，例如包含FcγRI的含ITAM区域的结构域(Haynes等人,2001J Immunol166(1):182-187)。包含来源于CD3-ζ的细胞内结构域的信号传导结构域的CAR通常被称为第一代CAR。

CAR的信号传导结构域通常还包含共刺激性蛋白(例如CD28、4-1BB等)的信号传导结构域，用于提供增强免疫细胞激活和效应子功能所需的共刺激信号。具有包括额外共刺激性序列的信号传导结构域的CAR通常被称为第二代CAR。在某些情况下，CAR被工程化以提供不同细胞内信号传导通路的共刺激。例如，CD28共刺激优先地激活磷脂酰肌醇3-激酶(P13K)通路，而4-1BB共刺激通过TNF受体相关因子(TRAF)衔接子蛋白来触发信号传导。因此，CAR的信号传导结构域有时包含源自多于一个共刺激分子的信号传导结构域的共刺激性序列。包含具有多个共刺激性序列的信号传导结构域的CAR通常被称为第三代CAR。

任选的铰链或间隔子区可以提供抗原结合结构域和跨膜结构域之间的分隔，并且可以充当柔性接头。这样的区域可以是或包含允许结合部分在不同方向上定向的柔性结构域，其可以例如衍生自IgG的CH1-CH2铰链区。

通过工程化以表达对特定靶抗原有特异性的CAR，可以引导免疫细胞(通常是T细胞，但也包括其他免疫细胞，如NK细胞)来杀死表达靶抗原的细胞。表达CAR的T细胞(CAR-T细胞)与该T细胞对其有特异性的靶抗原的结合触发细胞内信号传导，从而激活T细胞。激活的CAR-T细胞被刺激以分裂并产生导致表达靶抗原的细胞被杀死的因子。

抗原结合结构域

“抗原结合结构域”是指能够结合靶抗原的结构域。例如，靶抗原可以是肽/多肽、糖蛋白、脂蛋白、聚糖、糖脂、脂质或其片段。根据本公开的抗原结合结构域可以来源于针对靶抗原的抗体/抗体片段(例如Fv、scFv、Fab、单链Fab(scFab)、单结构域抗体(例如VhH)等)或另一靶抗原结合分子(例如靶抗原结合肽或核酸适体、配体或其他分子)。

在一些实施方案中，抗原结合结构域包含能够特异性结合靶抗原的抗体的抗体重链可变区(VH)和抗体轻链可变区(VL)。在一些实施方案中，能够结合靶抗原的结构域包含或由抗原结合肽/多肽组成，例如肽适体、硫氧还蛋白、单体、anticalin、Kunitz结构域、avimer、knottin、fynomer、atrimer、DARPin、affbody、纳米抗体(即单结构域抗体(sdAb))、affilin、armadillo重复蛋白(ArmRP)，OBody或纤连蛋白——综述于例如Reverdatto等人,Curr Top Med Chem.2015；15(12):1082–1101中，其通过引用整体并入本文(另见例如Boersma等人,J Biol Chem(2011)286:41273-85和Emanuel等人,Mabs(2011)3:38-48)。

本公开的抗原结合结构域通常包含能够特异性结合靶抗原的抗体的VH和VL。抗体通常包含六个互补决定区CDR；三个在重链可变区(VH)中：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，以及三个在轻链可变区(VL)中：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。这六个CDR一起定义了抗体的互补位，其为抗体与靶抗原结合的部分。VH区和VL区包含每个CDR每一侧的框架区(FR)，其为CDR提供支架。从N末端到C末端，VH包含以下结构：N末端-[HC-FR1]-[HC-CDR1]-[HC-FR2]-[HC-CDR2]-[HC-FR3]-[HC-CDR3]-[HC-FR4]-C末端；并且VL包括以下结构：N末端-[LC-FR1]-[LC-CDR1]-[LC-FR2]-[LC-CDR2]-[LC-FR3]-[LC-CDR3]-[LC-FR4]-C末端。

VH和VL序列可以以任何合适的形式提供，只要抗原结合结构域可以连接到CAR的其他结构域。与本公开的抗原结合结构域相结合设想的形式包括在Carter,Nat.Rev.Immunol(2006),6:343-357中描述的那些，例如scFv、dsFV、(scFv)

在一些实施方案中，抗原结合结构域包含能够结合靶抗原的抗体/抗体片段的CDR。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含能够结合靶抗原的抗体/抗体片段的VH区和VL区。由抗体的VH和VL构成的部分在本文中也可称为可变片段(Fv)。VH和VL可以提供在相同的多肽链上，并通过接头序列连接；这样的部分被称为单链可变片段(scFv)。用于制备scFv的合适的接头序列是本领域技术人员已知的，并且可以包含丝氨酸和甘氨酸残基。

在一些实施方案中，抗原结合结构域包含或由能够结合靶抗原的Fv组成。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含或由能够结合靶抗原的scFv组成。

抗原结合结构域(以及由此的CAR)对其有特异性的靶抗原可以是任何靶抗原。在一些实施方案中，靶抗原是其表达/活性或其上调的表达/活性与疾病或病症(例如癌症、感染性疾病或自身免疫性疾病)正相关的抗原。靶抗原优选地在表达靶抗原的细胞的细胞表面表达。应该理解，CAR指导表达CAR的细胞针对表达靶抗原的细胞/组织的效应子活性，CAR包含针对所述靶抗原的特异性抗原结合结构域。

在一些实施方案中，靶抗原可以是癌症细胞抗原。癌症细胞抗原是由癌症细胞表达或过度表达的抗原。癌症细胞抗原可以是任何肽/多肽、糖蛋白、脂蛋白、聚糖、糖脂、脂质或其片段。癌症细胞抗原的表达可能与癌症相关。癌症细胞抗原可由癌症细胞异常表达(例如癌症细胞抗原可以异常定位表达)，或可由癌症细胞以异常结构表达。癌症细胞抗原可以能够引发免疫应答。在一些实施方案中，抗原在癌症细胞的细胞表面表达(即，癌症细胞抗原是癌症细胞表面抗原)。在一些实施方案中，被本文所述的抗原结合分子结合的抗原部分展示在癌症细胞的外表面上(即细胞外)。癌症细胞抗原可以是癌症相关抗原。在一些实施方案中，癌症细胞抗原是其表达与癌症症状的发展、进展或严重程度相关的抗原。癌症相关抗原可以与癌症的病因或病理有关，或可以因癌症而异常表达。在一些实施方案中，癌症细胞抗原是其表达被癌症细胞上调(例如在RNA和/或蛋白质水平上)的抗原，例如与可比较的非癌细胞(例如来源于相同组织/细胞类型的非癌细胞)的表达水平相比。在一些实施方案中，癌症相关抗原可优先地由癌性细胞表达，而不由可比较的非癌性细胞(例如来源于相同组织/细胞类型的非癌细胞核)表达。在一些实施方案中，癌症相关抗原可以是突变癌基因或突变肿瘤抑制基因的产物。在一些实施方案中，癌症相关抗原可以是过表达的细胞蛋白、由致癌病毒产生的癌症抗原、癌胚抗原或细胞表面糖脂或糖蛋白的产物。

Zarour HM,DeLeo A,Finn OJ,等人Categories of Tumor Antigens.在：KufeDW,Pollock RE,Weichselbaum RR,等人编.Holland-Frei Cancer Medicine.第6版.Hamilton(ON):BC Decker；2003综述了癌症细胞抗原。，癌症细胞抗原包括癌胚抗原：CEA，未成熟层粘连蛋白受体，TAG-72；肿瘤病毒抗原，如HPV E6和E7；过表达蛋白：BING-4、钙激活的氯通道2、细胞周期蛋白-B1、9D7、Ep-CAM、EphA3、HER2/neu、端粒酶、间皮素、SAP-1、生存素；癌症睾丸抗原：BAGE、CAGE、GAGE、MAGE、SAGE、XAGE、CT9、CT10、NY-ESO-1、PRAME、SSX-2；谱系限制性抗原：MART1、Gp100、酪氨酸酶、TRP-1/2、MC1R、前列腺特异性抗原；突变的抗原：β-连环蛋白、BRCA1/2、CDK4、CML66、纤连蛋白、MART-2、p53、Ras、TGF-βRII；翻译后改变的抗原：MUC1，独特型抗原：Ig，TCR。其他癌症细胞抗原包括热休克蛋白70(HSP70)、热休克蛋白90(HSP90)、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、波形蛋白、核仁素、胎儿腺泡胰腺蛋白(FAPP)、碱性磷酸酶胎盘样2(ALPPL-2)、siglec-5、应激诱导的磷蛋白1(STIP1)、蛋白酪氨酸激酶7(PTK7)和亲环蛋白B。

在一些实施方案中，癌症细胞抗原是在Zhao和Cao,Front Immunol.(2019)；10:2250中描述的癌症细胞抗原，该文献通过引用整体并入本。在一些实施方案中，癌症细胞抗原选自CD30、CD19、CD20、CD22、ROR1R、CD4、CD7、CD38、BCMA、间皮素、EGFR、GPC3、MUC1、HER2、GD2、CEA、EpCAM、LeY和PSCA。

在一些实施方案中，癌症细胞抗原是由血液系统恶性肿瘤的细胞表达的抗原。在一些实施方案中，癌症细胞抗原选自CD30、CD19、CD20、CD22、ROR1R、CD4、CD7、CD38和BCMA。

在一些实施方案中，癌症细胞抗原是由实体瘤的细胞表达的抗原。在一些实施方案中，癌症细胞抗原选自间皮素、EGFR、GPC3、MUC1、HER2、GD2、CEA、EpCAM、LeY和PSCA。

在一些实施方案中，癌症细胞抗原是CD19。CD19是B细胞的标志物，是治疗例如B细胞淋巴瘤、急性淋巴母细胞白血病(ALL)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)的有用靶标——参见例如Wang等人,Exp Hematol Oncol.(2012)1:36。

在一些实施方案中，抗原结合结构域(以及由此的CAR)是多特异性的。所谓“多特异性”是指抗原结合结构域显示出与多于一个靶标的特异性结合。在一些实施方案中，抗原结合域是双特异性抗原结合域。在一些实施方案中，抗原结合分子包含至少两个不同的抗原结合部分(即至少两个抗原结合部分，例如包含不相同的VH和VL)。多特异性抗原结合结构域的个体抗原结合部分可以例如经由接头序列连接。

在一些实施方案中，抗原结合结构域结合至少两种不相同的靶抗原，并因此是至少双特异性的。术语“双特异性”是指抗原结合结构域能够特异性结合至少两个不同的抗原决定簇。在一些实施方案中，多特异性抗原结合结构域/CAR的靶抗原中的至少一种是CD30。

每个靶抗原可以独立地是本文所述的靶抗原。在一些实施方案中，每个靶抗原独立地为本文所述的癌症细胞抗原。

应当理解，根据本公开的抗原结合结构域(例如，多特异性抗原结合结构区)包含能够结合抗原结合结构域对其有特异性的靶标的抗原结合部分。例如，能够结合CD30和除CD30以外的抗原的抗原结合结构域可以包含：(i)能够结合CD30的抗原结合部分，和(ii)能够结合除CD30之外的靶抗原的抗原接合部分。

在本公开的各方面和实施方案中，靶抗原是CD30。因此，在本公开的一些方面和实施方案中，抗原结合结构域是CD30结合结构域。

CD30(也称为TNFRSF8)是由UniProt:P28908标识的蛋白质。CD30是肿瘤坏死因子受体超家族的单通I型跨膜糖蛋白。CD30结构和功能描述于例如van der Weyden等人,Blood Cancer Journal(2017)7:e603以及Muta和Podack Immunol.Res.(2013)57(1-3):151-8中，两者通过引用整体并入本文。

由人TNFRSF8基因编码的mRNA的选择性剪接产生三种同种型：同种型1(“长”同种型；UniProt:P28908-1，v1；SEQ ID NO:1)、同种型2(“细胞质的”、“短”或“C30V”同种型，UniProt:P21808-2；SEQ ID NO:2)，其中对应于SEQ ID NO:1的位置1至463的氨基酸序列缺失，和同种型3(UniProt:P28908-3；SEQ ID NO:3)，其中对应于SEQ ID NO:1的位置1-111和位置446的氨基酸序列缺失。SEQ ID NO:1的N末端18个氨基酸形成信号肽(SEQ ID NO:4)，其后面是367个氨基酸的胞外结构域(SEQ ID NO：1的位置19至385，如SEQ ID NO:5所示)、21个氨基酸的跨膜结构域(SEQ ID NO:1的位置386至406，如SEQ ID NO:6所示)和189个氨基酸的细胞质结构域(SEQ ID NO:1的位置407至595，如SEQ ID NO:7所示)。

在本说明书中，“CD30”是指来自任何物种的CD30，包括来自任何物种的CD30同种型、片段、变体或同源物。如本文所用，参考蛋白质的“片段”、“变体”或“同源物”可任选地被表征为与参考蛋白质(例如参考同种型)的氨基酸序列具有至少60％，优选地70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性之一。在一些实施方案中，参考蛋白质的片段、变体、同种型和同源物可以通过执行由参考蛋白质执行的功能的能力来表征。

在一些实施方案中，CD30来自哺乳动物(例如灵长类动物(恒河猴、食蟹猴或人)和/或啮齿类动物(例如大鼠或鼠)CD30)。在优选的实施方案中，CD30是人CD30。同种型、片段、变体或同源物可任选地被表征为与来自给定物种(例如人类)的未成熟或成熟CD30同种型的氨基酸序列具有至少70％，优选地80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性之一。CD30的片段可以具有10、20、30、40、50、100、200、300、400、500或590个氨基酸之一的最小长度，并且可以具有10、20、30、40、50、10、200、300、400、500和595个氨基酸之一的最大长度。

在一些实施方案中，CD30包含或由与SEQ ID NO:1、2或3具有至少70％，优选地80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性之一的氨基酸序列组成。

在一些实施方案中，CD30包含或由与SEQ ID NO:5具有至少70％，优选地80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性之一的氨基酸序列组成。

在一些实施方案中，CD30的片段包含或由与SEQ ID NO:5或19具有至少70％，优选地80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性之一的氨基酸序列组成。

本公开的CAR的CD30结合结构域优选地显示与CD30或其片段的特异性结合。本公开的CAR的CD30结合结构域优选地显示与CD30的细胞外结构域的特异性结合。CD30结合结构域可以来源于抗CD30抗体或其他CD30结合剂，例如CD30结合肽或CD30结合性小分子。

CD30结合结构域可以来源于抗CD30抗体的抗原结合部分。

抗CD30抗体包括HRS3和HRS4(描述在例如在Hombach等人,Scand J Immunol(1998)48(5):497-501中)，HRS3衍生物描述在Schlapschy等人,Protein Engineering,Design and Selection(2004)17(12):847–860中，BerH2(MBL International Cat#K0145-3，RRID:AB_590975)，SGN-30(也称为cAC10，描述在例如Forero-Torres等人,Br JHaematol(2009)146:171–9中)，MDX-060(描述例如在Ansell等人,J Clin Oncol(2007)25:2764–9中；也称为5F11、伊妥木单抗)和MDX-1401(描述在Cardarelli等人,Clin CancerRes.(2009)15(10):3376-83中)，以及抗CD3抗体描述在WO 2020/068764 A1、WO 2003/059282A2、WO 2006/089232A2、WO 2007/084672A2、WO 2007/044616A2、WO 2005/001038A2、US2007/166309 A1、US2007/258987A1、WO 2004/010957 A2和US2005/009769 A1中。

在一些实施方案中，根据本公开的CD30结合结构域包含抗CD30抗体的CDR。在一些实施方案中，根据本公开的CD30结合结构域包含抗CD30抗体的VH和VL区。在一些实施方案中，根据本公开的CD30结合结构域包含scFv，所述scFv包含抗CD30抗体的VH和VL区。

有几种不同的惯例用于定义抗体CDR和FR，例如在Kabat等人,Sequences ofProteins of Immunological Interest,第5版.Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD(1991),Chothia等人,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)中描述的那些，以及VBASE2，例如在Retter等人,Nucl.Acids Res.(2005)33(suppl1):D671-D674中描述。本文所述抗体的VH区和VL区的CDR和FR根据VBASE2定义。

在一些实施方案中，本公开的抗原结合结构域包含：

包含以下CDR的VH：

具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HC-CDR1，

具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HC-CDR2，

具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HC-CDR3，

或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3的一个或多个中的一个、两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代；

和

包含以下CDR的VL：

具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的LC-CDR1，

具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的LC-CDR2，

具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的LC-CDR3，

或其变体，其中LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3的一个或多个中的一个、两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。

在一些实施方案中，抗原结合结构域包含：

VH，其包含或由与SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少80％序列同一性(例如至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的氨基酸序列组成；

和

VL，其包含或由与SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少80％序列同一性(例如至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的氨基酸序列组成。

在一些实施方案中，CD30结合结构域可包含或由单链可变片段(scFv)组成，所述单链可变片段包含本文所述的VH序列和VL序列。VH序列和VL序列可以共价连接。在一些实施方案中，VH和VL序列通过柔性接头序列连接，例如本文所述的柔性接头序列。柔性接头序列可以连接到VH序列和VL序列的末端，从而连接VH和VL序列。在一些实施方案中，VH和VL经由包含或由SEQ ID NO:16或17的氨基酸序列组成的接头序列连接。

在一些实施方案中，CD30结合结构域包含或由与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列组成。

在一些实施方案中，CD30结合结构域能够结合CD30，例如在CD30的细胞外结构域中。在一些实施方案中，CD30结合结构域能够结合由抗体HRS3结合的CD30的表位，例如在根据SEQ ID NO:1编号的人CD30的氨基酸位置185-335的区域内，如SEQ ID NO:19所示(Schlapschy等人,Protein Engineering,Design and Selection(2004)17(12):847–860，通过引用将其整体并入本文)。

在一些实施方案中，靶抗原是CD19。因此，在本公开的一些方面和实施方案中，抗原结合结构域是CD19结合结构域。

CD19是由UniProt P15391-1，v6标识的蛋白质。在本说明书中，“CD19”是指来自任何物种的CD19，并包括来自任何物种的CD19同种型(例如P15391-2)、片段、变体(包括突变体)或同源物。

CD19结合结构域可以来源于抗CD19抗体的抗原结合部分。抗CD19抗体包括FMC63，描述在例如Zola等人,Immunology and Cell Biology(1991)69:411–422中。

在一些实施方案中，根据本公开的CD19结合结构域包含抗CD19抗体的CDR。在一些实施方案中，根据本公开的CD19结合结构域包含抗CD19抗体的VH和VL区。在一些实施方案中，根据本公开的CD19结合结构域包含scFv，所述scFv包含抗CD19抗体的VH和VL区。

在一些实施方案中，本公开的抗原结合结构域包含：

包含以下CDR的VH：

具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HC-CDR1，

具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HC-CDR2，

具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HC-CDR3，

或其变体，其中HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3的一个或多个中的一个、两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代；

和

包含以下CDR的VL：

具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的LC-CDR1，

具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的LC-CDR2，

具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的LC-CDR3，

或其变体，其中LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3的一个或多个中的一个、两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。

在一些实施方案中，抗原结合结构域包含：

VH，其包含或由与SEQ ID NO:43的氨基酸序列具有至少80％序列同一性(例如至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的氨基酸序列组成；

和

VL，其包含或由与SEQ ID NO:44的氨基酸序列具有至少80％序列同一性(例如至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的氨基酸序列组成。

在一些实施方案中，CD19结合结构域可包含或由单链可变片段(scFv)组成，所述单链可变片段包含本文所述的VH序列和VL序列。VH序列和VL序列可以共价连接。在一些实施方案中，VH和VL序列通过柔性接头序列连接，例如本文所述的柔性接头序列。柔性接头序列可以连接到VH序列和VL序列的末端，从而连接VH和VL序列。在一些实施方案中，VH和VL经由包含或由SEQ ID NO:16或45的氨基酸序列组成的接头序列连接。

在一些实施方案中，CD19结合结构域包含或由与SEQ ID NO:46的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列组成。

在一些实施方案中，CD19结合结构域能够结合CD19，例如在CD19的细胞外结构域中。在一些实施方案中，CD19结合结构域能够结合由抗体FMC63结合的CD19的表位。

跨膜结构域

本公开的CAR包含跨膜结构域。跨膜结构域是指在生物膜(例如细胞膜)中热力学稳定的氨基酸序列形成的任何三维结构。结合本公开，跨膜结构域可以是跨越表达CAR的细胞的细胞膜的氨基酸序列。

跨膜结构域可以包含或由形成疏水性α-螺旋或β-桶的氨基酸序列组成。本公开的CAR的跨膜结构域的氨基酸序列可以是或可以来源于包含跨膜结构域的蛋白质的跨膜结构域的氨基酸序列。跨膜结构域被记录在数据库中，例如GenBank、UniProt、Swiss-Prot、TrEMBL、Protein Information Resource、Protein Data Bank、Ensembl和InterPro，和/或可以例如使用氨基酸序列分析工具如TMHMM来鉴别/预测(Krogh等人,2001J Mol Biol305:567-580)。

在一些实施方案中，本公开的CAR的跨膜结构域的氨基酸序列可以是或可以来源于在细胞表面表达的蛋白质的跨膜结构域的氨基酸序列。在一些实施方案中，在细胞表面表达的蛋白质是受体或配体，例如免疫受体或配体。在一些实施方案中，跨膜结构域的氨基酸序列可以是或来源于ICOS、ICOSL、CD86、CTLA-4、CD28、CD80、MHC I类α、MHC II类α、MHCII类β、CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD3-ζ、TCRαTCRβ、CD4、CD8α、CD8β、CD40、CD40L、PD-1、PD-L1、PD-L2、4-1BB、4-1BBL、OX40、OX40L、GITR、GITRL、TIM-3、半乳糖凝集素9、LAG3、CD27、CD70、LIGHT、HVEM、TIM-4、TIM-1、ICAM1、LFA-1、LFA-3、CD2、BTLA、CD160、LILRB4、LILRB2、VTCN1、CD2，CD48、2B4、SLAM、CD30、CD30L、DR3、TL1A、CD226、CD155、CD112和CD276之一的跨膜结构域的氨基酸序列。在一些实施方案中，跨膜是或来源于CD28、CD3-ζ、CD8α、CD8β或CD4的跨膜结构域的氨基酸序列。在一些实施方案中，跨膜是或来源于CD28的跨膜结构域的氨基酸序列。

在一些实施方案中，跨膜结构域包含或由与SEQ ID NO:20或48的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列组成。

在一些实施方案中，跨膜结构域包含或由与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列组成。

在一些实施方案中，跨膜结构域包含或由与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列组成。

信号传导结构域

本公开的嵌合抗原受体包含信号传导结构域。信号传导结构域提供用于在表达CAR的细胞中启动细胞内信号传导的序列。

含有ITAM的序列

信号传导结构域包含含有ITAM的序列。含有ITAM的序列包含一个或多个基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。ITAM包含氨基酸序列YXXL/I(SEQ ID NO:23)，其中“X”表示任何氨基酸。在含有ITAM的蛋白质中，根据SEQ ID NO:23的序列通常由6至8个氨基酸分隔；YXXL/I(X)

在一些实施方案中，信号传导结构域包含根据SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:44的氨基酸序列的一个或多个拷贝。在一些实施方案中，信号传导结构域包含根据SEQ ID NO:23的氨基酸序列的至少1、2、3、4、5或6个拷贝。在一些实施方案中，信号传导结构域包含根据SEQ ID NO:24的氨基酸序列的至少1、2或3个拷贝。

在一些实施方案中，信号传导结构域包含氨基酸序列，所述氨基酸序列是或来源于具有含有ITAM氨基酸序列的蛋白质的含有ITAM序列的氨基酸序列。在一些实施方案中，信号传导结构域包含氨基酸序列，所述氨基酸序列是或来源于CD3-ζ、FcγRI、CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD79α、CD79β、FcγRIIA、FcγRIIC、FcγRIIIA、FcγRIV或DAP12之一的细胞内结构域的氨基酸序列。在一些实施方案中，信号传导结构域包含氨基酸序列，所述氨基酸序列是或来源于CD3-ζ的细胞内结构域。

在一些实施方案中，信号传导结构域包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含或由与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列组成。

共刺激性序列

信号传导结构域可以另外地包含一个或多个共刺激性序列。共刺激性序列是提供对表达本公开的CAR的细胞的共刺激的氨基酸序列。共刺激在与靶抗原结合时促进表达CAR的细胞的增殖和存活，并且还可以促进表达CAR的细胞的细胞因子产生、分化、细胞毒性功能和记忆形成。Chen和Flies,(2013)Nat Rev Immunol 13(4):227-242综述了T细胞共刺激的分子机制。

共刺激性序列可以是或来源于共刺激性蛋白的氨基酸序列。在一些实施方案中，共刺激性序列是氨基酸序列，所述氨基酸序列是或来源于共刺激性蛋白的细胞内结构域的氨基酸序列。

在CAR与靶抗原结合时，共刺激性序列向表达CAR的细胞提供共刺激，所述共刺激将由共同刺激序列所来源的共刺激性蛋白在被其同源配体连接所连接时提供。例如，在CAR包含信号传导结构域的情况下，所述信号传导结构域包含来源于CD28的共刺激性序列，与靶抗原的结合触发表达CAR的细胞中的信号传导，所述信号传导将由CD80和/或CD86与CD28的结合所触发。因此，共刺激性序列能够递送共刺激性序列所来源的共刺激性蛋白的共刺激信号。

在一些实施方案中，共刺激性蛋白可以是B7-CD28超家族的成员(例如CD28、ICOS)，或TNF受体超家族的一员(例如4-1BB、OX40、CD27、DR3、GITR、CD30、HVEM)。在一些实施方案中，共刺激性序列是或来源于CD28、4-1BB、ICOS、CD27、OX40、HVEM、CD2、SLAM、TIM-1、CD30、GITR、DR3、CD226和LIGHT之一的细胞内结构域。在一些实施方案中，共刺激性序列是或来源于CD28的细胞内结构域。

在一些实施方案中，信号传导结构域包含多于一个的非重叠共刺激性序列。在一些实施方案中，信号传导结构域包含1、2、3、4、5或6个共刺激性序列。可以串联提供多个共刺激性序列。

可以例如通过分析由共刺激性蛋白所介导信号传导的相关性(例如，其表达/活性由于共刺激性蛋白质所介导的信号传导而被上调或下调的因子的表达/活性)来研究给定的氨基酸序列是否能够启动由给定的共刺激性蛋白介导的信号传导。

共刺激性蛋白通过多种转导途径来上调促进细胞生长、效应子功能和存活的基因的表达。例如，CD28和ICOS通过磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)和AKT发出信号，以通过NF-κB、mTOR、NFAT和AP1/2来上调促进细胞生长、效应子功能和存活的基因的表达。CD28还经由CDC42/RAC1激活AP1/2和经由RAS激活ERK1/2，ICOS激活C-MAF。4-1BB、OX40和CD27募集TNF受体相关因子(TRAF)并通过MAPK途径以及通过PI3K发出信号。

在一些实施方案中，信号传导结构域包含共刺激性序列，所述共刺激性序列是或来源于CD28。

在一些实施方案中，信号传导结构域包含共刺激性序列，所述共刺激性序列包含或由与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列组成。

Kofler等人Mol.Ther.(2011)19:760-767描述了一种变体CD28细胞内结构域，其中lck激酶结合位点发生突变，以减少CAR连接时对IL-2产生的诱导，从而最大限度地减少调节性T细胞介导的对CAR-T细胞活性的抑制。变体CD28胞内结构域的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:27中。

在一些实施方案中，信号传导结构域包含共刺激性序列，所述共刺激性序列包含或由与SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列组成。

在一些实施方案中，信号传导结构域包含或由与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列组成。

在一些实施方案中，信号传导结构域包含共刺激性序列，所述共刺激性序列是或来源于4-1BB。

在一些实施方案中，信号传导结构域包含共刺激性序列，所述共刺激性序列包含或由与SEQ ID NO:49的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列组成。

在一些实施方案中，信号传导结构域包含或由与SEQ ID NO:50的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列组成。

铰链区

CAR可以进一步包括铰链区。铰链区可以提供在抗原结合结构域和跨膜结构域之间。铰链区也可以被称为间隔子区。铰链区是提供CAR的抗原结合和跨膜结构域的柔性连接的氨基酸序列。

铰链区的存在、不存在和长度已被证明影响CAR功能(综述在例如Dotti等人,Immunol Rev(2014)257(1)中，如上)。

在一些实施方案中，CAR包含铰链区，所述铰链区包含或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列是或来源于人IgG1的CH1-CH2铰链区、来源于CD8α的铰链区，例如如WO 2012/031744 A1中所述，或来源于CD28的铰链区，例如如WO2011/041093A1中所述。在一些实施方案中，CAR包含来源于人IgG1的CH1-CH2铰链区的铰链区。

在一些实施方案中，铰链区包含或由与SEQ ID NO:29或30的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列组成。

在一些实施方案中，CAR包含来源于人IgG4的CH1-CH2铰链区的铰链区。

在一些实施方案中，铰链区包含或由与SEQ ID NO:47的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列组成。

在一些实施方案中，CAR包含铰链区，所述铰链区包含或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列是或来源于人IgG1的CH2-CH3区(即Fc区)。

在一些实施方案中，铰链区包含或由与SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列组成。

Hombach等人,Gene Therapy(2010)17:1206-1213描述了变体CH2-CH3区域，用于FcγR-表达细胞(例如单核细胞和NK细胞)的减少激活。变体CH2-CH3区的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:32中。

在一些实施方案中，铰链区包含或由与SEQ ID NO:32的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列组成。

在一些实施方案中，铰链区包含或由以下氨基酸序列组成：是或来源于人IgG1的CH1-CH2铰链区的氨基酸序列，和是或来源于自人IgG1的CH2-CH3区(即Fc区)的氨基酸序列。

在一些实施方案中，铰链区包含或由与SEQ ID NO:33的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列组成。

附加序列

信号肽

CAR可以另外包含信号肽(也称为前导序列或信号序列)。信号肽通常由5-30个疏水性氨基酸的序列组成，这些氨基酸形成单个α螺旋。分泌的蛋白质和在细胞表面表达的蛋白质通常包含信号肽。信号肽对于许多蛋白质是已知的，并且被记录在诸如GenBank、UniProt和Ensembl的数据库中，和/或可以例如使用氨基酸序列分析工具例如SignalP(Petersen等人,2011Nature Methods 8:785-786)或Signal-BLAST(Frank和Sippl,2008Bioinformatics 24:2172-2176)来鉴定/预测。

信号肽可以存在于CAR的N末端，并且可以存在于新合成的CAR中。信号肽提供了CAR到细胞表面的有效运输。信号肽通过切割被去除，并因此不包含在由细胞表面表达的成熟CAR中。

在一些实施方案中，信号肽包含或由与SEQ ID NO:34的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，信号肽包含或由与SEQ IDNO:51的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列组成。

接头序列和其他功能序列

在一些实施方案中，CAR包含不同结构域(即抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域、信号传导结构域)之间的一个或多个接头序列。在一些实施方案中，CAR包含结构域的子序列之间(例如抗原结合结构域的VH和VL之间)的一个或多个接头序列。

接头序列是本领域技术人员已知的，并且描述在例如Chen等人,Adv Drug DelivRev(2013)65(10):1357-1369中，通过引用将其整体并入本文。在一些实施方案中，接头序列可以是柔性接头序列。柔性接头序列允许通过接头序列连接的氨基酸序列的相对移动。柔性接头是本领域技术人员已知的，并且在Chen等人,Adv Drug Deliv Rev(2013)65(10):1357-1369中鉴定了几种。柔性接头序列通常包含高比率的甘氨酸和/或丝氨酸残基。在一些实施方案中，接头序列包含至少一个甘氨酸残基和/或至少一个丝氨酸残基。在一些实施方案中，接头序列由甘氨酸和丝氨酸残基组成。在一些实施方案中，接头序列具有1-2、1-3、1-4、1-5、1-10、1-20、1-30、1-40或1-50个氨基酸的长度。

在一些实施方案中，接头序列包含或由SEQ ID NO:16或45中所示的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，接头序列包含或由SEQ ID NO:16或45中所示氨基酸序列的1、2、3、4或5个串联拷贝组成。

CAR可以另外包含另外的氨基酸或氨基酸序列。例如，抗原结合分子和多肽可以包含促进表达、折叠、运输、加工、纯化或检测的氨基酸序列。例如，CAR可以包含编码His(例如6XHis)、Myc、GST、MBP、FLAG、HA、E或生物素标签的序列，任选地在N-或C-末端。在一些实施方案中，CAR包含可检测部分，例如荧光、发光、免疫可检测、放射性、化学、核酸或酶标记。

具体的示例性CAR

在本公开的一些实施方案中，CAR包含或由以下组成：

抗原结合结构域，其包含或由与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列组成；

铰链区，其包含或由与SEQ ID NO:33的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列组成；

跨膜结构域，其包含或由与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列组成；和

信号传导结构域，其包含或由与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列组成。

在本公开的一些实施方案中，CAR包含或由与SEQ ID NO:35或36的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列组成。

在一些实施方案中，CAR选自在下述中描述的CD30特异性CAR的实施方案：Hombach等人Cancer Res.(1998)58(6):1116-9，Hombach等人Gene Therapy(2000)7:1067-1075，Hombach等人J Immunother.(1999)22(6):473-80，Hombach等人Cancer Res.(2001)61:1976-1982，Hombach等人J Immunol(2001)167:6123-6131，Savoldo等人Blood(2007)110(7):2620-30，Koehler等人Cancer Res.(2007)67(5):2265-2273，Di Stasi等人Blood(2009)113(25):6392-402，Hombach等人Gene Therapy(2010)17:1206-1213，Chmielewski等人Gene Therapy(2011)18:62-72，Kofler等人Mol.Ther.(2011)19(4):760-767，Gilham,Abken和Pule.Trends in Mol.Med.(2012)18(7):377-384，Chmielewski等人Gene Therapy(2013)20:177-186，Hombach等人Mol.Ther.(2016)24(8):1423-1434，Ramos等人J.Clin.Invest.(2017)127(9):3462-3471，WO 2015/028444 A1或WO 2016/008973 A1，所有通过引用将其整体并入本文。

在本公开的一些实施方案中，CAR包含或由以下组成：

抗原结合结构域，其包含或由与SEQ ID NO:46的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列组成；

铰链区，其包含或由与SEQ ID NO:47的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列组成；

跨膜结构域，其包含或由与SEQ ID NO:48的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列组成；和

信号传导结构域，其包含或由与SEQ ID NO:50的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列组成。

在本公开的一些实施方案中，CAR包含或由与SEQ ID NO:52或53的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列组成。

表达CAR的病毒特异性免疫细胞

本公开涉及包含/表达嵌合抗原受体(CAR)的病毒特异性免疫细胞。

表达CAR的病毒特异性免疫细胞可以表达或包含根据本公开的CAR。表达CAR的病毒特异性免疫细胞可以包含或表达编码根据本公开的CAR的核酸。将认识到，表达CAR的细胞包含其表达的CAR。还将认识到，表达编码CAR的核酸的细胞也表达并包含由核酸编码的CAR。

根据本公开的包含CAR/编码CAR的核酸的病毒特异性免疫细胞可以通过参考细胞的功能特性来表征。

在一些实施方案中，根据本公开的包含CAR/编码CAR的核酸的病毒特异性免疫细胞显示以下特性中的一种或多种：

(a)一种或多种细胞毒性/效应因子(例如IFNγ、颗粒酶、穿孔素、颗粒溶素、CD107a、TNFα、FASL)的表达，增殖/群体扩增，和/或生长因子(例如IL-2)表达，这些响应于表达CAR对其有特异性的靶抗原的细胞，响应于感染病毒特异性免疫细胞对其有特异性的病毒的细胞，和/或响应于呈递病毒特异性免疫细胞对其有特异性的病毒抗原的肽的细胞；

(b)对以下细胞的细胞毒性：表达CAR对其有特异性的靶抗原的细胞、感染病毒特异性免疫细胞对其有特异性的病毒的细胞和/或呈递病毒特异性抗体细胞对其有特异性的病毒的抗原的肽的细胞；

(c)对以下细胞没有细胞毒性(即高于基线)：不表达CAR对其有特异性的靶抗原的细胞、未感染病毒特异性免疫细胞对其有特异性的病毒的细胞和/或不呈递病毒特异性的免疫细胞对其有特异性的病毒的抗原的肽的细胞；

(d)针对以下癌症的抗癌活性(例如对癌症细胞的细胞毒性、肿瘤生长抑制、转移的减少等)：包含表达CAR对其有特异性的靶抗原的细胞的癌症、包含感染病毒特异性免疫细胞对其有特异性的病毒的细胞的癌症和/或包含呈递病毒特异性免疫细胞对其有特异性的病毒的抗原的肽的细胞的癌症；和

(e)对同种反应性免疫细胞(例如表达CAR对其有特异性的靶抗原的同种反应免疫细胞)的细胞毒性。

可以通过分析一段时间内的细胞分裂或细胞的数量来研究细胞增殖/群体扩增。细胞分裂可以通过例如

如本文所用，“表达”可以是基因或蛋白质表达。基因表达包括DNA到RNA的转录，并且可以通过本领域技术人员已知的各种手段来测量，例如通过定量实时PCR(qRT-PCR)或通过基于报告子的方法来测量mRNA水平。类似地，蛋白质表达可以通过本领域公知的各种方法来测量，例如通过基于抗体的方法，例如通过western印迹、免疫组织化学、免疫细胞化学、流式细胞术、ELISA、ELISPOT或基于报告子的方法。

例如，可以使用Zaritskaya等人,Expert Rev Vaccines(2011),9(6):601-616中综述的任何方法来研究细胞毒性和细胞杀死，所述文献通过引用将其整体并入本文。细胞毒性/细胞杀死测定法的体外测定法的实例包括释放测定法，例如

可以通过在癌症的适当体外测定法或体内模型中进行分析来对细胞评估抗癌活性。

在一些实施方案中，本公开的表达CD30特异性CAR的EBV特异性免疫细胞显示以下特性中的一种或多种：

(a)响应于表达CD30的细胞、响应于感染EBV的细胞和/或响应于呈递EBV抗原肽的细胞，一种或多种细胞毒性/效应因子(例如IFNγ、颗粒酶、穿孔素、颗粒溶素、CD107a、TNFα、FASL)的表达；

(b)对以下细胞的细胞毒性：表达CD30的细胞、感染EBV的细胞和/或呈递EBV抗原的肽的细胞；

(c)对以下细胞没有细胞毒性(即高于基线)：不表达CD30的细胞、未感染EBV的细胞和/或不呈递EBV抗原的肽的细胞；

(d)针对以下癌症的抗癌活性(例如对癌症细胞的细胞毒性、肿瘤生长抑制、转移的减少等)：包含表达CD30的细胞的癌症、包含感染EBV的细胞的癌症和/或包含呈递EBV抗原的肽的细胞；和

(e)对同种反应性免疫细胞(例如表达CD30的同种异体反应免疫细胞)的细胞毒性。

在根据本公开的各个方面的一些实施方案中，病毒特异性免疫细胞可以包含/表达多于一种(例如2、3、4种等)CAR。

在一些实施方案中，病毒特异性免疫细胞可以包含/表达多于一种不相同的CAR。包含/表达多于一种不相同的CAR的病毒特异性免疫细胞可包含/表达对不相同的靶抗原有特异性的CAR。例如，本文的实施例4描述了病毒特异性免疫细胞，其包含/表达CD30特异性CAR

在一些实施方案中，不相同的靶抗原之一是CD30。在一些实施方案中，包含/表达多于一种不相同的CAR的病毒特异性免疫细胞包含：CD30特异性CAR和对除CD30之外的靶抗原有特异性的CAR。

组合物

本公开进一步提供包含根据本公开的一种或多种(例如群体)表达CAR的病毒特异性免疫细胞的组合物。

本文所述的细胞可以配制成用于临床用途的药物组合物或药物，并且可以包括药学上可接受的运载体、稀释剂、赋形剂或佐剂。组合物可配制用于局部、胃肠外、全身、腔内、静脉内、动脉内、肌内、鞘内、眼内、结膜内、肿瘤内、皮下、皮内、鞘内、口服或透皮施用途径，所述施用途径可包括注射或输注。

合适的制剂可以包括在无菌或等渗介质中的细胞。药物和药物组合物可以配制成流体，包括凝胶形式。流体制剂可以配制成通过注射或输注(例如经由导管)施用到人体或动物体的选定区域。

在一些实施方案中，组合物被配制用于注射或输注，例如到血管或肿瘤中。

本公开还提供了用于生产药学上有用的组合物的方法，这种生产方法可以包括选自以下的一个或多个步骤：生产本文所述的细胞；分离本文所述的细胞；和/或将本文所述的细胞与药学上可接受的运载体、佐剂、赋形剂或稀释剂混合。

例如，本公开的另一方面涉及配制或生产用于治疗疾病/病况(例如癌症)的药物或药物组合物的方法，该方法包括通过将本文所述的细胞与药学上可接受的运载体、佐剂、赋形剂或稀释剂混合来配制药物组合物或药物。

MHC变化和匹配

MHC I类分子是alpha(α)链和beta(β)2-微球蛋白(B2M)的非共价异二聚体。α链有三个结构域，分别命名为α1、α2和α3。α1和α2结构域一起形成凹槽，MHC I类分子呈递的肽与凹槽结合，以形成肽:MHC复合物。在人类中，MHC I类α链由人类白细胞抗原(HLA)基因编码。有三个主要的HLA基因基因座(HLA-A、HLA-B和HLA-C)和三个次要的基因座(HLA-E、HLA-F和HLA-G)。

MHC I类α链具有多态性，并且不同的α链能够结合和呈递不同的肽。编码MHC I类α多肽的基因是高度可变的，因此来自不同受试者的细胞通常表达不同的MHC I类分子。

这种变异性对个体间的器官移植和细胞的过继转移具有影响。移植物或过继转移细胞的接受体的免疫系统将非自身MHC分子识别为外来分子，触发针对移植物或过继转移的细胞的免疫应答，这可以导致移植物排斥。备选地，待移植的细胞群体/组织/器官中的细胞可以含有免疫细胞，这些免疫细胞将接受体的MHC分子识别为外来分子，触发针对接受体组织的免疫应答，这可以导致移植物抗宿主病(GVHD)。

同种反应性T细胞包含能够识别非自身MHC分子(即同种异体MHC)的TCR，并启动对其的免疫应答。同种反应性T细胞可响应表达非自身MHC分子的细胞表现出以下特性中的一种或多种：细胞增殖、生长因子(例如IL-2)表达、细胞毒性/效应因子(例如IFNγ、颗粒酶、穿孔素、颗粒溶素、CD107a、TNFα、FASL)表达和/或细胞毒性活性。

本文所用的“同种反应性”和“同种反应免疫应答”是指针对与效应免疫细胞在基因上不相同的细胞/组织/器官的免疫应答。效应免疫细胞可以对表达非自身MHC/HLA分子(即与由效应免疫细胞编码的MHC/HLA分子不相同的MHC/HLA分子)的细胞——或包含细胞的组织/器官——显示出同种反应性或同种反应性免疫应答。

本文所指的“MHC不匹配的”和“HLA不匹配的”受试者是具有编码不相同的MHC/HLA分子的MHC/HLA基因的受试者。在一些实施方案中，MHC不匹配的或HLA不匹配的受试者具有编码不相同的MHC I类α和/或MHC II类分子的MHC/HLA基因。本文所指的“MHC匹配的”和“HLA匹配的”受试者是具有编码相同的MHC/HLA分子的MHC/HLA基因的受试者。在一些实施方案中，MHC匹配的或HLA匹配的受试者具有编码相同的MHC I类α和/或MHC II类分子的MHC/HLA基因。

在细胞/组织/器官在本文中被称为相对于参考受试者/治疗是同种异体的情况下，该细胞/组织或器官获得自/来源于除参考受试者之外的受试者的细胞/组织/器官。在一些实施方案中，同种异体材料包含编码MHC/HLA分子(例如MHC I类α和/或MHC II类分子)的MHC/HLA基因，其与参考受试者的MHC/HLA基因所编码的MHC/HLA分子(例如，MHC I级α和/或者MHC II类分子)不相同。

在细胞/组织/器官在本文中被称为相对于治疗是同种异体的情况下，该细胞/组织或器官获得自/来源于除待治疗的受试者之外的受试者的细胞/组织/器官。在一些实施方案中，同种异体材料包含编码MHC/HLA分子(例如，MHC I类α和/或MHC II类分子)的MHC/HLA基因，其与待治疗的受试者的MHC/HLA基因所编码的MHC/HLA分子(例如，MHC I类α和/或MHC II类分子)不相同。

当细胞/组织/器官在本文中被称为相对于参考受试者是自体的(autologous)时，该细胞/组织或器官获得自/来源于参考受试者的细胞/组织和器官。当细胞/组织/器官在本文中被称为相对于参考受试者是同基因的(autogeneic)时，该细胞/组织或器官与参考受试者在基因上相同，或来源于/获得自在基因上相同的受试者。当细胞/组织/器官在本文中被称为在受试者的治疗中是自体的时(例如，通过对受试者施用自体细胞进行治疗)，该细胞/组织或器官获得自/来源于待治疗的受试者的细胞/组织/器官。当细胞/组织/器官在本文中被称为在受试者的治疗中是同基因的时，该细胞/组织或器官与待治疗的受试者在基因上相同，或者来源于/获得自在基因上相同的受试物。自体的和同基因的细胞/组织/器官包含编码MHC/HLA分子(例如MHC I类α和/或MHC II类分子)的MHC/HLA基因，所述MHC/HLA分子与参考受试者的MHC/HLA基因所编码的MHC/HLA分子(例如，例如MHC I类α和/或MHC II类分子)是相同的。

当细胞/组织/器官在本文中被称为相对于参考受试者是同种异体(allogeneic)时，该细胞/组织/器官与参考受试者在基因上不相同，或者来源于/获得自在基因上不相同的受试者。当细胞/组织/器官在本文中被称为在受试者的治疗中是同种异体时，该细胞/组织或器官与待治疗的受试者在基因上不相同，或者来源于/获得自在基因上不相同的受试者。同种异体的细胞/组织/器官可以包含编码MHC/HLA分子(例如MHC I类α和/或MHC II类分子)的MHC/HLA基因，所述MHC/HLA分子与参考受试者的MHC/HLA基因编码的MHC/HLA分子(例如MHC I类α和/或MHC II类分子)不相同。

在一些实施方案中，基于待治疗的受试者的HLA/MHC谱来选择表达/包含本文所述的CAR(或表达/包含编码这种CAR的核酸)的对病毒有特异性的免疫细胞，通过根据本公开的方法施用给受试者。

在一些实施方案中，待施用给受试者的细胞是基于它们相对于受试者是HLA/MHC匹配的来选择的。在一些实施方案中，待施用给受试者的细胞是基于它们相对于受试者是接近或完全HLA/MHC匹配来选择的。

如本文所用，当HLA/MHC等位基因编码具有相同氨基酸序列的多肽时，可以确定其“匹配”。也就是说，“匹配”是在蛋白质水平上确定的，而与编码多肽的核苷酸序列中可能存在的同义差异和/或非编码区中的差异无关。

相对于参考受试者是“HLA匹配的”细胞可以是：(i)在HLA-A、-B、-C和-DRB1之间8/8匹配；或(ii)在HLA-A、-B、-C、-DRB1和-DQB1之间10/10匹配；或(iii)在HLA-A、-B、-C、-DRB1、-DQB1和-DPB1之间12/12匹配。相对于参考受试者是“接近或完全HLA匹配”的细胞可以是：(i)在HLA-A、-B、-C和-DRB1之间≥4/8(即4/8、5/8、6/8、7/8或8/8)匹配；或(ii)在HLA-A、-B、-C、-DRB1和-DQB1之间≥5/10(即5/10、6/10、7/10、8/10、9/10或10/10)匹配；或(iii)在HLA-A、-B、-C、-DRB1、-DQB1和-DPB1之间≥6/12(即6/12、7/12、8/12、9/12、10/12、11/12或12/12)匹配。

向接近或完全HLA匹配的受试者(无论它们是同种异体来源)施用细胞可能是有利的，特别是在施用表达/包含本文所述CAR(或表达/包含编码这种CAR的核酸)的对病毒有特异性的免疫细胞以治疗由免疫细胞对其有特异性的病毒感染引起的或与之相关的疾病/病况的情况下。在这种情况下，宿主的细胞向所施用的细胞呈递病毒抗原(通过其天然TCR)有望增加其在体内的激活、增殖和存活，从而提高其治疗效果。

使用表达CAR的病毒特异性免疫细胞的方法

本文所述的表达CAR的病毒特异性免疫细胞(例如本文所述表达CD30特异性CAR的EBV特异性T细胞(CD30.CAR EBVST))可用于治疗和/或预防方法。

提供了一种治疗/预防受试者疾病/病况的方法，所述方法包括向受试者施用表达本公开的CAR的病毒特异性免疫细胞。

还提供了表达根据本公开的CAR的病毒特异性免疫细胞，用于医学治疗/预防的方法。还提供了表达根据本公开的CAR的病毒特异性免疫细胞，用于治疗/预防疾病/病况的方法。还提供了表达根据本公开的CAR的病毒特异性免疫细胞在制备用于治疗/预防疾病/病况的方法的药物中的用途。

应当理解，方法通常包括向受试者施用表达根据本公开的CAR的病毒特异性免疫细胞群体。在一些实施方案中，表达根据本公开的CAR的病毒特异性免疫细胞可以以包含这样的细胞的药物组合物的形式施用。

特别地，设想表达根据本公开的CAR的病毒特异性免疫细胞在通过过继细胞转移(ACT)来治疗/预防疾病/病况的方法中的用途。

表达根据本公开的CAR的病毒特异性免疫细胞特别地可用于通过同种异体移植治疗疾病/病况的方法。

如本文所用，“同种异体移植”是指将与接受体受试者在基因上不相同的细胞、组织或器官移植给接受体受试者。细胞、组织或器官可以来自或可以来源于与接受体受试者在基因上不相同的供体受试者的细胞、组织和器官。同种异体移植不同于自体移植，自体移植是来自/来源于与接受体受试者在基因上相同的供体受试者的细胞、组织或器官的移植。

应当理解，同种异体免疫细胞的过继转移是同种异体移植的一种形式。在一些实施方案中，表达CAR的病毒特异性免疫细胞在通过同种异体移植来治疗/预防疾病/病况的方法中用作治疗/预防剂。

本公开的表达CAR的病毒特异性免疫细胞和组合物的施用优选地以“治疗有效”或“预防有效”量施用，该量足以显示对受试者的治疗或预防益处。实际施用量、施用率和时间过程将取决于疾病/病况的性质和严重程度以及施用的特定物品。治疗处方，如剂量决定等，由全科医生和其他医生负责，并且通常会考虑到待治疗的疾病/病况、个体受试者的病况、递送位点、施用的方法和医生已知的其他因素。上述技术和方案的实例可参见Remington’s Pharmaceutical Sciences,第20版,2000,pub.Lippincott,Williams&Wilkins。

可以提供多个剂量。多个剂量可以通过预定的时间间隔分开，该时间间隔可以被选择为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或更多小时，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天，或者1、2、3、4、5或6个月中的一个。例如，可以每7、14、21或28天(加或减3、2或1天)给予剂量。

在一些实施方案中，治疗可以进一步包括其他治疗性或预防性干预，例如化疗、免疫疗法、放疗、手术、疫苗接种和/或激素疗法。这种其他治疗性或预防性干预可以在本公开所涵盖的疗法之前、期间和/或之后发生，并且其他治疗性和预防性干预的递送可以通过与本公开的疗法不同的施用途径进行。

施用可以单独或者与其他治疗组合，同时地或顺序地，取决于待治疗的病况。本文所述的表达CAR的病毒特异性免疫细胞和组合物可以与另一种治疗干预同时地或顺序地施用。

同时施用是指两种或更多种治疗干预措施一起施用，例如作为含有两种活性剂的药物组合物(即在组合的制剂中)，或者在一种之后立即另一种并任选地经由相同的施用途径，如对同一动脉、静脉或其他血管施用。

顺序施用是指施用一种治疗性干预，其后在给定的时间间隔后分开施用一种或多种进一步的治疗干预。虽然在一些实施方案中通过相同的途径施用，但不要求通过相同的途径施用疗法。时间间隔可以是任何时间间隔。

过继细胞转移通常是指从受试者身上获得细胞(例如免疫细胞)的过程，通常是通过抽取血液样品从中分离细胞。然后通常对细胞进行修饰和/或扩增，并然后施用给同一受试者(在自体的/同基因的细胞的过继转移的情况下)或不同的受试者(在同种异体细胞的过继转移的情况下)。治疗通常旨在向受试者提供具有某些所需特征的细胞群体，或增加具有该特征的细胞在该受试者中的频率。进行过继转移的目的可以是将细胞或细胞群体引入受试者，和/或增加受试者中细胞或细胞群体的频率。

免疫细胞的过继转移描述在例如Kalos和June(2013),Immunity 39(1):49-60和Davis等人(2015),Cancer J.21(6):486–491中，两者通过引用将其整体并入本文。本领域技术人员能够根据本公开来确定用于细胞过继转移的适当试剂和程序，例如通过参考Dai等人,(2016)J Nat Cancer Inst 108(7):djv439，通过引用将其整体并入本文。

本公开提供了包括向受试者施用包含/表达根据本公开的CAR的病毒特异性免疫细胞，或包含/表达编码根据本公开的CAR的核酸的病毒特异性免疫细胞的方法。

在一些实施方案中，所述方法包括生成对病毒有特异性的免疫细胞，或生成/扩增对病毒有特异性的免疫细胞群体。在一些实施方案中，所述方法包括修饰对病毒有特异性的免疫细胞以包含/表达根据本公开的CAR。在一些实施方案中，所述方法包括修饰对病毒有特异性的免疫细胞以包含/表达编码根据本公开的CAR的核酸。

在一些实施方案中，所述方法包括向受试者施用对病毒有特异性的免疫细胞，所述免疫细胞经修饰以表达/包含根据本公开的CAR(或经修饰以表达/包含编码这种CAR的核酸)。

在一些实施方案中，所述方法包括：

(a)修饰对病毒有特异性的免疫细胞以表达或包含根据本公开的CAR，或以表达或包含编码根据本公开的CAR的核酸，以及

(b)向受试者施用对病毒有特异性的免疫细胞，所述免疫细胞经修饰以表达或包含根据本公开的CAR，或经修饰以表达或包含编码根据本公开的CAR的核酸。

在一些实施方案中，所述方法包括：

(a)分离或获得对病毒有特异性的免疫细胞；

(b)修饰对病毒有特异性的免疫细胞以表达或包含根据本公开的CAR，或以表达或包含编码根据本公开的CAR的核酸，以及

(c)向受试者施用对病毒有特异性的免疫细胞，所述免疫细胞经修饰以表达或包含根据本公开的CAR，或经修饰以表达或包含编码根据本公开的CAR的核酸。

在一些实施方案中，所述方法包括：

(a)从受试者中分离免疫细胞(例如PBMC)；

(b)生成/扩增对病毒有特异性的免疫细胞群体；

(c)修饰对病毒有特异性的免疫细胞以表达或包含根据本公开的CAR，或以表达或包含编码根据本公开的CAR的核酸，以及

(d)向受试者施用对病毒有特异性的免疫细胞，所述免疫细胞经修饰以表达或包含根据本公开的CAR，或经修饰以表达或包含编码根据本公开的CAR的核酸。

在一些实施方案中，所述方法包括向受试者施用EBV特异性免疫细胞，所述EBV特异性免疫细胞经修饰以表达或包含根据本公开的CD30特异性CAR，或经修饰以表达或者包含根据本公开的编码CD30特异性CAR的核酸。

在一些实施方案中，所述方法包括：

(a)修饰EBV特异性免疫细胞以表达或包含根据本公开的CD30特异性CAR，或以表达或包含编码根据本公开的CD30特异性CAR的核酸，以及

(b)向受试者施用EBV特异性免疫细胞，所述EBV特异性免疫细胞经修饰以表达或包含根据本公开的CD30特异性CAR，或经修饰以表达或包含编码根据本公开的CD30特异性CAR的核酸。

在一些实施方案中，所述方法包括：

(a)分离或获得EBV特异性免疫细胞；

(b)修饰EBV特异性免疫细胞以表达或包含根据本公开的CD30特异性CAR，或以表达或包含编码根据本公开的CD30特异性CAR的核酸，以及

(c)向受试者施用EBV特异性免疫细胞，所述EBV特异性免疫细胞经修饰以表达或包含根据本公开的CD30特异性CAR，或经修饰以表达或包含编码根据本公开的CD30特异性CAR的核酸。

在一些实施方案中，所述方法包括：

(a)从受试者分离免疫细胞(例如PBMC)；

(b)生成/扩增EBV特异性免疫细胞群体；

(c)修饰EBV特异性免疫细胞以表达或包含根据本公开的CD30特异性CAR，或以表达或包含编码根据本公开的CD30特异性CAR的核酸，以及

(d)向受试者施用EBV特异性免疫细胞，所述EBV特异性免疫细胞经修饰以表达或包含根据本公开的CD30特异性CAR，或经修饰以表达或包含编码根据本公开的CD30特异性CAR的核酸。

在一些实施方案中，从其分离免疫细胞(例如PBMC)的受试者是对其施用细胞的同一受试者(即，过继转移可以是自体/同基因细胞)。在一些实施方案中，从其分离免疫细胞(例如PBMC)的受试者是与对其施用细胞的受试者不同的受试者(即，过继转移可以是同种异体细胞)。

在一些实施方案中，所述方法可以包括以下中的一个或多个：

从受试者获得血液样品；

从已从受试者获得的血液样品中分离免疫细胞(例如PBMC)；

生成/扩增对病毒有特异性的免疫细胞群体(例如，通过在包含/表达病毒的抗原/肽的细胞(例如APC)存在下培养PBMC，或通过在感染了病毒的细胞(例如APC)存在下培养PBMC)；

在体外或离体细胞培养中培养对病毒有特异性的免疫细胞；

修饰对病毒有特异性的免疫细胞以表达或包含根据本公开的CAR，或以表达或包含编码根据本公开的CAR的核酸(例如，通过用编码这种CAR的病毒载体、或包含这种核酸的病毒载体转导)；

在体外或离体细胞培养中培养对病毒有特异性的免疫细胞，所述免疫细胞表达/包含根据本公开的CAR，或表达/包含编码根据本公开的CAR的核酸；

收集/分离表达/包含根据本公开的CAR或表达/包含编码根据本公开的CAR的核酸的对病毒有特异性的免疫细胞；

将表达/包含根据本公开的CAR或编码根据本公开的CAR的核酸的对病毒有特异性的免疫细胞配制成药物组合物，例如通过将细胞与药学上可接受的佐剂、稀释剂或运载体混合；

向受试者施用表达/包含根据本公开的CAR的、或表达/包含编码根据本公开的CAR的核酸的对病毒有特异性的免疫细胞、或包含这些细胞的药物组合物。

在一些实施方案中，所述方法可另外包括处理细胞或受试者以诱导/增强CAR的表达和/或诱导/增强包含/表达CAR的病毒特异性免疫细胞的增殖或存活。

治疗和/或预防方法可以有效地减少疾病/病况的发展/进展、减轻疾病/病况的症状或减少疾病/病况的病理学。所述方法可以有效地防止疾病/病况的进展，例如防止疾病/病况的恶化或减缓疾病/病况的发展速度。在一些实施方案中，所述方法可导致疾病/病况的改善，例如疾病/病况的症状的严重性的降低，或疾病/病况的严重性/活动性的某些其他相关性的降低。在一些实施方案中，所述方法可以防止疾病/病况发展到后期(例如慢性期或转移)。

将认识到，根据本公开的表达CAR的病毒特异性免疫细胞的治疗和预防用途延伸到任何疾病/病况的治疗/预防，这将从表达/过表达CAR的靶抗原的细胞数量/活性、和/或感染病毒的细胞的数量/活性的减少中获得治疗或预防益处。

在一些实施方案中，根据本公开待治疗/预防的疾病/病况是其中在病理上涉及免疫细胞对其有特异性的病毒的疾病/病况。也就是说，在一些实施方案中，疾病/病况是由感染病毒引起或加重的疾病/病况，感染病毒是其风险因素的疾病/病况，和/或感染病毒与疾病/病况的发作、发展、进展和/或严重程度正相关的疾病/病况。

在一些实施方案中，根据本公开待治疗/预防的疾病/病况，其中在病理上涉及CAR的靶抗原。也就是说，在一些实施方案中，疾病/病况是由靶抗原的表达/过表达引起或加重的疾病/病况，靶抗原的表达/过表达是其风险因素的疾病/病况，和/或靶抗原的表达/过表达与疾病/病况的发作、发展、进展和/或严重程度正相关的疾病/病况。

疾病/病况可以是在病理上涉及CD30或表达/过表达CD30的细胞的疾病/病况，例如表达/过表达CD3的细胞与疾病/病况的发作、发展或进展和/或疾病/病况的一种或多种症状的严重程度正相关的疾病/病况，或者CD30表达/过表达是疾病/病况的发作、发展或进展的风险因素。

根据本公开待治疗/预防的疾病/病况可以是以EBV感染为特征的疾病/病况。例如，疾病/病况可以是在病理上涉及EBV或感染EBV的细胞的疾病/病况，例如EBV感染与疾病/病况的发作、发展或进展和/或疾病/病况的一种或多种症状的严重程度正相关的疾病/病况，或者EBV感染是疾病/病况的发病的发作、发展或进展的风险因素。

治疗可以针对以下中的一个或多个：降低病毒载量，降低病毒阳性细胞(例如EBV阳性细胞)的数量/比率，降低表达/过表达CAR的靶抗原的细胞(例如表达CD30的细胞)的数量/比率，降低病毒阳性细胞(例如EBV阳性细胞)的活性，降低表达/过表达CAR的靶抗原的细胞(例如表达的CD30细胞)的活性，延迟/预防疾病/病况的症状的发作/进展，降低疾病/病况的症状的严重程度，降低病毒阳性细胞(例如EBV阳性细胞)的存活/生长，降低表达/过表达CAR的靶抗原的细胞(例如表达CD30的细胞)的存活/生长，或者增加受试者的存活。

在一些实施方案中，可以基于对病毒(例如EBV)、感染病毒(例如EBV)的细胞或在例如外周或在受疾病/病况影响的器官/组织中(例如疾病/病况的症状表现在其中的器官/细胞)中表达/过表达CAR的靶抗原(例如CD30)的细胞的检测，或通过对病毒阳性癌症细胞(例如EBV-阳性癌症细胞)的检测或对表达/过表达CAR的靶抗原(例如CD30)的癌症细胞的检测，来选择受试者用于本文所述的治疗。疾病/病况可以影响任何组织、器官或器官系统。在一些实施方案中，疾病/病况可以影响若干组织/器官/器官系统。

在一些实施方案中，可以基于确定受试者感染EBV或包含感染EBV的细胞，来选择受试者用于根据本公开的治疗/预防。在一些实施方案中，可以基于确定受试者包含表达/过表达CD30的细胞，例如表达/过表达CD30的癌症细胞，来选择受试者用于根据本公开的治疗/预防。

在一些实施方案中，在施用表达/包含本文所述的CAR(或表达/包含编码这种CAR的核酸)的对病毒有特异性的免疫细胞之前，对受试者施用淋巴细胞清除性化疗。

也就是说，在一些实施方案中，根据本公开的治疗/预防疾病/病况的方法包括：(i)对受试者施用淋巴细胞清除性化疗，和(ii)随后施用表达/包含根据本公开的CAR或表达/包含编码根据本公开的CAR的核酸的对病毒有特异性的免疫细胞。

如本文所用，“淋巴细胞清除性化疗”指的是用化疗剂进行的治疗，其导致施用治疗的受试者体内淋巴细胞(例如T细胞、B细胞、NK细胞、NKT细胞或先天性淋巴细胞(ILC)或其前体)的清除。“淋巴细胞清除性化疗剂”是指导致淋巴细胞清除的化疗剂。

淋巴细胞清除性化疗及其在过继细胞转移治疗方法中的应用描述在例如Klebanoff等人,Trends Immunol.(2005)26(2):111-7和Muranski等人,Nat Clin PractOncol.(2006)(12):668-81中，两者通过引用将其整体并入本文。淋巴细胞清除性化疗的目的是清除接受体受试者的内源性淋巴细胞群体。

在通过免疫细胞的过继转移来治疗疾病的情况下，淋巴细胞清除性化疗通常在过继细胞转移之前施用，以调节接受体受试者以接受过继转移的细胞。淋巴细胞清除性化疗被认为是通过创造一个允许的环境来促进过继转移细胞的持久性和活性，例如通过消除表达免疫抑制细胞因子的细胞，并创造过继转移淋巴细胞的扩增和活性所需的“淋巴空间”。

常用于淋巴细胞清除性化疗的化学治疗剂包括例如氟达拉滨、环磷酰胺、苯达莫司汀(bedamustine)和喷司他丁(pentostatin)。

本公开的各方面和实施方案特别涉及包括施用氟达拉滨和/或环磷酰胺的淋巴细胞清除性化疗。在特定实施方案中，根据本公开的淋巴细胞清除性化疗包括施用氟达拉滨和环磷酰胺。

氟达拉滨是一种嘌呤类似物，通过干扰核糖核苷酸还原酶和DNA聚合酶来抑制DNA合成。它经常被用作治疗白血病(特别是慢性淋巴细胞白血病、急性髓系白血病、急性淋巴细胞白血病)和淋巴瘤(特别是非霍奇金淋巴瘤)的化疗剂。氟达拉滨可以通过静脉内注射或口服进行施用。

环磷酰胺是一种烷基化剂，引起DNA碱基之间不可逆的链内和链间交联。它经常被用作化疗剂，用于治疗癌症，包括淋巴瘤、白血病和多发性骨髓瘤。环磷酰胺可以通过静脉内注射或口服进行施用。

根据本公开的淋巴细胞清除性化疗的过程可以包括一种或多种化疗剂的多次施用。淋巴细胞清除性化疗的过程可包括以本文所述的剂量施用氟达拉滨和环磷酰胺，并持续本文所述的数天。举例来说，淋巴细胞清除性化疗的过程可包括连续3天以每天30mg/m

根据淋巴细胞清除性化疗的过程施用最终剂量的化疗剂的日期可以被认为是淋巴细胞清除性化疗的过程完成的日期。

在一些实施方案中，以每天5至100mg/m

在一些实施方案中，以根据以上段落的剂量施用氟达拉滨超过一天且少于连续14天。在一些实施方案中，以根据以上段落的剂量施用氟达拉滨连续2至14天，例如2至13、2至12、2至11、2至10、2至9、2至8、2至7、2至6、2至5或2至4天之一。在一些实施方案中，以根据以上段落的剂量施用氟达拉滨连续2至6天，例如连续2至4天，例如连续3天。

在一些实施方案中，以每天15至60mg/m

在一些实施方案中，以每天50至1000mg/m

在一些实施方案中，以根据以上段落的剂量施用环磷酰胺超过一天且少于连续14天。在一些实施方案中，以根据以上段落的剂量施用环磷酰胺连续2至14天，例如2至13、2至12、2至11、2至10、2至9、2至8、2至7、2至6、2至5或2至4天之一。在一些实施方案中，以根据以上段落的剂量连续施用环磷酰胺连续2至6天，例如连续2至4天，例如连续3天。

在一些实施方案中，环磷酰胺以每天400至600mg/m

在一些实施方案中，氟达拉滨和环磷酰胺可以同时地或顺序地施用。同时施用是指一起施用，例如作为含有两种药剂的药物组合物(即在组合的制剂中)，或在一种药剂之后立即施用，并任选地经由相同的施用途径，例如对同一动脉、静脉或其他血管施用。顺序施用是指施用药剂之一，在给定的时间间隔后分开施用另一种药剂。虽然在一些实施方案中通过相同的途径施用药剂，但不要求通过相同的途径施用药剂。

在根据本公开的淋巴细胞清除性化疗的一些实施方案中，氟达拉滨和环磷酰胺在同一天或几天施用。举例来说，在包括以每天30mg/m

在一些实施方案中，将表达/包含本文所述的CAR(或表达/包含编码这种CAR的核酸)的对病毒有特异性的免疫细胞在淋巴细胞清除性化疗过程完成后的指定时间段内施用给受试者。

在一些实施方案中，将表达/包含本文所述CAR(或表达/包含编码这种CAR的核酸)的对病毒有特异性的免疫细胞在本文所述的淋巴细胞清除性化疗过程完成后的1至28天内，例如1至21天、1至14天、1至7天、2至7天、2至5天或3至5天之一内施用给受试者。在一些实施方案中，将表达/包含本文所述CAR(或表达/包含编码这种CAR的核酸)的对病毒有特异性的免疫细胞在本文所述的淋巴细胞清除性化疗过程完成后2至14天内(例如3至5天内)施用给受试者。

在一些实施方案中，表达/包含本文所述的CAR(或表达/包含编码这种CAR的核酸)的对病毒有特异性的免疫细胞以1×10

在一些实施方案中，表达/包含本文所述的CAR(或表达/包含编码这种CAR的核酸)的对病毒有特异性的免疫细胞以4×10

表达/包含本文所述的CAR(或表达/包含编码这种CAR的核酸)的对病毒有特异性的免疫细胞的施用可以通过静脉内输注来施用。施用可以是1至50ml的体积，并且可以在1至10分钟的时间内进行。

在一些实施方案中，根据本公开待治疗/预防的疾病是癌症。

癌症可指任何不必要的细胞增殖(或任何表现为不必要细胞增殖的疾病)、赘生物或肿瘤。癌症可能是良性或恶性的，并且可以是原发性或继发性(转移性)的。赘生物或肿瘤可以是细胞的任何异常生长或增殖，并且可以位于任何组织中。癌症可以是来源于例如肾上腺、肾上腺髓质、肛门、阑尾、膀胱、血液、骨骼、骨髓、大脑、乳房、盲肠、中枢神经系统(包括或不包括大脑)小脑、宫颈、结肠、十二指肠、子宫内膜、上皮细胞(例如肾上皮)、胆囊、食道、神经胶质细胞、心脏、回肠、空肠、肾脏、泪腺、喉、肝、肺、淋巴、淋巴结、淋巴母细胞、上颌骨、纵隔、肠系膜、肌层、鼻咽、网膜，口腔、卵巢、胰腺、腮腺、外周神经系统、腹膜、胸膜、前列腺、唾液腺、乙状结肠、皮肤、小肠、软组织、脾、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、舌、扁桃体、气管、子宫、外阴的组织/细胞的癌症，和/或白细胞的癌症。

肿瘤可以是神经系统或非神经系统肿瘤。神经系统肿瘤可以起源于中枢或外周神经系统，例如神经胶质瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、神经纤维瘤、室管膜瘤、神经鞘瘤、神经纤维肉瘤、星形细胞瘤和少突胶质瘤。非神经系统癌症/肿瘤可以起源于任何其他非神经组织，实例包括黑色素瘤、间皮瘤、淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金淋巴瘤、慢性粒细胞性白血病(CML)、急性髓系白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、肝细胞瘤、表皮样癌、前列腺癌、乳腺癌症、肺癌症、结肠部癌症、卵巢癌症、胰腺癌症、胸腺癌、NSCLC、血液学癌症和肉瘤。

在一些实施方案中，癌症选自由以下组成的组：实体癌症、血液系统癌症、胃部癌症(例如胃癌、胃腺癌、胃肠腺癌)、肝癌症(肝细胞癌、胆管癌)、头颈癌症(例如头颈鳞状细胞癌)、口腔癌症(例如口咽部癌症(例如口咽喉癌)、口部癌症、喉癌症、鼻咽癌、食管癌症)、结直肠部癌症(例如结直肠癌)、结肠部癌症、结肠癌、宫颈癌、前列腺癌症、肺癌症(例如NSCLC、小细胞肺癌症、肺腺癌、鳞状肺细胞癌)、膀胱癌症，尿路上皮癌、皮肤癌症(例如黑色素瘤、晚期黑色素瘤)、肾细胞癌症(例如肾细胞癌)、卵巢癌症(例如卵巢癌)、间皮瘤、乳腺癌症、脑癌症(例如胶质母细胞瘤)、前列腺癌症、胰腺癌症、髓系血液系统恶性肿瘤、淋巴母细胞血液系统恶性肿瘤、骨髓增生异常综合征(MDS)、急性髓系白血病(AML)、慢性髓系白血病(CML)、急性淋巴母细胞白血病(ALL)、淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、胸腺瘤或多发性骨髓瘤(MM)。

在一些实施方案中，癌症是其中在病理上涉及免疫细胞对其有特异性的病毒的癌症。也就是说，在一些实施方案中，癌症是由感染病毒引起或加重的癌症，感染病毒是其危险因素的癌症，和/或感染病毒与癌症的发病、发展、进展、严重性或转移正相关的癌症。

EBV感染与几种癌症有关，综述在例如Jha等人,Front Microbiol.(2016)7:1602中，通过引用将其整体并入本文。

在一些实施方案中，待治疗/预防的癌症是EBV相关的癌症。在一些实施方案中，癌症是由感染EBV引起或加重的癌症，感染EBV是其危险因素的癌症，和/或感染EBV与癌症的发病、发展、进展、严重程度或转移正相关的癌症。癌症的特征可以是EBV感染，例如癌症可以包含感染EBV的细胞。这种癌症可以被称为EBV阳性癌症。

根据本公开可以治疗/预防的EBV相关癌症包括B细胞相关癌症，例如伯基特淋巴瘤、移植后淋巴增生性疾病(PTLD)、中枢神经系统淋巴瘤(CNS淋巴瘤)、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和与免疫缺陷相关的EBV相关淋巴瘤(包括例如与X连锁淋巴增生性病症相关的EBV-阳性淋巴瘤、与HIV感染/AIDS相关的EBV-阳性淋巴瘤和口腔毛状白斑)，以及上皮细胞相关癌症，如鼻咽癌(NPC)和胃癌(GC)。

在一些实施方案中，癌症选自淋巴瘤(例如EBV-阳性淋巴瘤)、头颈鳞状细胞癌(HNSCC；例如EBV阳性HNSCC)、鼻咽癌(NPC；例如EBV阳性NPC)和胃癌(GC；例如EBV阳性GC)。

在一些实施方案中，癌症是其中在病理上涉及CAR的靶抗原的癌症。也就是说，在一些实施方案中，癌症是由靶抗原的表达引起或加重的癌症，靶抗原的表达是其危险因素的癌症，和/或靶抗原表达与癌症的发作、发展、进展、严重程度或转移正相关的癌症。癌症的特征可以是靶抗原的表达，例如癌症可以包含表达靶抗原的细胞。这种癌症可以被称为对靶抗原呈阳性。

靶抗原“阳性”的癌症可以是包含表达靶抗原的细胞(例如在细胞表面)的癌症。对靶抗原呈“阳性”的癌症可以过表达靶抗原。靶抗原的过表达可以通过检测靶抗原的基因或蛋白质表达水平来确定，所述水平大于等同非癌细胞/非肿瘤组织的表达水平。

在一些实施方案中，靶抗原是本文所述的癌症细胞抗原。在一些实施方案中，靶抗原是CD30。

在一些实施方案中，癌症是其中病理上涉及CD30的癌症。也就是说，在一些实施方案中，癌症是由CD30表达引起或加重的癌症，CD30表达是其危险因素的癌症，和/或CD30表达与癌症的发作、发展、进展、严重性或转移正相关的癌症。癌症的特征可以是CD30表达，例如癌症可以包含表达CD30的细胞。这种癌症可以被称为CD30阳性癌症。

CD30阳性癌症可以是包含表达CD30的细胞(例如在细胞表面表达CD30蛋白的细胞)的癌症。CD30阳性癌症可以过表达CD30。CD30的过表达可以通过检测CD30的基因或蛋白质表达水平来确定，所述水平大于等同非癌细胞/非肿瘤组织的表达水平。

CD30阳性癌症描述于例如van der Weyden等人,Blood Cancer Journal(2017)7:e603和Muta和Podack,Immunol Res(2013),57(1-3):151-8中，两者通过引用将其整体并入本文。CD30在激活的T和B淋巴细胞的小亚群上表达，并被各种淋巴肿瘤表达，包括经典的霍奇金淋巴瘤和间变性大细胞淋巴瘤。CD30的可变表达也已显示用于未另行指定的外周T细胞淋巴瘤(PTCL-NOS)、成人T细胞白血病/淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、结外NK-T细胞淋巴瘤、各种B细胞非霍奇金淋巴瘤(包括弥漫性大B细胞淋巴瘤，特别是EBV阳性弥漫性大B细胞淋巴瘤)和晚期全身肥大细胞增多症。也在一些非造血系统恶性肿瘤中观察到CD30表达，包括生殖细胞肿瘤和睾丸胚胎癌。

跨膜糖蛋白CD30是肿瘤坏死因子受体超家族的成员(Falini等人,Blood(1995)85(1):1-14)。TNF/TNF受体(TNF-R)超家族的成员在多个水平上协调免疫应答，并且CD30在调节正常淋巴细胞的功能或增殖中发挥作用。CD30最初被描述为被单克隆抗体Ki-1识别的抗原，该单克隆抗体通过用HL衍生的细胞系L428免疫小鼠而产生(Muta和Podack,ImmunolRes(2013)57:151-158)。CD30抗原表达已用于鉴定霍奇金病中的ALCL和Reed-Sternberg细胞(Falini等人,Blood(1995)85(1):1-14)。CD30在淋巴瘤恶性细胞中广泛表达，因此是开发基于抗体的免疫疗法和细胞疗法两者的潜在靶标。重要的是，CD30在生理条件下通常不在正常组织上表达，因此在静息成熟或前体B或T细胞上明显不存在(Younes和Ansell,Semin Hematol(2016)53:186-189)。维布妥昔单抗(Brentuximab vedotin)是一种靶向CD30的抗体-药物缀合物，最初被批准用于治疗CD30阳性HL(

霍奇金淋巴瘤(HL)是一种罕见的涉及淋巴结和淋巴系统的恶性肿瘤。HL的发病率是双峰型的，大多数患者的诊断年龄在15至30岁，其次是55岁或以上的成年人。据估计，2019年美国将有8110例新病例(女性3540例，男性4570例)，1000人死于该疾病(女性410例，男性590例)(美国癌症协会，2019年)。根据美国癌症研究所SEER数据库中2012-2016年的病例，美国儿科HL患者的HL发病率如下：每100000人中，1-4岁：0.1；5-9岁：0.3；10-14岁：1.3；15-19岁：3.3(SEER癌症统计评论，1975-2016])。世界卫生组织(WHO)的分类将HL分为2种主要类型：经典霍奇金淋巴瘤(cHL)和结节性淋巴细胞多发性霍奇金淋巴瘤(NLPHL)。在西方国家，cHL占所有HL的95％，NLPHL占5％(2019年美国癌症国家综合网络指南)。

患有晚期疾病的cHL患者的一线化疗与70％至75％的治愈率相关(Karantanos等人,Blood Lymphat Cancer(2017)7:37-52)。挽救性化疗后自体干细胞移植(ASCT)通常用于初次疗法后复发的患者。不幸的是，高达50％的cHL患者在ASCT后经历疾病复发。ASCT后复发患者的中位总生存期约为两年(Alinari Blood(2016)127:287-295)。尽管进行了积极的组合化疗，但仍有10％至40％的患者对挽救性化疗没有应答，而且没有随机化临床试验数据支持无应答者的ASCT。对于那些对挽救性化疗没有应答、ASCT后复发或不是这种方法的候选者的患者，预后仍然很严重，迫切需要新的治疗方法(Keudell British Journal ofHaematology(2019)184:105–112)。

虽然大多数儿科人群(儿童、青少年和年轻人)将通过目前可用的疗法方法治愈，但一小部分患者可能患有难治性或复发性疾病，需要具有可接受的安全性和改善疗效的新疗法(Flerlage等人,Blood(2018)132:376-384；Kelly,Blood(2015)126:2452-2458；McClain和Kamdar,in UpToDate 2019；Moskowitz,ASCO Educational Book(2019)477-486)。在儿童时期接受高剂量化疗的HL患者通常经历与治疗相关的长期后遗症，如心脏、肺部、性腺和内分泌毒性以及次级恶性赘生物(Castellino等人,Blood(2011)117(6):1806-1816)。

在一些实施方案中，CD30阳性癌症可选自：实体癌症、血液学癌症、造血恶性肿瘤、霍奇金淋巴瘤(HL)、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、ALK阳性间变性T细胞淋巴瘤、ALK阴性间变性T淋巴细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤(例如PTCL-NOS)、T细胞白血病、T细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)，NK-T细胞淋巴瘤(例如结外NK-T细胞性淋巴瘤)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、B细胞非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞性淋巴瘤(例如弥漫性大B细胞淋巴瘤NOS)、原发性纵隔B细胞性淋巴瘤、EBV阳性B细胞淋巴瘤、EBV阳性弥漫性大B细胞性淋巴瘤，晚期系统性肥大细胞增多症，生殖细胞肿瘤和睾丸胚胎癌。

在一些实施方案中，癌症选自：CD30阳性癌症、EBV相关的癌症、血液系统癌症、髓系血液系统恶性肿瘤、造血系统恶性肿瘤、淋巴母细胞性血液系统恶性肿瘤、骨髓增生异常综合征、白血病、T细胞白血病、急性髓系白血病、慢性髓系白血病，急性淋巴母细胞白血病、淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、B细胞非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、EBV相关淋巴瘤、EBV阳性B细胞淋巴瘤、EBV阳性弥漫性大B细胞淋巴瘤、与X连锁淋巴增生性病症相关的EBV阳性淋巴瘤、与HIV感染/AIDS相关的EBV阳性淋巴瘤、口腔毛状白斑、伯基特淋巴瘤、移植后淋巴增生性疾病、中枢神经系统淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、ALK阳性间变性T细胞淋巴瘤，ALK阴性间变性T淋巴细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤，NK-T细胞淋巴瘤、结外NK-T细胞性淋巴瘤、胸腺瘤、多发性骨髓瘤、实体性癌症、上皮细胞癌症、胃部癌症、胃癌、胃腺癌、胃肠腺癌、肝癌症、肝细胞癌、胆管癌、头颈癌症、头颈鳞状细胞癌、口腔癌症、口咽部癌症、口咽癌、口部癌症、喉癌、鼻咽癌、食管癌、结直肠部癌症，结直肠癌、结肠部癌症、结肠癌、宫颈癌、前列腺癌症、肺癌症、非小细胞肺癌症、小细胞肺癌症、肺腺癌、鳞状肺细胞癌、膀胱癌症、尿路上皮癌、皮肤癌症、黑色素瘤、晚期黑色素瘤、肾细胞癌症、肾细胞癌、卵巢癌症、卵巢癌、间皮瘤、乳腺癌症、脑癌症、胶质母细胞瘤、前列腺癌症、胰腺癌症、肥大细胞增多症、晚期全身肥大细胞增多病、生殖细胞瘤或睾丸胚胎癌。

在一些实施方案中，癌症可以是复发的癌症。如本文所用，“复发的”癌症是指对治疗(例如癌症的一线治疗)有应答，但随后重新出现/进展的癌症，例如在缓解期后重新出现/进展。例如，复发的癌症可以是其生长/进展被治疗(例如癌症的一线治疗)抑制，并且随后生长/进展的癌症。

在一些实施方案中，癌症可以是难治性癌症。如本文所用，“难治性”癌症是指对治疗(例如癌症的一线治疗)没有应答的癌症。例如，难治性癌症可以是其生长/进展未被治疗(例如癌症的一线治疗)所抑制的癌症。在一些实施方案中，难治性癌症可以是这样的癌症，接受癌症治疗的受试者对该治疗没有显示出部分或完全的应答。

在癌症是间变性大细胞淋巴瘤的实施方案中，癌症可以对于用化疗、维布妥昔单抗或克唑替尼的治疗是复发的或难治性。在癌症为外周T细胞淋巴瘤的实施方案中，癌症可以对于用化疗或维布妥昔单抗的治疗是复发的或难治性。在癌症是结外NK-T细胞淋巴瘤的实施方案中，癌症对于用化疗(使用或不使用天冬酰胺酶)或维布妥昔单抗的治疗是复发的或难治性。在癌症是弥漫性大B细胞淋巴瘤的实施方案中，癌症对于用化疗(使用或不使用利妥昔单抗)或CD19 CAR-T疗法的治疗是复发的或难治性。在癌症是原发性纵膈B细胞淋巴瘤的实施方案中，癌症对于用化疗、免疫检查点抑制剂(例如PD-1抑制剂)或CD19 CAR-T疗法的治疗是复发的或难治性。

根据本公开的方法对癌症的治疗实现了以下治疗效果中的一个或多个：减少受试者中癌症细胞的数量，减小受试者中癌性肿瘤/病变的大小，抑制(例如防止或减缓)受试者中癌症细胞的生长，抑制(例如防止或减缓)受试者中癌性肿瘤/病变的生长，抑制(例如防止或减缓)癌症的发展/进展(例如至晚期或转移)，降低受试者中癌症症状的严重程度，增加受试者的存活期(例如无进展存活期或总存活期)，降低受试者中癌症细胞的数量或活性的相关性和/或减少受试者的癌症负担。

可以根据Revised Criteria for Response Assessment:The LuganoClassification(描述在例如Cheson等人,J Clin Oncol(2014)32:3059-3068中，通过上述引用并入)来评估受试者，以确定其对治疗的应答。在一些实施方案中，根据本公开的方法对受试者的治疗实现以下之一：完全应答、部分应答或稳定的疾病。

在一些实施方案中，癌症的治疗进一步包括化疗和/或放射疗法。

化疗和放射疗法分别是指使用药物或用电离辐射(例如使用X射线或γ射线的放射疗法)来治疗癌症。药物可以是化学实体，例如小分子药物、抗生素、DNA嵌入剂、蛋白质抑制剂(例如激酶抑制剂)或生物制剂，例如抗体、抗体片段、适体、核酸(例如DNA、RNA)、肽、多肽或蛋白质。药物可以配制成药物组合物或药物。制剂可以包含一种或多种药物(例如一种或更多种活性剂)以及一种或多种药学上可接受的稀释剂、赋形剂或运载体。

化疗可以涉及施用多于一种药物。药物可以单独施用，或与其他治疗组合施用，根据待治疗的病况同时地或顺序地施用。

化疗可以通过一种或多种施用途径进行施用，例如胃肠外、静脉内注射、口服、皮下、皮内或肿瘤内。

化疗可以根据治疗方案进行。治疗方案可以是预先确定的化疗施用的时间表、计划、方案或计划表，其可以由医生或医疗工作者制定，并且可以被定制以适合需要治疗的患者。治疗方案可以指示以下中的一个或多个：施用给患者的化疗类型；每种药物或辐照的剂量；施用之间的间隔时间；每次治疗的长度；任何治疗假期的数量和性质(如果有的话)等。对于共同疗法，可以提供单一的治疗方案，指示如何施用每种药物。

化学治疗药物可选自：阿贝西利、醋酸阿比特龙、阿比曲酸(甲氨蝶呤)、Abraxane(紫杉醇-白蛋白稳定的纳米颗粒制剂)、ABVD、ABVE、ABVE-PC、AC、阿卡替尼、AC-T、Adcetris(维布妥昔单抗(Brentuximab Vedotin))、ADE、Ado-恩美曲妥珠单抗(Ado-TrastuzumabEmtansine)、阿霉素(盐酸多柔比星)、双马来酸盐阿法替尼(Afatinib Dimaleate)、飞尼妥(Afinitor)(依维莫司)、奥康泽(Akynzeo)(奈妥吡坦(Netupitant)和盐酸帕洛诺司琼)、Aldara(咪喹莫特(Imiquimod))、阿地白介素(Aldesleukin)、艾乐替尼(Alecensa)(阿来替尼(Alectinib))、阿来替尼、阿仑珠单抗(Alemtuzumab)、力比泰(Alimta)(培美曲塞二钠(Pemetrexed Disodium))、Aliqopa(盐酸可泮利塞(Copanlisib Hydrochloride))、用于注射的爱克兰(Alkeran)(盐酸美法仑)、爱克兰片剂(美法仑)、Aloxi(盐酸帕洛诺司琼)、Alunbrig(布格替尼)、Ambochlorin(苯丁酸氮芥(Chlorambucil))、Amboclorin(苯丁酸氮芥)、氨磷汀(Amifostine)、氨基酮戊酸(Aminolevulinic Acid)、阿那曲唑(Anastrozole)、阿瑞匹坦(Acrepitant)、阿可达(Aredia)(帕米膦酸二钠(Pamidronate Disodium))、瑞宁得(阿那曲唑)、阿诺新(依西美坦)、Arranon(奈拉滨(Nelarabine))、三氧化二砷、Arzerra(奥法木单抗)、门冬酰胺酶菊欧文氏菌(Asparaginase Erwinia chrysanthemi)、阿特珠单抗、阿瓦斯丁(贝伐珠单抗)、阿维鲁单抗、阿基仑赛(Axicabtagene Ciloleucel)、阿昔替尼、阿扎胞苷、Bavencio(阿维鲁单抗)、BEACOPP、Becenum(卡莫司汀)、Beleodaq(贝利司他)、贝利司他、盐酸苯达莫司汀、BEP、Besponsa(伊珠单抗奥加米星)、贝伐珠单抗、贝沙罗汀、Bexxar(托西莫单抗(Tositummomab)和碘I 131托西莫单抗)、比卡鲁胺、BiCNU(卡莫司汀)、博来霉素、兰妥莫单抗、Blincyto(兰妥莫单抗)、硼替佐米、Bosulif(波舒替尼)、波舒替尼、本妥昔单抗-韦多汀)、布加替尼(Brigatinib)、BuMel、白消安(Busulfan)、Busulfex(白消安)、卡巴他赛、卡博替尼(Cabometyx)(苹果酸卡博替尼(Cabozantinib-S-Malate))、苹果酸卡博替尼、CAF、Calquence(阿卡替尼)、Campath(阿仑珠单抗)、Camptosar(盐酸依立替康)、卡培他滨(Capecitabine)、CAPOX、氟尿嘧啶(Carac)(氟尿嘧啶-外用的)、卡铂、卡铂-紫杉醇(CARBOPLATIN-TAXOL)、卡非佐米、Carmubris(卡莫司汀)、卡莫司汀、卡莫司汀植入物、康士得(比卡鲁胺)、CEM、色瑞替尼(Ceritinib)、Cerubidine(盐酸柔红霉素(Daunorubicin Hydrochloride))、希瑞适(Cervarix)(重组HPV二价疫苗)、西妥昔单抗、CEV、苯丁酸氮芥、苯丁酸氮芥-强的松、CHOP、顺铂、克拉立滨、克拉芬(环磷酰胺)、氯法拉宾、Clofarex(氯法拉滨)、Clolar(氯法拉滨)、CMF、考比替尼(Cobimetinib)、Cometriq(苹果酸卡博替尼)、盐酸可泮利塞、COPDAC、COPP、COPP-ABV、更生霉素(Cosmegen)(放线菌素D(Dactinomycin))、Cotellic(考比替尼(Cobimetinib))、克唑替尼(Crizotinib)、CVP、环磷酰胺、Cyfos(异环磷酰胺)、Cyramza(雷莫芦单抗)、阿糖胞苷、阿糖胞苷脂质体(CytarabineLiposome)、Cytosar-U(阿糖胞苷)、Cytoxan(环磷酰胺)、达拉非尼(Dabrafenib)、达卡巴嗪、Dacogen(地西他滨)、放线菌素D、达雷木单抗、Darzalex(达雷木单抗)、达沙替尼、盐酸柔红霉素、盐酸柔红霉素和阿糖胞苷脂质体、地西他滨、去纤苷钠(Defibrotide Sodium)、Defitelio(去纤苷钠)、地加瑞克、地尼白介素(Denileukin Diftitox)、地诺单抗(Denosumab)、DepoCyt(阿糖胞苷脂质体)、地塞米松、盐酸右雷佐生、地妥西单抗、多西他赛、Doxil(盐酸多柔比星脂质体)、盐酸多柔比星、盐酸多柔比星脂质体、Dox-SL(盐酸多柔比星脂质体)、DTIC-Dome(达卡巴嗪)、度伐利尤单抗(Durvalumab)、Efudex(氟尿嘧啶-外用的)、Elitek(拉布立酶)、Ellence(盐酸表柔比星)(Epirubicin Hydrochloride))、依洛珠单抗、乐沙定(奥沙利铂)、艾曲波帕(Eltrombopag Olamine)、Emend(阿瑞匹坦)、Empliciti(依洛珠单抗)、甲磺酸恩西地平(Enasidenib Mesylate)、恩扎卢胺(Enzalutamide)、盐酸表柔比星、EPOCH、艾比特思(Erbitux)(西妥昔单抗)、甲磺酸艾瑞布林(EribulinMesylate)、Erivedge(维莫德吉(Vismodegib))、盐酸厄洛替尼、Erwinaze(门冬酰胺酶菊欧文氏菌)、Ethyol(氨磷汀(Amifostine))、Etopophos(磷酸依托泊苷)、依托泊苷、磷酸依托泊苷、Evacet(盐酸多柔比星脂质体)、依维莫司、Evista(盐酸雷洛昔芬)、Evomela(盐酸美法仑)、依西美坦、5-FU(氟尿嘧啶注射液)、5-FU(氟尿嘧啶-外用的)、法乐通(托瑞米芬)、Farydak(帕比司他)、Faslodex(氟维司群)、FEC、弗隆(来曲唑)、非格司亭、福达华(磷酸氟达拉滨)、磷酸氟达拉滨、氟尿嘧啶(Fluoroplex)(氟尿嘧啶-外用的)、氟尿嘧啶注射液、氟尿嘧啶-外用的、氟他胺、Folex(甲氨蝶呤)、Folex PFS(甲氨蝶呤)、FOLFIRI、FOLFIRI-贝伐单抗、FOLFIRI-西妥昔单抗、FOLFIRINOX、FOLFOX、Folotyn(普拉曲沙)、FU-LV、氟维司群、佳达修(Gardasil)(重组HPV四价疫苗)、佳达修9(重组HPV九价疫苗)、Gazyva(奥滨尤妥珠单抗)、吉非替尼、盐酸吉西他滨、吉西他滨-顺铂、吉西他滨-奥沙利铂、吉妥珠单抗奥唑米星、健择(Gemzar)(盐酸吉西他滨)、Gilotrif(双马来酸阿法替尼)、Gleevec(甲磺酸伊马替尼)、Gliadel(卡莫司汀植入物)、Gliadel晶片(卡莫司汀植入物)、谷卡匹酶、醋酸戈舍瑞林、Halaven(甲磺酸艾立布林)、Hemangeol(盐酸普萘洛尔(Propranolol Hydrochloride)、赫赛汀(曲妥珠单抗)、重组HPV二价疫苗、重组HPV九价疫苗、重组HPV四价疫苗、和美新(盐酸拓扑替康)、Hydrrea(羟基脲)，羟基脲，Hyper-CVAD，爱博新(Ibrance)(哌柏西利(Palbociclib))、替伊莫单抗(Ibritumomab Tiuxetan)、依鲁替尼(Ibrutinib)、ICE、lclusig(盐酸帕纳替尼(Ponatinib Hydrochloride))、依达比星(Idamycin)(盐酸伊达比星(Idarubicin Hydrochloride))、盐酸伊达比星、艾德拉尼(Idelalisib)、Idhifa(甲磺酸恩西地平)、Ifex(异环磷酰胺)、异环磷酰胺、Ifosfamidum(异环磷酰胺)、IL-2(阿地白介素)、甲磺酸伊马替尼、伊布替尼(Imbruvica)(依鲁替尼)、英飞凡(Imfinzi)(度伐利尤单抗)、咪喹莫德、Imlygic(Talimogene Laherparepvec)、Inlyta(阿昔替尼)、奥英妥珠单抗(Inotuzumab Ozogamicin)、重组干扰素α-2b、白介素-2(阿地白介素)、内含子A(重组干扰素α-2b)、碘I 131托西莫单抗和托西莫单抗、伊匹木单抗、易瑞沙(吉非替尼)、盐酸依立替康、盐酸依立替康脂质体、Istodax(罗米地新)、伊沙匹隆、柠檬酸伊沙佐米(IxazomibCitrate)、Ixempra(伊沙匹隆)、Jakafi(磷酸鲁索替尼(Ruxolitinib Phosphate))、JEB、Jevtana(卡巴他赛)、Kadcyla(Ado-曲妥珠单抗-美坦新偶联物)、雷洛昔芬(Keoxifene)(盐酸雷洛昔芬(Raloxifene Hydrochloride))、凯望斯(帕利夫明)、可瑞达(Keytruda)(帕博利珠单抗(Pembrolizumab))、Kisqali(瑞博西尼(Ribociclib))、Kymriah(司利弗明(Tisagenlecleucel))、Kyprolis(卡非佐米)、醋酸兰瑞肽(Lanreotide Acetate)、二甲苯磺酸拉帕替尼、Lartruvo(奥拉单抗(Olaratumab))、来那度胺、甲磺酸乐伐替尼(Lenvatinib Mesylate)、Lenvima(甲磺酸乐伐替尼)、来曲唑、亚叶酸钙、留可然(苯丁酸氮芥)、醋酸亮丙瑞林、克拉屈滨(Leustatin)(克拉屈滨(Cladribine))、Levulan(氨基酮戊酸)、Linfolizin(苯丁酸氮芥)、LipoDox(盐酸多柔比星脂质体)、洛莫司汀、Lonsurf(曲氟尿苷和盐酸替匹嘧啶)、Lupron(醋酸亮丙瑞林(Leuprolide Acetate))、醋酸亮丙瑞林贮库型(Lupron Depot)(醋酸亮丙瑞林)、醋酸亮丙瑞林贮库型悬液(Lupron Depot-Ped)(醋酸亮丙瑞林)、Lynparza(奥拉帕利)、Marqibo(硫酸长春新碱脂质体)、Matulane(盐酸丙卡巴肼(ProcarbazineHydrochloride))、盐酸氮芥、醋酸甲地孕酮、Mekinist(曲美替尼(Trametinib))、美法仑、盐酸美法仑、巯嘌呤、美司钠、Mesnex(美司钠(Mesna))、替莫唑胺(Methazolastone)(替莫唑胺(Temozolomide))、甲氨蝶呤、甲氨蝶呤LPF(甲氨蝶呤)、溴甲钠曲酮、氨甲喋呤钠(Mexate)(甲氨蝶呤)、氨甲喋呤钠-AQ(甲氨蝶呤)、米哚妥林、丝裂霉素C、盐酸米托蒽醌、Mitozytrex(丝裂霉素C)、MOPP、Mozobil(普乐沙福)、氮芥(盐酸氮芥)、丝裂霉素(丝裂霉素C)、马利兰(白消安)、Mylosar(阿扎胞苷)、麦罗塔(吉妥珠单抗奥唑米星)、紫杉醇纳米粒子(紫杉醇白蛋白稳定的纳米粒子制剂)、诺维本(酒石酸长春瑞滨)、奈昔木单抗、奈拉滨、Neosar(环磷酰胺)、马来酸奈拉替尼、Nerlynx(马来酸奈拉替尼)、奈妥匹坦和盐酸帕洛司琼、Neulasta(培非司亭)、优保津(非格司亭)、多吉美(甲苯磺酸索拉非尼)、Nilandron(尼鲁米特)、尼洛替尼、尼鲁米特、Ninlaro(柠檬酸伊沙佐米)、甲苯磺酸尼拉帕尼一水合物、纳武利尤单抗(Nivolumab)、诺瓦得士(柠檬酸他莫昔芬)、Nplate(罗米司亭)、奥妥珠单抗、Odomzo(索尼德吉(Sonidegib))、OEPA、奥法木单抗、OFF、奥拉帕利、奥拉单抗、高三尖杉酯碱(Omacetaxine Mepesuccinate)、培门冬酶(Oncaspar)(培门冬酶(Pegaspargase))、盐酸昂丹司琼、Onivyde(盐酸依立替康脂质体)、Ontak(地尼白介素)、欧狄沃(Opdivo)(纳武单抗)、OPPA、奥西替尼(Osimertinib)、奥沙利铂、紫杉醇、紫杉醇白蛋白稳定的纳米粒子制剂、PAD、帕博西尼(Palbociclib)、帕利夫明、盐酸帕洛司琼、盐酸帕洛司琼和奈妥匹坦、帕米膦酸二钠、帕木单抗、帕比司他、Paraplat(卡铂)、伯尔定(卡铂)、盐酸帕唑帕尼、PCV、PEB、培门冬酶、聚乙二醇非格司亭(Pegfilgrastim)、聚乙二醇干扰素α-2b(Peginterferon Alfa-2b)、PEG-内含子(聚乙二醇干扰素α-2b)、帕博利珠单抗、培美曲塞二钠、Perjeta(培妥珠单抗)、培妥珠单抗、普拉替尼(Platinol)(顺铂(Cisplatin)、普拉替尼-AQ(顺铂)、普乐沙福、泊马度胺、Pomalyst(泊马度胺)、盐酸帕纳替尼、Portrazza(奈昔木单抗)、普拉曲沙、强的松、盐酸丙卡巴肼、Proleukin(阿地白介素(Aldesleukin))、Prolia(地诺单抗)、Promacta(艾曲泊帕(Eltrombopag Olamine))、盐酸普萘洛尔、Provenge(Sipuleucel-T)、Purinethol(巯基嘌呤)、Purixan(巯基嘌呤)、氯化镭223、盐酸雷洛昔芬、雷莫芦单抗、拉布立酶、R-CHOP、R-CVP、重组人乳头瘤病毒(HPV)二价疫苗、重组人乳头瘤病毒(HPV)九价疫苗、重组人乳头瘤病毒(HPV)四价疫苗、重组干扰素α-2b、瑞戈非尼、Relistor(溴化甲基纳曲酮)、R-EPOCH、Revlimid(来那度胺)、Rheumatex(甲氨蝶呤)、瑞博西尼(Ribociclib)、R-ICE、Rituxan(利妥昔单抗)、Rituxen-Hycela(利妥昔单抗和人透明质酸酶)、利妥昔单抗、利妥昔单抗和人透明质酸酶、盐酸罗拉匹坦、罗米地新、罗米司亭、Rubdomycin(盐酸柔红霉素)、Rubraca(樟磺酸瑞卡帕布(Rucaparib Camsylate))、樟磺酸瑞卡帕布、磷酸鲁索替尼、Rydapt(米哚妥林)、Sclerosol Intrapleural Aerosol(滑石)、司妥昔单抗、Sipuleucel-T、索马杜林贮库型(醋酸兰瑞肽)、索尼德吉(Sonidegib)、甲苯磺酸索拉非尼、Sprycel(达沙替尼)、STANFORD V、无菌滑石粉(滑石)、Steritalc(滑石)、Stivarga(瑞戈非尼)、苹果酸舒尼替尼、索坦(苹果酸舒尼替尼)、Sylatron(聚乙二醇干扰素α-2b)、Sylvant(司妥昔单抗)、Synribo(美琥他辛)、Tabloid(硫鸟嘌呤(Thioguanine))、TAC、Tafinlar(达拉非尼(Dabrafenib))、泰瑞沙(Tagrisso)(奥西替尼(Osimertinib))、滑石、Talimogene Laherparepvec、柠檬酸他莫昔芬、Tarabine PFS(阿糖胞苷)、特罗凯(Tarceva)(盐酸厄洛替尼)、Targretin(贝沙罗汀)、Tasigna(尼洛替尼)、紫杉醇(Taxol)(紫杉醇(Paclitaxel))、泰索帝(Taxotere)(多西他赛)、特善奇(Tecentriq)(阿特珠单抗)、Temodar(替莫唑胺)、替莫唑胺、坦西莫司、沙利度胺(Thalidomide)、Thalomid(沙利度胺(Thalidomide))、硫鸟嘌呤、塞替派(Thiotepa)、司利弗明(Tisagenlecleucel)、Tolak(氟尿嘧啶-外用的)、盐酸拓扑替康、托瑞米芬(Toremifene)、Torisel(坦西莫司)、托西莫单抗和碘I 131托西莫单抗、Totect(盐酸右雷佐生)、TPF、曲贝替定(Trabectedin)、曲美替尼、曲妥珠单抗、Treanda(盐酸苯达莫司汀)、曲氟尿苷和盐酸替匹嘧啶(TipiracilHydrochloride)、Trisenox(三氧化二砷(Arsenic Trioxide))、Tykerb(二甲苯磺酸拉帕替尼)、Unituxin(达妥昔单抗(Dinutuximab))、三醋酸尿苷、VAC、戊柔比星(Valrubicin)、Valstar(戊柔比星)、凡德他尼(Vandetanib)、VAMP、Varubi(盐酸罗拉匹坦)、Vectibix(帕尼单抗)、VeIP、Velban(硫酸长春碱)、Velcade(硼替佐米)、Velsar(硫酸长春碱)、维莫非尼(Vemurafenib)、Venclexta(维奈托克(Venetoclax))、维奈托克、Verzenio(阿贝西尼)、Viadur(醋酸亮丙瑞林)、Vidaza(阿扎胞苷(Azacitidine))、硫酸长春碱、硫酸长春新碱注射剂(Vincasar PFS)(硫酸长春新碱)、硫酸长春新碱、硫酸长春新碱脂质体、酒石酸长春瑞滨、VIP、维莫德吉、Vistogard(三醋酸尿苷)、Voraxaze(谷卡匹酶)、伏林司他、Votrient(盐酸帕唑帕尼)、Vyxeos(盐酸柔红霉素和阿糖胞苷脂质体)、Wellcovorin(亚叶酸钙(Leucovorin Calcium))、Xalkori(克唑替尼)、希罗达(Xeloda)(卡培他滨)、XELIRI、XELOX、Xgeva(地诺单抗)、Xofigo(二氯化镭223)、Xtandi(恩扎卢胺)、Yervoy(伊匹木单抗)、Yescarta(阿基仑赛(Axicabtagene Ciloleucel))、Yondelis(曲贝替定)、Zaltrap(Ziv-阿柏西普)、Zarxio(非格司亭)、Zejula(甲苯磺酸尼拉帕尼一水合物)、Zelboraf(维莫非尼)、泽娃灵(Zevalin)(替伊莫单抗)、Zinecard(盐酸右雷佐生)、Ziv-阿柏西普(Ziv-Aflibercept)、枢复宁(Zofran)(盐酸昂丹司琼)、诺雷德(Zoladex)(醋酸戈舍瑞林)、唑来膦酸(Zoledronic Acid)、Zolinza(伏林司他)、择泰(Zometa)(唑来膦酸)、Zydelig(艾德拉尼)、Zykadia(色瑞替尼)和Zytiga(醋酸阿比特龙)。

EBV感染也与多种自身免疫性疾病的发展/进展有关，如多发性硬化症和系统性红斑狼疮(SLE；参见例如Ascherio和Munger Curr Top Microbiol Immunol.(2015)；390(Pt1):365-85)，并且EBV抗原EBNA2最近被证明与作为SLE、多发性硬化症、类风湿性关节炎、炎症性肠病、1型糖尿病、青少年特发性关节炎和乳糜泻发展的危险因素所涉及的遗传区域相关(Harley等人,Nat Genet.(2018)50(5):699–707)。

因此，在一些实施方案中，根据本公开待治疗/预防的疾病/病况选自：自身免疫性疾病、SLE、多发性硬化症、类风湿性关节炎、炎症性肠病、1型糖尿病、青少年特发性关节炎和乳糜泻。

本公开的方面和实施方案涉及表达CAR的病毒特异性免疫细胞，其包含一种或多种对多于一种不相同靶抗原有特异性的CAR。在一些实施方案中，包含对CD30有特异性的CAR的病毒特异性免疫细胞包含对除CD30之外的抗原有特异性的CAR。例如，本文的实施例4描述了包含CD30特异性CAR和CD19特异性CAR的病毒特异性免疫细胞。

在一些实施方案中，根据本发明待治疗/预防的癌症是包含表达一种或多种不相同靶抗原的细胞的癌症。在一些实施方案中，癌症是表达两种不相同靶抗原的癌症。

与治疗/预防同种反应性免疫应答有关的应用

本公开的表达CAR的病毒特异性免疫细胞和组合物可用于涉及同种异体移植的方法，例如治疗/预防受试者的疾病/病况。

本公开的表达CAR的病毒特异性免疫细胞和组合物可用于减少/预防同种反应性免疫应答(特别是T细胞介导的同种反应性应答)及其有害后果的方法。

同种反应性T细胞表达CD30。Chan等人,J Immunol(2002)169(4):1784-91将表达CD30的T细胞鉴定为激活的T细胞的亚群(也表达CD25和CD45RO)，其在CD30同种免疫应答中具有重要作用。CD30表达和表达CD30的T细胞的增殖随着对同种抗原的应答而增加。Chen等人,Blood(2012)120(3):691-6将在CD8+T细胞亚群上的CD30表达鉴定为GVHD的潜在生物标志物，并提出CD30作为GVHD的治疗靶标。

此外，与多克隆激活的T细胞(ATC)相比，病毒特异性T细胞具有更受限制的TCR库，并因此在施用给同种异体受试者后不太可能引起GVHD。这反映在同种异体EBV特异性T细胞(EBVST)研究中GVHD的低发病率。

本公开的表达CAR的病毒特异性免疫细胞和组合物在涉及同种异体移植的方法中以及在同种异体移植物的加工/生产中特别有用。

特别地，设想表达CAR的病毒特异性免疫细胞和组合物用于生产和施用“现成”材料，用于包括施用同种异体材料的治疗和预防方法。

如上所述，本公开的表达CAR的病毒特异性免疫细胞可用于通过过继细胞转移来治疗/预防疾病/病况。本公开的表达CAR的病毒特异性免疫细胞在过继转移后对接受体的T细胞介导的同种反应性免疫应答不太敏感，并因此在转移后的受体中表现出增强的增殖/存活，以及优越的治疗/预防效果。

本公开的表达CAR的病毒特异性免疫细胞和组合物也可用于包括同种异体细胞的同种异体移植的方法，所述同种异体细胞

在这样的方法中，表达CAR的病毒特异性免疫细胞和组合物可用于调节供体和/或接受体受试者，和/或处理同种异体移植以减少/防止同种异体移植后的同种反应性免疫应答。

待同种异体移植的细胞、组织和器官包括例如免疫细胞(例如过继细胞移植)、心脏、肺、肾、肝、胰脏、肠、面部、角膜、皮肤、造血干细胞(骨髓)、血液、手、腿、阴茎、骨、子宫、胸腺、胰岛、心脏瓣膜和卵巢。待同种异体移植的细胞、组织或器官群体可称为“同种异体移植物”。

通过同种异体移植进行治疗/预防的疾病/病况可以是从同种异体移植获得治疗或预防益处的任何疾病/病况。在一些实施方案中，通过同种异体移植进行治疗/预防的疾病/病况可以是例如T细胞功能失调性病症、癌症、传染病或自身免疫性疾病。

T细胞功能失调性疾病可以是其中正常T细胞功能受损导致受试者对病原抗原的免疫应答下调的疾病/病况，所述病原抗原例如由外源性试剂例如微生物、细菌和病毒的感染所生成的，或在某些疾病状态下由宿主产生，例如在某些形式的癌症中(例如以肿瘤相关抗原的形式)。T细胞功能失调性病症可包括T细胞耗竭或T细胞无能。T细胞耗竭包括其中CD8+T细胞未能增殖或发挥T细胞效应子功能的状态，如响应于抗原刺激的细胞毒性和细胞因子(例如IFNγ)分泌。耗竭的T细胞还可以通过持续表达T细胞耗竭的一种或多种标志物来表征，例如PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3。T细胞失调性病症可以表现为感染，或无法针对感染产生有效的免疫应答。感染可以是慢性、持续的、潜伏的或缓慢的，并且可以是细菌、病毒、真菌或寄生虫感染的结果。因此，可以向患有细菌、病毒或真菌感染的患者提供治疗。细菌感染的实例包括幽门螺杆菌的感染。病毒感染的实例包括HIV、乙型肝炎或丙型肝炎的感染。T细胞功能失调性病症可能与癌症有关，如肿瘤免疫逃逸。许多人类肿瘤表达被T细胞识别并能够诱导免疫应答的肿瘤相关抗原。

传染病可以是例如细菌、病毒、真菌或寄生虫感染。在一些实施方案中，可能特别希望治疗慢性/持续性感染，例如在这种感染与T细胞功能失调或T细胞耗竭相关的情况下。众所周知，T细胞耗竭是一种T细胞功能失调状态，在许多慢性感染(包括病毒、细菌和寄生虫)以及癌症中出现(Wherry Nature Immunology Vol.12,No.6,p492-499,June 2011)。可以治疗的细菌感染的实例包括由芽孢杆菌属物种(Bacillus spp.)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、梭菌属物种(Clostridium spp.)、棒状杆菌属物种(Corynebacterium spp.)、霍乱弧菌(Vibrio chloerae)、葡萄球菌属物种(Staphylococcus spp.)、链球菌属物种(Streptococcus spp.)、埃希氏菌属(Escherichia)、克雷伯菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、耶尔森菌属(Yersinia)、埃温氏菌属(Erwina)、沙门氏菌属(Salmonella)、李斯特菌属物种(Listeriasp)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、分枝杆菌属(mycobacteria)(例如结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis))和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)引起的感染。例如，细菌感染可以是败血症或肺结核。可以治疗的病毒感染的实例包括流感病毒、麻疹病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、单纯疱疹病毒和人乳头瘤病毒(HPV)的感染。可以治疗的真菌感染的实例包括链格孢属物种(Alternaria sp)、曲霉属物种(Aspergillus sp)、念珠菌属物种(Candida sp)和组织浆菌属物种(Histoplasma sp)的感染。真菌感染可以是真菌败血症或组织胞浆菌病。可以治疗的寄生虫感染的实例包括疟原虫物种的感染(例如恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、约氏疟原虫(Plasmodium yoeli)、卵形疟原虫(Plasmodiumovale)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)或夏博迪疟原虫(Plasmodium chabaudichabaudi))。寄生虫感染可以是一种疾病，如疟疾、利什曼病和弓形虫病。

在一些实施方案中，疾病/病况是自身免疫性疾病。在这样的实施方案中，治疗可以旨在减少自身免疫效应细胞的数量。在一些实施方案中，自身免疫性疾病选自：1型糖尿病、乳糜泻、格雷夫斯病、炎症性肠病、多发性硬化症、银屑病、类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮。

本公开的表达CAR的病毒特异性免疫细胞和组合物也可用于治疗/预防同种反应性免疫应答和以同种反应性应答为特征的疾病/病况。

以同种反应性免疫应答为特征的疾病和病况包括由与同种异体移植相关的同种反应性免疫应答引起或加剧的疾病/病况。这类疾病/病况包括移植物抗宿主病(GVHD)和移植物排斥，并且详细描述在Perkey和Maillard Annu Rev Pathol.(2018)13:219-245中，通过引用将其整体并入本文。

移植物抗宿主病(GVHD)可以发生在大量供体免疫细胞的同种异体移植之后，并且涉及供体来源的免疫细胞针对同种异体接受体细胞/组织/器官的反应性。移植物排斥是指移植后接受体的免疫系统对移植的细胞/组织/器官的破坏。在移植物排斥属于同种异体移植物的情况下，可称为同种异体移植物排斥。

本公开的表达CAR的病毒特异性免疫细胞和组合物可用于清除同种异体移植物中的同种反应性T细胞，否则在同种异体移植后可能导致接受体中的移植物抗宿主病(GVHD)。

本公开的表达CAR的病毒特异性免疫细胞和组合物可用于清除相对于同种异体移植物而言的供体中的同种反应性T细胞(例如在收获/收集同种异体移植物之前)，否则在同种异体移植时可能导致接受体中的GVHD。

本公开的表达CAR的病毒特异性免疫细胞和组合物可用于清除相对于同种异体移植物而言的受体中的同种反应性T细胞，否则可能导致/促进移植物排斥。

本公开提供了治疗/预防同种异体移植后移植物抗宿主病(GVHD)的方法，所述方法包括将根据本公开的表达CAR的病毒特异性免疫细胞或组合物施用给相对于同种异体移植物而言的供体受试者。本公开还提供了在同种异体移植后治疗/预防移植物抗宿主病(GVHD)的方法，所述方法包括使同种异体移植物与根据本公开的表达CAR的病毒特异性免疫细胞或组合物接触。这种方法的目的是降低/去除同种异体移植中的同种反应性免疫细胞对相对于同种异体移植物而言的接受体的细胞、组织和/或器官产生同种反应免疫应答的能力。

本公开提供了治疗/预防同种异体移植后移植物排斥的方法，所述方法包括将根据本公开的表达CAR的病毒特异性免疫细胞或组合物施用给相对于同种异体移植物而言的接受体受试者。这些方法的目的是降低/去除接受体受试者对同种异体移植物产生同种反应性免疫应答的能力。表达CAR的病毒特异性免疫细胞可用于消除接受体中的免疫细胞，否则免疫细胞会针对供体细胞、组织和/或器官产生同种反应性免疫应答。

本公开提供了包括清除同种异体移植物的同种反应性免疫细胞(例如，同种反应性T细胞)的方法，所述方法包括使同种异体移植物(例如，待移植的细胞、组织或器官群体)与本公开的表达CAR的病毒特异性免疫细胞或组合物接触。所述方法可包括将本公开的表达CAR的病毒特异性免疫细胞或组合物施用给相对于同种异体移植物而言的供体受试者。这种方法的目的是降低/去除同种异体移植物中的同种反应性免疫细胞对相对于同种异体移植物而言的接受体的细胞、组织和/或器官产生同种反应免疫应答的能力。

在一些实施方案中，所述方法包括以下中的一个或多个：

从受试者获得/收集细胞群体、组织或器官；

使细胞群体、组织或器官与根据本公开的表达CAR的病毒特异性免疫细胞或组合物接触；

在根据本公开的表达CAR的病毒特异性免疫细胞存在下体外或离体培养细胞群体、组织或器官；

收获/收集清除了同种反应性免疫细胞的细胞群体、组织或器官；和

向受试者移植/施用清除了同种反应性免疫细胞的细胞群体、组织或器官。

本公开还提供了包括清除受试者的同种反应性免疫细胞(例如同种反应性T细胞)的方法，所述方法包括向受试者施用本公开的表达CAR的病毒特异性免疫细胞或组合物。受试者可以是相对于同种异体移植物而言的供体受试者，也可以是相对于同种异体移植物而言的预期接受体受试者。

在一些实施方案中，所述方法包括以下中的一个或多个：

向受试者施用根据本公开的表达CAR的病毒特异性免疫细胞或组合物，以清除受试者中的同种反应性免疫细胞；

从施用了根据本公开的表达CAR的病毒特异性免疫细胞或组合物的受试者获得/收集细胞群体、组织或器官；和

向受试者移植/施用清除了同种反应性免疫细胞的细胞群体、组织或器官。

在一些实施方案中，所述方法包括以下中的一个或多个：

向受试者施用根据本公开的表达CAR的病毒特异性免疫细胞或组合物，以清除受试者中的同种反应性免疫细胞；和

向先前已经施用了根据本公开的表达CAR的病毒特异性免疫细胞或组合物的受试者移植/施用细胞群体、组织或器官。

同种反应性免疫细胞的清除可导致同种异体移植物或受试者中同种异体反应免疫细胞的数量减少例如2倍、10倍、100倍、1000倍、10000倍或更大。

方法可以在体外或离体，或在受试者体内进行。体外或离体进行的方法步骤可以包括体外或离体细胞培养。

方法可以进一步包括根据本公开的用于生产表达CAR的病毒特异性免疫细胞和组合物的方法步骤。

在一些实施方案中，向相对于同种异体移植的接受体受试者施用根据本公开的表达CAR的病毒特异性免疫细胞或组合物和同种异体移植是同时进行的(即在同一时间，或在例如1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时、12小时、24小时、36小时或48小时内)。

在一些实施方案中，向对于同种异体移植的接受体受试者施用根据本公开的表达CAR的病毒特异性免疫细胞或组合物和同种异体移植是顺序进行的。施用表达CAR的病毒特异性免疫细胞或组合物与同种异体移植之间的时间间隔可以是任何时间间隔，包括数小时、数天、数周、数月或数年。表达CAR的病毒特异性免疫细胞或组合物可在同种异体移植之前或之后施用给接受体受试者。表达CAR的病毒特异性免疫细胞或组合物优选地在同种异体移植之前施用给接受体受试者。

在一些实施方案中，向相对于同种异体移植而言的供体受试者施用根据本公开的表达CAR的病毒特异性免疫细胞或组合物和从所述受试者收集同种异体移植物(即收集细胞、组织和/或器官)是同时进行的(即在同一时间，或在例如1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时、12小时、24小时、36小时或48小时内)。在一些实施方案中，向相对于同种异体移植而言的供体受试者施用根据本公开的表达CAR的病毒特异性免疫细胞或组合物和从所述受试者收集同种异体移植物(即收集细胞、组织和/或器官)是按顺序进行的。施用表达CAR的病毒特异性免疫细胞或组合物与收集同种异体移植物之间的时间间隔可以是任何时间间隔，包括数小时、数天、数周、数月或数年。表达CAR的病毒特异性免疫细胞或组合物可在收集同种异体移植物之前或之后施用给供体受试者。表达CAR的病毒特异性免疫细胞或组合物优选地在收集同种异体移植物之前施用给供体受试者。

在一些实施方案中，所述方法包括额外的干预以治疗/预防同种反应性免疫应答、移植物排斥和/或GVHD。

在一些实施方案中，治疗/预防同种反应性、移植物排斥和/或GVHD的方法包括施用免疫抑制和/或淋巴细胞清除性疗法，例如用皮质类固醇(例如泼尼松、氢化可的松)、钙调神经磷酸酶抑制剂(例如环孢菌素、他克莫司)、抗增殖剂(例如硫唑嘌呤、麦考酚酸)和/或mTOR抑制剂(例如西罗莫司、依维莫司)的治疗。

在一些实施方案中，治疗/预防同种反应性和/或移植物排斥的方法包括抗体疗法，例如用单克隆抗IL-2Rα受体抗体(例如，巴利昔单抗、达利珠单抗)、抗T细胞抗体(例如抗胸腺细胞球蛋白、抗淋巴细胞球蛋白)和/或抗CD20抗体(例如利妥昔单抗)的治疗。

在一些实施方案中，治疗/预防同种反应性和/或移植物排斥的方法包括输血和/或骨髓移植。

在本文公开方法的情况下，本公开还提供了用于这种方法的本公开的表达CAR的病毒特异性免疫细胞和组合物。还提供了本公开的表达CAR的病毒特异性免疫细胞或组合物在制备用于这种方法的产品(例如药物)中的用途。

在一些实施方案中，与使用免疫抑制剂的方法相比，本公开的各个方面的方法引起非同种反应性免疫细胞的更少的清除和/或增加的存活。例如，本发明的方法可用于在相对于同种异体移植物而言的接受体受试者中或在同种异体移动物中保存/维持非同种反应性免疫细胞隔室。

在包括同种异体移植的本公开的方法的一些实施方案中，与涉及用免疫抑制剂治疗的方法相比，本发明的方法与相对于同种异体移植物而言的接受体受试者中非同种反应性免疫细胞的增加的数量/比率有关。在包括用于同种异体免疫细胞的过继转移的本公开的方法的一些实施方案中，与涉及用免疫抑制剂治疗的方法相比，本发明的方法与相对于同种异体免疫细胞而言的接受体受试者中非同种反应性免疫细胞的增加的数量/比率有关。

在包括同种异体移植的本公开的方法的一些实施方案中，与涉及用免疫抑制剂治疗的方法相比，本发明的方法与同种异体移植物中非同种反应性免疫细胞的增加的数量/比率有关。

本公开还提供了本公开的表达CAR的病毒特异性免疫细胞或组合物，用于以下方法：

杀死表达CAR对其有特异性的靶抗原的细胞(例如表达CD30的细胞)；

杀死感染病毒特异性免疫细胞对其有特异性的病毒的细胞或呈递所述病毒的抗原的肽的细胞(例如感染EBV或呈递EBV抗原的肽的细胞)；和/或

杀死同种反应性免疫细胞(例如表达CD30的T细胞)。

本公开还提供了这类表达CAR的病毒特异性免疫细胞和组合物在这类方法中的用途，以及使用表达CAR病毒特异性的免疫细胞和组合物达到这种目的的方法。

受试者

根据本公开各方面的受试者可以是任何动物或人类。受试者优选地是哺乳动物，更优选地是人类。受试者可以是非人类哺乳动物，但更优选地是人类。受试者可以是男性或女性。受试者可以是患者。受试者可以已被诊断患有本文所述的需要治疗的疾病/病况，可以被怀疑患有这种疾病/病况，或可以有发展/感染这种疾病/病况的风险。

在根据本公开的实施方案中，受试者优选地是人类受试者。在一些实施方案中，根据本公开的治疗或预防方法待治疗的受试者是患有本文所述疾病/病况或有发展本文所述疾病/病况的风险的受试者。在根据本发明的实施方案中，可以根据基于对这种疾病/病况的某些标志物的表征的方法来选择受试者进行治疗。

就根据本公开的干预而言，受试者可以是同种异体受试者。根据本公开待治疗/预防的受试者可以与表达CAR的病毒特异性免疫细胞所来源的受试者在基因上不相同。根据本公开待治疗/预防的受试者可以相对于表达CAR的病毒特异性免疫细胞所来源的受试者是HLA不匹配的。根据本公开待治疗/预防的受试者可以相对于表达CAR的病毒特异性免疫细胞所来源的受试者是HLA匹配的。

根据本公开向其施用细胞的受试者可以是相对于细胞所来源是同种异体/非自体的。向其施用细胞的受试者可以是与从其获得细胞以生产待施用细胞的受试者是不同的受试者。向其施用细胞的受试者可以是与从其获得细胞以生产待施用细胞的受试者在基因上不相同的。

向其施用细胞的受试者可以包含编码MHC/HLA分子的MHC/HLA基因，所述MHC/HLA分子与从其获得细胞以生产待施用细胞的受试者的MHC/HLA基因所编码的MHC/HLA分子是不相同的。向其施用细胞的受试者可以包含编码MHC/HLA分子的MHC/HLA基因，所述MHC/HLA分子与从其获得细胞以生产待施用细胞的受试者的MHC/HLA基因所编码的MHC/HLA分子是相同的。

在一些实施方案中，向其施用细胞的受试者相对于从其获得细胞以生产待施用细胞的受试者是HLA匹配的。在一些实施方案中，向其施用细胞的受试者相对于从其获得细胞以生产待施用细胞的受试者是接近或完全的HLA匹配。

在一些实施方案中，受试者是在HLA-A、-B、-C和-DRB1之间≥4/8(即4/8、5/8、6/8、7/8或8/8)匹配。在一些实施方案中，受试者是在HLA-A、-B、-C、-DRB1和-DQB1之间≥5/10(即5/10、6/10、7/10、8/10、9/10或10/10)匹配。在一些实施方案中，受试者是在HLA-A、-B、-C、-DRB1、-DQB1和-DPB1之间≥6/12(即6/12、7/12、8/12、9/12、10/12、11/12或12/12)匹配。在一些实施方案中，受试者是在HLA-A、-B、-C和-DRB1之间8/8匹配。在一些实施方案中，受试者是在HLA-A、-B、-C、-DRB1和-DQB1之间10/10匹配。在一些实施方案中，受试者是在HLA-A、-B、-C、-DRB1、-DQB1和-DPB1之间12/12匹配。

序列同一性

用于确定两个或更多个氨基酸或核酸序列之间的同一性百分比的成对和多序列比对可以以本领域技术人员已知的各种方式实现，例如，使用公开可用的计算机软件，例如ClustalOmega(

序列

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本发明包括所描述的方面和优选特征的组合，除非这种组合是明显不允许或明确避免的。

本文使用的章节标题仅用于组织目的，不得解释为限制所述主题。

现在将参照附图以示例的方式说明本发明的各方面和实施方案。进一步的方面和实施方案对于本领域的技术人员将是显而易见的。本文中提及的所有文件通过引用并入本文。

在整个说明书中，包括随后的权利要求书，除非上下文另有要求，否则“包括”一词以及诸如“包含”和“含有”的变体将被理解为意味着包含所述整数或步骤或者整数或步骤的组，而不排除任何其他整数或步骤或者整数或步骤的组。

必须注意的是，在说明书和所附权利要求中使用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数引用，除非上下文另有明确规定。范围在本文中可以表示为从“约”一个特定值，和/或到“约”另一特定值。当表达这样的范围时，另一个实施方案包括从一个特定值和/或到另一个特定的值。类似地，当值被表示为近似值时，通过使用先行词“约”，将理解为特定值形成另一个实施方案。

在本文公开核酸序列的情况下，也明确考虑其反向互补物。

本文所述的方法可以在体外或体内进行。在一些实施方案中，本文所述的方法在体外进行。术语“体外”旨在涵盖培养中细胞的实验，而术语“体内”旨在涵盖完整的多细胞生物体的实验。

附图说明

现在将参考附图讨论说明本发明原理的实施方案和实验。

图1.散点图显示细胞的HLA-A2和CD3表达，所述细胞通过以下培养7天获得：在来源于HLA-A2阳性受试者的未转导的EBVST(左上图)或来源于HLA-A2-阳性受试者的CD30-CAR构建体转导的EBVST(右上图)；或者通过将来源于HLA-A2阴性受试者的同种反应性T细胞与来源于HLA-A2-阳性受试者的未转导的EBVST(左下图)或与来源于HLA-A1阳性受试物的CD30-CAR构建体转导的EBVST(右下图)共培养7天后。

图2A和2B.条形图显示7天后(图2A)EBVST(即CD3+、HLA-A2阳性)和(图2B)同种反应性T细胞(即CD3+、HLA-A2阴性)的细胞计数。

图3.散点图显示在共培养7天后获得的细胞中HLA-A2和CD71表达，共培养包括：HLA-A2阳性PBMC与未转导的(NT；左上图)、与CD30-CAR构建体转导的(CD30.CAR；右上图)、与CD19-CAR构建体转导的(CD19.CAR；左下图)，或来源于HLA-A2阴性受试者的CD30-CAR和CD19-CAR构建体转导的(CD30+CD19.CAR；右下图)EBVST。

图4.显示从4名代表性供体的血液样品制备的CD30.CAR EBVST增殖的图。该图显示了在培养物中生长的细胞的累积倍数扩增。

图5A和5B.显示CD30.CAR EBVST对(图5A)CD30阴性BJAB伯基特淋巴瘤细胞和(图5B)CD30阳性HDLM2霍奇金淋巴瘤细胞的细胞毒性的图，如通过

图6A和6B.显示通过ELISpot分析测定的，从取自4名代表性供体的血液样品制备的CD30.CAR EBVST对EBV抗原的反应性的图。用EBV潜伏抗原的肽(潜伏)、EBV裂解抗原的肽(Lytic)刺激细胞或不用抗原刺激细胞(阴性)，并测定每5×10

图7.显示输注CD30.CAR EBVST前和输注后6周对患者#1进行PET扫描结果的代表性图像。

图8.显示输注CD30.CAR EBVST前和输注后6周对患者#2进行PET和CT扫描结果的代表性图像。

图9.显示在输注CD30.CAR EBVST之前(前)和输注后指定时间获得的血液样品中，通过qRT-PCR测定的外周血细胞中载体拷贝数的表。

图10.条形图，显示了通过ELISpot分析测定的，患者#1外周血中，在淋巴细胞清除前(LD前)和输注CD30.CAR EBVST后指定时间段，细胞对于不同抗原的特异性分析结果。用EBV潜伏抗原肽(潜伏)、EBV裂解抗原的肽(裂解)、其他病毒抗原的肽(其他病毒)、肿瘤相关抗原的肽(TAA)或不用刺激抗原(无pepmix)刺激在指定时间点从血液样品中分离的PBMC，并测定每3x 10

图11A和11B.条形图显示了通过ELISpot分析测定的，针对不同抗原通过不同方法制备的CD30.CAR EBVST的分析结果。通过包括在(图11A)FBS或(图11B)HPL存在下培养的方法制备的、CD30.CAR EBVST(CD30.CAR)或未用编码CD30.CAR的逆转录病毒转导的等效细胞(未转导)用所指示的EBV抗原(EBNA1、LMP1、LMP2)的pepmix刺激，或未用病毒肽刺激(阴性)，并确定每5×10

实施例

在下面的实施例中，本发明人描述了表达CD30.CAR的EBVST的生成，它们针对癌症细胞的效应子活性和它们对同种异体排斥的抗性。

实施例1：编码CAR构建体的逆转录病毒的生成

通过将编码CAR的cDNA克隆到pSFG-TGFbDNRII逆转录病毒骨架(ATUM，Newark，CA)中来制备编码CD30.CAR构建体的逆转录病毒。

使用聚乙烯亚胺(PEI)将携带CD30.CAR序列的质粒pSFG_CD30CAR转染到HEK293Vec-RD114细胞中。然后使用来自转染细胞的细胞培养上清液转导6孔板中的HEK293Vec-Galv细胞(BioVec Pharma，Quebec，Canada)，细胞的密度为5×10

将293Vec-Galv_CD30-CAR细胞进行胰蛋白酶消化，并将细胞以2x 10

通过将编码CD19.CAR的DNA克隆到pSFG逆转录病毒骨架中而产生编码CD19.CAR构建体的逆转录病毒。使用聚乙烯亚胺(PEI)，将携带CD19.CAR序列的质粒85bCD19C用于转染HEK 293Vec-RD114细胞。随后收集含有逆转录病毒的上清液，过滤并在-80℃储存，直至使用。

实施例2：表达CAR的EBV特异性T细胞的生成

根据标准Ficoll-Paque密度梯度离心法从健康供体或淋巴瘤患者的血液样品中分离外周血单核细胞(PBMC)。

ATC的生成

通过添加0.5ml的1:1000稀释的1mg/ml抗体，并在37℃孵育2-4hr或在4℃孵育过夜，将抗CD3(克隆OKT3)和抗CD28激动剂抗体包被到组织培养板的孔上。通过在细胞培养基(含有44.5％高级RPMI培养基、44.5％Click’s培养基、10％FBS和1％GlutaMax)中在抗CD3/CD28激动剂抗体包被板上的培养来刺激1x 10

通用LCL

通过在通过B细胞的EBV转化制备的淋巴母细胞系的细胞中靶向敲除编码HLA I类或HLA II类分子的基因来获得缺乏HLA I类和HLA II类表面表达的LCL(即HLA阴性LCL)。HLA阴性细胞被进一步修饰为敲除EBV复制所需的基因。通过所述方法获得的所得细胞在本文中被称为通用LCL(uLCL)。

EBV特异性T细胞(EBVST)的扩增和转导

通过使用CD45RA MACS微珠(Miltenyi Biotec)的磁性细胞分离来清除来自健康供体的PBMC中的表达CD45RA的细胞。在含有44.5-47％高级RPMI、44.5-47％Click’s培养基、10％FBS或5％富含生长因子的添加剂和1％谷氨酰胺、补充有IL-7(10ng/ml)和IL-15(10ng/ml)的细胞培养基中，通过用从JPT Technologies获得的EBNA1 pepmix(JPT目录号PM-EBV-EBNA1)、LMP1 pepmix(JPT目录号PM-EBV-LMP1)和LMP2pepmix(JPT目录号PM-EBV-LMP2)(由11个氨基酸重叠的重叠性15mer氨基酸肽库，跨越相关抗原的完整氨基酸序列)刺激2x 10

4-6天后，用实施例1中描述的编码CAR的逆转录病毒转导EBVST，如下所述。

将含有逆转录病毒的上清液(0.5-1ml/孔)加入用RetroNectin(Takara)预包被的非组织培养处理的24孔板中。将平板以2000×g离心60-90min后，取出逆转录病毒上清液，并以0.25-0.5x 10

培养8-10天后，通过在uLCL存在下与经辐照的肽脉冲的自体激活T细胞(ATC)的共培养来重新刺激细胞。简言之，将2x 10

为了在培养中维持EBVST，每2-4天，根据需要补充细胞培养基和细胞因子，或者收获EBVST并将其重新铺板在含有细胞因子的新鲜细胞培养基中。在第15-20天之间收获EBVST并将其用于混合的淋巴细胞反应(MLR)测定法中。

实施例3：CD30特异性CAR消除同种反应性T细胞和保护同种异体VST免受排斥的能

本发明人研究了CD30.CAR表达对VST的体外抗同种异体排斥能力的影响。

引发的同种反应性T细胞的产生

来自用于生成EBVST的同一健康供体的1-2x 10

为了在体外评估同种异体排斥反应，将来自HLA-A2阴性受试者的0.2x 10

(i)由HLA-A2阳性受试者的PBMC产生的0.2x 10

(ii)由HLA-A2阳性受试者的PBMC产生的0.2×10

将人IL-7(10ng/ml)和IL-15(10ng/ml)加入MLR测定法中。

7天后进行流式细胞术分析，并使用计数珠来测定绝对细胞数。来自不同受试者的T细胞可以在基于HLA-A2表达的共培养后获得的群体中鉴定。Gallios流式细胞仪(BeckmanColter)用于捕获事件，Kaluza分析软件(Beckman Culter)用于数据分析和图形表示。

如图1所示，与在不存在同种反应性T细胞的情况下培养时(左上图)相比，来源于HLA-A2阳性受试者的未转导(NT)EBVST的数量在与来源于HLA-A2阴性受试者的同种反应性T细胞共培养7天后大大减少(左下图)。相反，与在不存在同种反应性T细胞的情况下培养时(右上图)相比，CD30.CAR EBVST的数量在与同种反应性T细胞共培养7天后增加(右下图)。

图2显示了流式细胞术数据的定量。未转导的EBVST(NT)大多在同种反应性T细胞存在的情况下被消除，而表达CD30.CAR的EBVST对同种反应性T细胞的消除具有抗性(图2A)。此外，对同种反应性T细胞群体(CD3+，HLA-A2阴性)的定量显示，相对于未转导的EBVST条件，CD30.CAR EBVST减少了同种反应性T细胞的数量(图2B)。

因此，表达CD30.CAR的EBVST被证明具有减少同种反应性T细胞数量并被保护免受同种排斥的能力。

实施例4：表达CD19特异性CAR和CD30特异性CAR的EBV特异性T细胞的表征

本发明人制备并表征了经工程化为表达CD19.CAR和CD30.CAR两者的病毒特异性T细胞，并检查了它们是否可以在混合的淋巴细胞反应中消除同种反应性T细胞。

简言之，在混合的淋巴细胞反应(MLR)测定法中，将来自清除了表达CD19和CD56的细胞的HLA-A2阳性受试者的1x 10

(i)从HLA-A2阴性受试者的PBMC生成的0.1x 10

(ii)从HLA-A2阴性受试者的PBMC生成的0.1x 10

将人IL-2以20IU/ml加入MLR测定法中。

如图3所示，与未转导的(NT)EBVST(左上图)和CD19.CAR EBVST(左下图)相比，CD30.CAR EBVT(右上图)和CD30+CD19.CAR EBVST(右下图)两者在第7天大大降低了HLA-A2+同种反应性T细胞(通过激活标志物CD71区分)的比率(从而避免了排斥)。

因此，本发明人提供了一种新的方法，使用用对靶抗原(本实施例中为CD19)有特异性的CAR和CD30特异性CAR转导的EBVST来生成对给定靶抗原有特异性的“现成”CAR T细胞。这种双CAR-EBVST在体外消除同种反应性T细胞的能力表明，它们可以能够避免排斥并在体内同种异体接受体中长期存在。

实施例5：CD30.CAR EBVST的改善生产

5.1 CD30.CAR EBVST的生产

CD30.CAR EBVST是在GMP设施中生产的。根据《赫尔辛基宣言》制定的指导方针，在获得知情同意后，从健康的、经血库批准的供体采集了大约250至400mL的血液。

通过密度梯度离心从血液中分离外周血单核细胞(PBMC)。通过使用与磁珠缀合的临床级抗CD45RA抗体以及使用Miltenyi清除柱(Miltenyi Biotec，Bergisch-Gradbach，Germany)进行磁性细胞分离，清除了PBMC中表达CD45RA的细胞。

将2x 10

4-6天后，用实施例1中描述的编码CAR的逆转录病毒转导EBVST。简言之，将含有逆转录病毒的上清液(0.5-1ml/孔)加入用RetroNectin(Takara)预包被的非组织培养物处理的24孔板中。将平板以2000×g离心60-90min后，取出逆转录病毒上清液，并以0.25-0.5x10

在培养的第8天和第10天之间，将通过如以上段落中所述的转导产生的CD30.CAREBVST转移到G-Rex管，并通过在uLCL存在下与经辐照的肽脉冲的自体激活的T细胞(ATC)共培养来重新刺激。简言之，将2x 10

7至12天后，收获CD30.CAR EBVST并用于功能测定法。

5.2通过不同方法产生的CD30.CAR EBVST的比较

进行IFN-γELISpot分析以比较(i)如实施例2中所述产生的CD30.CAR EBVST和(ii)如实施方案5.1中所述产生的CD30.CAR EBVST对EBV抗原刺激的应答。

测量响应于用关于EBV抗原EBNA1、LMP1和LMP2的pepmix(从德国柏林的JPTTechnologies获得)的刺激的IFN-γ产生。简言之，将CD30.CAR EBVST以5x 10

图11显示，通过实施例2的方法(包括在FBS存在下培养)产生的CD30.CAR EBVST在没有EBV抗原刺激的情况下显示出IFNγ的高背景表达。相反，通过实施例5.1的方法(包括在HPL而不是FBS存在下培养)产生的CD30.CAR EBVST在没有EBV抗原刺激的情况下显示出低得多的IFNγ背景表达。

因此，通过包括在人血小板裂解物(HPL)存在下培养的方法生产CD30.CAR EBVST增加了EBV特异性细胞在CD30.CAR EBVST群体中的比率。

在包含人血小板裂解物(HPL)作为生长因子来源的细胞培养基中生成/扩增CD30.CAR EBVST群体提高了它们的EBV特异性，与在包含胎牛血清的细胞培养基中培养来生成它们相比，观察到背景IFNγ分泌的显著减少。含HPL的细胞培养基维持CAR和内源性TCR两者的功能的能力对于表达CAR的VST的最佳性能是重要的。

实施例6：使用CD30.CAR EBVST治疗癌症

6.1从健康供体受试者产生的CD30.CAR EBVST的产生和表征

CD30.CAR EBVST是在GMP设施中生产的。根据《赫尔辛基宣言》制定的指导方针，在获得知情同意后，从七名健康的、经血库批准的供体那里采集了大约250至400毫升的血液。

通过密度梯度离心从血液中分离外周血单核细胞(PBMC)。通过使用与磁珠缀合的临床级抗CD45RA抗体以及使用Miltenyi清除柱(Miltenyi Biotec，Bergisch-Gradbach，Germany)进行磁性细胞分离，清除了PBMC中表达CD45RA的细胞。

在G-Rex10容器中，将1.5-2.5x 10

4-6天后，用实施例1中描述的编码CAR的逆转录病毒转导通过在以上段落中描述的刺激培养物产生的EBVST，如下所述。将2ml含有逆转录病毒的上清液与150μgVectofusin-1混合在2ml体积中，得到最终体积为4ml，并在室温孵育5-30min。然后将逆转录病毒:Vectofusin-1混合物加入T75容器中8.5ml培养基(如前段所述)中的7-10x 10

在培养的第8天和第10天之间，将通过如以上段落中所述的转导产生的1-2x 10

在200ml培养基中建立再刺激培养物(如实施例6.1的第3段所述)，并根据需要添加额外的培养基。7至12天后，收获CD30.CAR EBVST并冷冻保存以用于随后的输注。

对从4名代表性健康供体受试者制备的CD30.CAR EBVST评估它们在体外增殖的能力、在体外针对表达CD30和CD30阴性的癌症细胞系的细胞毒性，以及为了确定对不同EBV抗原的特异性。

CD30.CAR EBVST增殖的分析

CD30.CAR EBVST的增殖通过在培养过程中的不同时间点(第0、6、10、17、18和19天)使用血细胞仪计数细胞数量来测定，并计算累积倍数扩增。

图4显示了从4名不同的健康供体受试者产生的CD30.CAR EBVST在体外培养中扩增良好，足以在～17-20天内达到CD30.CAR EBVST的治疗剂量。扩增的细胞在77％至99％的细胞上表达CD30.CAR(数据未显示)。

CD30.CAR EBVST细胞毒性的分析

使用铬-51(

图5显示，CD30.CAR EBVST对CD30阴性伯基特淋巴瘤BJAB细胞系的细胞基本上没有细胞毒性，但对CD30阳性霍奇金淋巴瘤HDLM2细胞系显示出高细胞毒性。

CD30.CAR EBVST对EBV抗原的反应性分析

进行IFN-γELISpot分析以评估从四名不同的健康供体受试者制备的CD30.CAREBVST对EBV抗原刺激的应答。

测量响应于用关于EBV潜伏周期抗原(EBNA1、LMP1、LMP2和BARF1)和EBV裂解周期抗原(BZLF1、BRLF1、BMLF1、BMRF1、BMRF2、BALF2、BNLF2a和BNLF2b)的pepmix(从德国柏林的JPT Technologies,获得)的刺激的IFN-γ产生。简言之，将CD30.CAR EBVST以5x 10

图6显示，从4名不同的健康供体受试者产生的CD30.CAR EBVST保留了其对于EBV抗原的特异性。

所有四个CD30.CAR EBVST系都通过了功能释放标准，即响应于潜伏和裂解EBV抗原两者的刺激产生每10

6.2使用CD30.CAR EBVST作为CD30+淋巴瘤的同种异体过继细胞治疗

在本研究中，年龄在12-75岁的CD30+难治性或复发性霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、ALK阳性间变性T细胞淋巴瘤、ALK-阴性间变性T淋巴细胞淋巴瘤或其他外周T细胞淋巴瘤患者有资格接受治疗。

患者接受三个每日剂量的环磷酰胺(Cy:500mg/m

在研究的第0天，患者通过静脉内输注大约1至10分钟，以1至50ml的体积接受他们计划的单剂量同种异体CD30.CAR EBVST。向患者施用具有最佳HLA I类和II类匹配的CD30.CAR EBVST。

在本研究中，向共有5名患者施用了同种异体CD30.CAR EBVST细胞。3名患者接受4x 10

监测是根据血液制品管理的机构标准进行的，不同之处在于由医生注射。患者在输注后接受至少3小时的监测。评估患者的不良事件，包括临床状态和实验室数据的变化。特别是，对患者评估细胞因子释放综合征(CRS)和神经毒性的相关性，这在一些CAR-T细胞免疫疗法中已经观察到。

在以下时间点采集患者的血液样品：研究前、输注后3-4小时、第0天细胞输注后1、2、3、4和6周以及3个月。分析样品以评估CD30.CAR EBVST的持久性和有效性。

没有患者出现剂量限制性毒性，也没有观察到任何级别的细胞因子释放综合征(CRS)或移植物抗宿主病(GVHD)。

施用同种异体CD30.CAR EBVST的患者的临床应答

在输注前和第0天输注后6-8周进行诊断成像，以记录可测量的疾病和对疗法的应答(通过PET扫描、CT扫描、MRI和核成像)。

患者#1在左肘前窝静脉内注射11.9mCi的FDG(注射时的血糖水平为99mg/dL)。从颅骨中段到股骨近端获得PET和CT图像，随后对图像进行融合，在轴向、冠状面和矢状面进行多平面重建，并进行三维重建。

患者#2静脉内注射7.29mCi的FDG(注射时的血糖水平为99mg/dL)。大约60分钟后，使用PET-CT扫描仪利用CT衰减校正技术获取从颅底到大腿近端的图像。使用低剂量技术获得CT切片，并获得多平面重新格式化的图像。

图7和图8显示了两名接受CD30.CAR EBVST治疗的患者的临床应答。患者#1的图像显示了几个疾病区域的分辨，而患者#2的图像显示疾病的显著减少，表明在这些患者中用同种异体CD30.CAR EBVST治疗的疗效。

施用后CD30.CAR载体拷贝数的分析

通过实时qPCR对编码CD30.CAR的逆转录病毒的整合基因组进行定量。从几个时间点(淋巴细胞清除前、3hr、第1周、第2周、第3周、第4周、第6周和第3个月)从患者获取的外周血样品中分离PBMC。根据制造商的说明书，用QIAamp DNA Blood Mini试剂盒(Qiagen)从PBMC中提取DNA后，我们用与逆转录病毒载体内特定序列互补的引物和探针(AppliedBiosystems)扩增DNA。使用编码转基因的质粒的系列稀释液建立标准曲线。根据制造商的说明书，使用ABI7900HF实时PCR系统(Applied Biosystems)进行扩增。

图9显示了患者#1和患者#2的CD30.CAR转基因的载体拷贝数，并表明CD30.CAREBVST在体内不扩增，并且在这些患者的外周血中很快检测不到。

施用同种异体CD30.CAR EBVST患者的表位扩散分析

为了评估表位扩散，在几个时间点从患者#1收集免疫细胞，并用肿瘤相关抗原刺激以测定其在输注同种异体CD30.CAR EBVST前后的反应性。

从在几个时间点(淋巴细胞清除前、3hr、第1周、第2周、第3周、第4周、第6周和第3个月)从患者的外周血样品中分离PBMC，并将其用于基本上如上述实施例6.1所述进行的ELISpot测定法，不同之处在于PBMC以3×10

图10显示，患者#1在任何时间点对肿瘤相关抗原都没有应答，患者#1中没有表位扩散。这一结果表明，用同种异体CD30.CAR EBVST的治疗不会使患者的免疫系统对这些其他肿瘤抗原敏感。

6.3结论

本发明人已经表明，根据CD30.CAR EBVST作为CD30+癌症患者的现成治疗的用途，从健康供体受试者产生的CD30.CAR EBVST可以扩增到足够的数量并保持其TCR和CD30.CAR两者的功能，同时保留EBV特异性和消除CD30-阳性肿瘤细胞的能力。

发现CD30.CAR EBVST是安全的，并且在同种异体接受体体内显示出针对CD30阳性淋巴瘤的疗效。尽管表达CAR的细胞在外周血中的持久性有限，并且没有证据表明表位扩散到其他肿瘤相关抗原，但仍观察到临床应答。