一个调控大豆下胚轴伸长和叶面积大小的基因GmERECTAb及其编码蛋白与应用

技术领域

本发明涉及植物学领域和植物基因工程技术，具体为一个调控大豆下胚轴伸长和叶面积大小的基因GmERECTAb及其编码蛋白与应用。

背景技术

大豆密植和间套作模式在土地资源利用与提高单位土地面积上群体生物量等方面具有显著的作用。2020年中央一号文件指出，要加大对玉米和大豆间作新农艺推广的支持。玉米是重要的青储原料，生物量高但其蛋白质含量较低。大豆则具有较高的蛋白质含量但生物量低。将大豆与玉米混合作为青储原料可以有效弥补单一以玉米作为青储原料的缺点。因此提高大豆生物量将进一步提高大豆作为青储原料的优势，具有较高的经济效益，对农业可持续发展具有重要意义。

发明内容

本发明提供一个调控大豆下胚轴伸长和叶面积大小的基因GmERECTAb及其编码蛋白与应用，通过过量表达GmERECTAb基因的基因组全长序列gGmERECTAb可以显著增加荫蔽下大豆的下胚轴长度和叶面积大小。本发明通过以下技术方案来实现：

一种调控荫蔽下大豆株型的基因，所述基因来自大豆gGmERECTAb的基因组全长序列，其基因组全长核苷酸序列为SEQ ID NO.1，其全长编码序列为SEQ ID NO.2。进一步的，所述gGmERECTAb氨基酸序列如SEQ ID NO.3 所示。方案包括以下步骤：

载体构建：

A. 采用分段扩增将gGmERECTAb全长分为两次独立的基因扩增事件；

B. 对从起始密码子ATG开始的第1-5082位核苷酸序列进行扩增：

Primer1 SEQ ID NO.4：5’- TACGAACGATAGCCGGTACCATGGCGTTTCGGTTTGGAC-3’；

Primer2 SEQ ID NO.5：3’- TGTAGTCCACCACTTTGTACAGCCCGGGACTAGCTTCGGAGGTGAGTAA-5’

C. 对这5082个碱基长度的扩增产物进行胶回收，并通过无缝连接克隆将该片段构建到pBF载体上，得到pBF-gGmERECTAb-5082；

D. 对从起始密码子ATG开始的第5083-7238位核苷酸序列进行扩增：

Primer3 SEQ ID NO.6：5’- TTACTCACCTCCGAAGCTAGTGATTCTTCACATTAATATGACACTTC-3’；

Primer4 SEQ ID NO.7：3’- GTAGTCCACCACTTTGTACAGGTGACTATTTTGTGATATTACTTC-5’

E. 对这2156个碱基长度的扩增产物进行胶回收，并通过无缝连接克隆将这2156个碱基对构建在pBF-gGmERECTAb-5082上，得到pBF-gGmERECTAb-FLAG重组质粒。

F. 将重组质粒通过热激转化方法导入大肠杆菌DH5α，将菌液涂布到含有50 μg/mL kanamycin的LB固体培养基上，37℃过夜培养，菌落PCR鉴定和酶切鉴定为阳性克隆后，挑取阳性克隆到含有50 μg/mL kanamycin液体LB培养基中，37℃过夜振荡培养，用试剂盒提取质粒，质粒酶切鉴定后测序；其菌落PCR鉴定所用引物为：

Primer5 SEQ ID NO.8：5’- CAAACGAATCTCAAGCAATC-3’；

Primer6 SEQ ID NO.9：3’- ACCTAGTCATTTGTCGTCATCGT-5’

其酶切鉴定体系为：NEB Cut Smart Buffer 1μl；Bsp1407I 0.1μl；重组质粒pBF-gGmERECTAb-FLAG 8.9μl，于37℃水浴中反应4h。

G. 质粒测序正确后，将质粒转化农杆菌EHA105，涂到50 μg/mL kanamycin+25 μg/mL rifampicin LB固体培养基上，28℃培养2d，菌落PCR鉴定为阳性克隆后于终浓度为15％的甘油中保存该菌种。

在大豆中过表达gGmERECTAb：

A. 农杆菌活化：

将保存于-80℃冰箱的菌液扩大培养，测菌液吸光度OD

B. 侵染液制备：

于3500rpm 10min收集菌液，之后用侵染培养基重悬浮，使之OD

C. 挑取健康的大豆种子，均分子叶，去除真叶，在子叶节处进行创伤。将制备好的外植体放于侵染液中。侵染完成后，于协同培养基培养5天。

D. 使用冲洗培养基先进行冲洗，之后吸干液体，将外植体伤口朝上插入芽诱导培养基，放入培养箱培养4周，两周换一次培养基。

E. 将四周后的芽诱导材料转移到芽伸长培养基中，此阶段培养8周，芽至少长到3厘米以上可进行根诱导。当诱导出2-3条根时，便可以进行驯化。

F. 在驯化苗新的复叶完全展开后，用草甘膦溶液涂抹叶片，检测其是否有除草剂抗性，对具有抗性的叶片进行Western Blot检测gGmERECTAb-FLAG融合蛋白表达情况，提取叶片gDNA并检测TDNA插入情况，检测所用引物同菌落PCR鉴定中的引物一致。

荫蔽下gGmERECTAb过表达材料的表型鉴定

A. 大豆萌发与种植：

将种子用湿润纱布包裹，于25℃萌发两天，两天后挑取长势一致的幼苗移栽到营养土中于白光(WL)下继续生长，直至幼苗破土。

B. 大豆荫蔽处理：

幼苗破土后，将幼苗分别放置于正常光(WL)和荫蔽条件(Shade)下生长至V1期，之后观察下胚轴和叶面积表型变化，并统计下胚轴长度和叶面积大小。如图1、2所示。荫蔽下，gGmERECTAb过表达材料35S::gGmERECTAb-FLAG的下胚轴长度和叶面积大小均显著大于对照。

有益效果：

本发明公开了一个调控大豆下胚轴伸长和叶面积大小的基因GmERECTAb及其编码蛋白与应用，通过对GmERECTAb的基因组序列gGmERECTAb 7238 bp进行扩增，并采用无缝连接方法进行载体重组，高效得将gGmERECTAb的基因组全长序列克隆到pBF载体上；通过Bar标记基因赋予转化受体的除草剂抗性筛选，以及Western Blot检测gGmERECTAb-FLAG融合蛋白表达，确保阳性苗能准确快速检出，阳性苗筛选到T3代纯合，无分离情况出现，避免假阳性干扰。本发明GmERECTAb对荫蔽下大豆下胚轴伸长和叶面积大小调控效果显著，结果准确可靠，调控方法操作简单，方便，可公式化，易于推广应用。

附图说明

图1 对照 (Non transgenes) 与gGmERECTAb过表达大豆材料 (35S::gGmERECTAb-FLAG) 在荫蔽下的下胚轴表型图与下胚轴长度统计图。

图2 对照 (Non transgenes) 与gGmERECTAb过表达大豆材料 (35S::gGmERECTAb-FLAG) 在荫蔽下的叶面积表型图与叶面积统计图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详述：

本发明以大豆为例，进行GmERECTAb基因组基因gGmERECTAb在大豆中的过量表达。

1. gGmERECTAb 1-5082区段载体构建

A. 根据大豆GmERECTAb基因(基因号Glyma.06G056400，见序列表SEQ ID No .1)设计如下引物：

正向引物Primer1 SEQ ID NO.4：5’- TACGAACGATAGCCGGTACCATGGCGTTTCGGTTTGGAC-3’；

反向引物Primer2 SEQ ID NO.5：3’- TGTAGTCCACCACTTTGTACAGCCCGGGACTAGCTTCGGAGGTGAGTAA-5’

B. 提取大豆Williams82叶片中的gDNA作为模板，利用上述引物进行PCR扩增；扩增采用高保真酶Phanta Flash Master Mix（Vazyme #P510），反应体系(50μl)如下，依次加入：20μl ddH2O；25μl 2X Phanta Flash Master Mix；2μl Primer1；2μl Primer2；1μlWilliams82 gDNA模板。PCR反应程序为：98℃预变性1min；98℃变性10s，58℃退火30s，72℃延伸3min 30s，32个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

C. 扩增得到的gGmERECTAb的第1-5082片段大小为5082 bp，对该阶段PCR产物进行纯化后，利用无缝连接克隆技术，将该片段构建到线性化的pBF载体上，线性化所用限制性内切酶为Bsp1407I和KpnI。利用重组试剂盒ClonExpress II One Step Cloning Kit将PCR产物与线性化pBF进行重组。

D. 重组反应完成后，将重组反应产物加入大肠杆菌DH5α感受态中，按照大肠杆菌DH5α Chemically Competent Cell（擎科TSC-C14）产品说明书进行操作，之后将感受态涂布于50 μg/mL kanamycin LB固体培养基上。37℃倒置培养过夜。

E. 次日，挑取LB固体培养基上的单菌落进行菌落PCR鉴定，首先将菌落悬浮于20μl 无菌水中，用95℃高温处理2分钟备用。菌落PCR反应体系如下，依次加入：20μl ddH2O；25μl 2 × Taq Master Mix；2μl Primer5；2μl Primer6；1μl 菌液模板。反应程序如下：98℃预变性1min；98℃变性10s，58℃退火30s，72℃延伸6min，32个循环；72℃延伸10min；4℃保存。菌落鉴定引物如下：

Primer5 SEQ ID NO.8：5’- CAAACGAATCTCAAGCAATC-3’；Primer6 SEQ ID NO.9：3’- ACCTAGTCATTTGTCGTCATCGT-5’。

F. 将鉴定正确的菌落送往公司进行测序鉴定，将测序结果与原始序列进行比对，确定正确菌落，并将正确菌落转移到含有50 μg/mL kanamycin液体LB培养基中，180rpm 37℃培养过夜，提取质粒pBF-gGmERECTAb-5082用于后续实验。

2. gGmERECTAb 5083-7238区段载体构建

根据大豆GmERECTAb基因(基因号Glyma.06G056400，见序列表SEQ ID No .1)设计如下引物：

正向引物Primer3 SEQ ID NO.6：5’- TTACTCACCTCCGAAGCTAGTGATTCTTCACATTAATATGACACTTC-3’；

反向引物Primer4 SEQ ID NO.7：3’- GTAGTCCACCACTTTGTACAGGTGACTATTTTGTGATATTACTTC-5’

扩增采用高保真酶Phanta Flash Master Mix（Vazyme #P510），反应体系(50μl)如下，依次加入：20μl ddH2O；25μl 2X Phanta Flash Master Mix；2μl Primer3；2μlPrimer4；1μl Williams82 gDNA模板。PCR反应程序为：98℃预变性1min；98℃变性10s，58℃退火30s，72℃延伸2min，32个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

扩增得到的gGmERECTAb的第5083-7238片段大小为2156 bp，对该阶段PCR产物进行纯化后，利用无缝连接克隆技术，将该片段构建到线性化的pBF-gGmERb-5082载体上，线性化所用限制性内切酶为SmaI。利用重组试剂盒ClonExpress II One Step Cloning Kit将PCR产物与线性化pBF进行重组。之后进行相同的菌落鉴定和测序。最终获得pBF-gGmERECTAb-FLAG表达载体。

3. 农杆菌介导大豆转化

获得pBF-gGmERECTAb-FLAG表达载体后，将该质粒转入农杆菌EHA105感受态中，按照大肠杆菌EHA105 Chemically Competent Cell（擎科TSC-A03）产品说明书进行操作，之后将感受态涂布于50 μg/mL kanamycin+25 μg/mL rifampicin LB固体培养基上，28℃培养2天，菌落PCR鉴定为阳性克隆后于终浓度为15％的甘油中保存该菌种。菌落PCR反应体系与反应程序同前文所述。农杆菌介导的大豆转化步骤如下：

A. 农杆菌活化：将保存于-80℃冰箱的菌液扩大培养，测菌液吸光度OD

B. 侵染液制备：于3500rpm 10min收集菌液，之后用侵染培养基重悬浮，使之OD

C. 挑取健康的大豆种子，均分子叶，去除真叶，在子叶节处进行创伤。将制备好的外植体放于侵染液中。侵染完成后，于协同培养基培养5天。

D. 使用冲洗培养基先进行冲洗，之后吸干液体，将外植体伤口朝上插入芽诱导培养基，放入培养箱培养4周，两周换一次培养基。

E. 将四周后的芽诱导材料转移到芽伸长培养基中，此阶段培养8周，芽至少长到3厘米以上可进行根诱导。当诱导出2-3条根时，便可以进行驯化。

F. 在驯化苗新的复叶完全展开后，用草甘膦溶液涂抹叶片，检测其是否有除草剂抗性，对具有抗性的叶片进行Western Blot检测gGmERECTAb-FLAG融合蛋白表达情况，提取叶片gDNA并检测TDNA插入情况，检测所用引物同菌落PCR鉴定中的引物一致。

4. 荫蔽下gGmERECTAb过表达材料的表型鉴定

A. 大豆萌发与种植：将种子用湿润纱布包裹，于25℃萌发两天，两天后挑取长势一致的幼苗移栽到营养土中于白光(WL)下继续生长，直至幼苗破土。

B. 大豆荫蔽处理：幼苗破土后，将幼苗分别放置于正常光(WL)和荫蔽条件(Shade)下生长至V1期，之后观察下胚轴和叶面积表型变化，并统计下胚轴长度和叶面积大小。如图1、2所示。荫蔽下，gGmERECTAb过表达材料35S::gGmERECTAb-FLAG的下胚轴长度和叶面积大小均显著大于对照。

进一步地，gGmERECTAb基因的过量表达可以应用于生菜、玉米、等农作物，通过合理密植或间套作实现单位土地面积上的高生物量产出。

以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅限制于本文所示的实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干修改和润饰也应视为本发明的保护范围。