一种鉴定棉花花药颜色性状的分子标记组合及方法和应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学技术领域，特别涉及一种鉴定棉花花药颜色性状的分子标记组合及方法和应用。

背景技术

棉花是世界性的重要经济作物，是纺织工业天然纤维的主要来源，也是重要的食用油和蛋白来源。棉花产量、品质等性状的改良是育种工作者的主要目标。因棉花的花色彩鲜艳，同时具有丰富的株型(Lu et al.,2022(https://doi.org/10.3389/fpls.2022.914206)；Wang et al.,2023(https://doi.org/10.1016/j.jia.2022.10.007))、叶形(Hu et al.,2022)和叶色(Gao et al.,2013(https://doi.org/10.1371/journal.pone.0077891)；Shao et al.,2021(https://doi.org/10.1016/j.plantsci.2021.110827))变化，使棉花也具有一定的观赏价值，棉花已经成为集纤维、食品和观赏价值于一身的重要经济作物。

花药是雄蕊的重要组成部位，花药囊是产生花粉的构造，花粉的顺利产生植物才能进行有性生殖。陆地棉花药颜色多为白色，海岛棉花药颜色为黄色，一些野生棉的花药颜色也多为黄色。已有研究报道，花药颜色形成多与花色素苷、类胡萝卜素等类黄酮物质有关，花药的色素积累程度与植物的光合速率及耐逆性有关(Laikova et al.,2005(https://doi.org/10.1007/s11177-005-0216-4))。同时，鲜艳的颜色有助于昆虫授粉(Ison et al.,2019(https://doi.org/10.1093/aob/mcy211))，提高杂交制种过程中基于昆虫授粉的结实率，降低制种成本，提高制种效率。因此，花药颜色性状的研究对观赏型棉花新品种选育、棉花杂交制种等都具有重要意义。研究也为棉花品种的遗传进化及重要观赏性状形成提供了一定的思路。

全基因组重测序(Whole Genome Resequencing,WGRS)是对已知参考基因组序列的物种进行不同个体间的全基因组水平的测序，具有检测变异类型丰富、高性价比、应用广泛等优点。全基因组重测序的个体，通过序列比对，可以找到大量的单核苷酸多态性位点(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)，插入缺失位点(Insertion/Deletion，InDel)和结构变异位点(Structure Variation，SV)等信息，从而应用于检测致病基因、遗传变异等众多领域。单核苷酸多态性主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。这种变异可由单个碱基的转换或颠倒所引起。SNP在基因组内分布广泛，位于基因编码区内的非同义SNP可导致基因功能的改变。由于SNP的二态性，在基因组筛选中SNPs往往只需+/-的分析，而不用分析片段的长度，利于发展自动化技术筛选或检测SNPs。本发明的目的是开发用于检测棉花花药颜色性状基因位点的SNP标记，并利用该标记组合在大量自然品种/系中进行检测验证，为棉花黄色花药性状的早期检测提供新方法，为棉花杂种优势利用和新品种选育提供实用标记。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种鉴定棉花花药颜色性状的SNP标记组合，以及该SNP标记组合在鉴定棉花花药颜色性状上的应用。

通过以下技术方案来实现上述目的：

本发明的第一目的在于提供一种鉴定棉花花药颜色性状的SNP分子标记组合，所述SNP分子标记组合包括三个SNP分子标记位点，均位于棉花基因组的第A05号染色体上，具体为：

SNP ID No.1：第105079550位碱基的基因型为T或C；

SNP ID No.2：第105080001位碱基的基因型为C或T；

SNP ID No.3：第105080116位碱基的基因型为A或T。

本发明的第二目的在于提供一种上述SNP分子标记组合在棉花分子标记辅助育种中的应用。

本发明的第三目的在于提供一种上述SNP分子标记组合在选育棉花花药颜色品种中的应用。

作为上述技术方案的进一步改进，当SNP ID No.1、SNP ID No.2和SNP ID No.3分别为CTA组合或TCT组合时，棉花花药颜色为黄色；当SNP ID No.1、SNP ID No.2和SNP IDNo.3为TCA组合时，棉花花药颜色为白色。

作为上述技术方案的进一步改进，所述棉花的品种为海岛棉、亚洲棉，则SNP IDNo.1、SNP ID No.2和SNP ID No.3为CTA组合时，棉花花药颜色为黄色。

作为上述技术方案的进一步改进，所述棉花的品种为陆地棉，则SNP ID No.1、SNPID No.2和SNP ID No.3为TCT组合时，棉花花药颜色为黄色，SNP ID No.1、SNP ID No.2和SNP ID No.3为TCA组合时，棉花花药颜色为白色。

本发明的第四目的在于提供一种鉴定棉花花药颜色性状的方法，包括以下步骤：

步骤S1、提取待检测棉花组织DNA；

步骤S2、根据权利要求1所述SNP分子标记组合设计特异性引物，以棉花组织DNA为模板，利用设计的特异性引物进行PCR扩增；

步骤S3、检测SNP分子标记位点的基因型，用于快速鉴别棉花花药颜色品种。

作为上述技术方案的进一步改进，所述特异性引物具体为：

SNP ID No.1P-上游引物：AGTGCCCATAATTGCTCTTCCATA；

SNP ID No.1P-下游引物：TTCGAGGACAAGTGAGCGATAAAT；

SNP ID No.1P检测SNPIDNo.1位点的SNP核苷酸序列信息。

SNP ID No.2/3P-上游引物：TTCCCATTACCGGAACACTCATTA；

SNP ID No.2/3P-下游引物：TGTCTCAAACTACGCTCTTGGTAT。

SNP ID No.2/3P引物可以同时检测SNP ID No.2和SNP ID No.3位点的SNP核苷酸序列信息。

本发明的第五目的在于提供一种用于鉴定棉花花药颜色性状的SNP标记引物，所述SNP标记引物以上述SNP分子标记组合所在位点及其上下游碱基组成的序列为目标序列设计，所述SNP标记引物序列为：

SNP ID No.1P-上游引物：AGTGCCCATAATTGCTCTTCCATA；

SNP ID No.1P-下游引物：TTCGAGGACAAGTGAGCGATAAAT；

SNP ID No.2/3P-上游引物：TTCCCATTACCGGAACACTCATTA；

SNP ID No.2/3P-下游引物：TGTCTCAAACTACGCTCTTGGTAT。

本发明的第六目的在于提供一种用于检测棉花花药颜色性状的试剂盒，该试剂盒包含上述SNP标记引物。

本发明的有益效果在于：

本发明利用第三代分子标记SNP确定了不同颜色花药品种的基因型，实现了不同颜色花药品种的准确、快捷鉴别。本发明具有操作简单、结果准确、便于重复等特点，适用于筛选不同棉种花药颜色，鉴定具有潜在应用价值的优异位点及花药颜色分子标记辅助选择育种，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为海岛棉(A)和陆地棉(B)花药颜色的比较，图上方为海岛棉的花和黄色花药，图下方为陆地棉的花和白色花药。

具体实施方式

下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请做出一些非本质的改进和调整。

本发明提供了一种鉴定棉花花药颜色性状的SNP分子标记组合，该SNP分子标记为棉花A05号染色体上第105079550、105080001和105080116位碱基及其上下游碱基组成的核苷酸序列，其中棉花第5号染色体上第105079550、105080001和105080116位碱基的基因型为T/C、C/T和A/T。

本发明还提供了上述棉花花药颜色性状相关的SNP分子标记在检测棉花花药颜色性状中的应用，海岛棉(黄色花药)品种、亚洲棉(黄色花药)品种在SNP ID No.1、SNP IDNo.2和SNP ID No.3位点的基因型组合为CTA：陆地棉(黄色花药)品种在SNP ID No.1、SNPID No.2和SNP ID No.3位点的基因型组合为TCT；陆地棉(白色花药)品种在SNP ID No.1、SNP ID No.2和SNP ID No.3位点的基因型组合为TCA，如下表所示：

图1为海岛棉(A)和陆地棉(B)花药颜色的比较，图上方为海岛棉的花和黄色花药，图下方为陆地棉的花和白色花药。

1、材料

本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。

2、方法

2.1、全基因组重测序及SNP分子标记的开发

基于2个分别为陆地棉白色花药和海岛棉黄色花药的棉花品种配制杂交组合，F1植株的花药颜色为黄色，F1植株自交得到包含676个单株的F2群体，对群体中的黄色花药和白色花药单株分别进行BSA-seq混池测序。采用高通量Illumina HiSeq TM测序技术对2个不同花药颜色性状的DNA混池进行全基因组重测序，共获得42.13G的原始数据(Raw data)碱基序列片段。测序得到的原始测序序列可能含有接头序列或者低质量的碱基。通过质量控制和数据过滤，得到高质量的clean data，用于后续分析。碱基错误率低于1％(Q20)的碱基平均占比98.06％，碱基错误率低于0.1％(Q30)的碱基平均占比94.31％，GC分布正常。2个样品获得高质量序列数290567574条，样品的测序数据比对到参考基因组的比例平均为94.80％，满足后续实验分析要求。

基于棉花参考基因组数据，对棉花黄色花药性状的BSA-seq分析得到棉花A05号染色体103.76Mb-105.87Mb区间为棉花黄色花药性状候选区间，在此区间进行分子标记的开发，一共开发分子标记49对，进一步将候选区间缩小为88.7kb。通过对候选区间SNP位点在子代中的基因型和表型统计分析，发现SNP位点SNP ID No.1(基因型为T/C)和SNP ID No.2(基因型为C/T)，这2个SNP位点及其组合可以完全区分来自海陆群体的具有两种不同颜色花药的棉花子代，黄色花药单株在SNP ID No.1和SNP ID No.2位点的基因型组合都为CT：白色花药单株在SNP ID No.1和SNP ID No.2位点的基因型组合都为TC。在本研究使用的海陆F

SNP ID No.1位点的检测引物序列，正向引物序列SEQ ID No.1：5’-AGTGCCCATAATTGCTCTTCCATA-3’，反向引物序列SEQ ID No.2：5’-TTCGAGGACAAGTGAGCGATAAAT-3’。

SNP ID No.2/3位点的检测引物序列，正向引物序列SEQ ID No.3：5’-TTCCCATTACCGGAACACTCATTA-3’，反向引物序列SEQ ID No.4：5’-TGTCTCAAACTACGCTCTTGGTAT-3’，SNP ID No.2/3P引物可以同时检测SNP ID No.2和SNP IDNo.3位点的SNP核苷酸序列信息。

2.2、SNP标记在不同棉花种质资源中的验证

(1)利用CTAB法提取待测棉花叶片DNA；

①称取0.2g叶片于离心管中，液氮冷激后迅速使用组织研磨仪充分研磨，加入65℃水浴之后的CTAB溶液1ml，混匀后放置在水浴锅中，65℃加热水浴30min，每8min颠倒一次。

②水浴后，取出离心管，4℃离心10min，取上清加入800μl体积比24：1的氯仿和异戊醇混合液，缓慢上下颠倒，至混匀不分层为止，4℃条件下12000rpm离心10min。

③重复上一步

④吸取上清液应转移至另一个1.5ml离心管中。加入2倍体积的冰冷异戊醇(提前放-20℃冰箱)和200μl乙酸钠溶液，缓慢颠倒，直至出现絮状DNA生成，静止30min。

⑤4℃条件下12000rpm离心10min，倒掉废液，加入70％(v/v)乙醇溶液洗2次，无水乙醇洗1次。

⑥过夜干燥，加ddH

(2)利用基因分型技术，根据所述SNP位点设计特异性引物，序列如下：

SEQ ID No.1：正向引物序列：5’-AGTGCCCATAATTGCTCTTCCATA-3’；

SEQ ID No.2：反向引物序列：5’-TTCGAGGACAAGTGAGCGATAAAT-3’；

SEQ ID No.3：正向引物序列：5’-TTCCCATTACCGGAACACTCATTA-3’；

SEQ ID No.4：反向引物序列：5’-TGTCTCAAACTACGCTCTTGGTAT-3’。

(3)以棉花组织DNA为模板，利用设计的特异性引物进行PCR扩增。

具体反应体系和程序如下：

PCR反应体系为：

PCR反应程序为：

(4)检测PCR扩增产物中SNP分子标记位点的基因型，用于快速鉴别棉花品种。

为进一步验证本研究基于海陆F

SNP ID NO.1P引物扩增产物序列如下：

AGTGCCCATAATTGCTCTTCCATAAGCCAGTGGAAGTGAAGCAAATTTCTTTGCTTTCCCTACATAAGCCCTTTTGGTGAAATTATTATAGTCATTTTCTTCGATGACATCTAAGATTTGTCTATACAACAACAATGATGCCCACA[T/C]TGGCCATCTGCTTGCCTCCGTTAGCTCCGCAACCCCTTTTTCGGCCTCATCGAAGTACATTCTTGCTCGTTTTATTTGATTTTTCATGAAAATTTTCCATTTATCGCTCACTTGTCCTCGAA(269bp)

SNP ID NO.2/3P引物扩增产物序列如下：

TTCCCATTACCGGAACACTCATTAGTCCGACCGTCCCAGCAACATAGTAGCAGTATAGATAGAG[C/T]TCATCAAAGTTGTTATATCTGGTTTTCAATAAATCTAATCTCATCCCTTCTATCATGTCCTTGAAGGGCTGCACAAACAAAATTAATTAATTTGTTGATATAGTTCCAAATCTC[A/T]ATAATTTTGTGAATGTCAAACATGGCTATGCATCTAACCTGAATACCAAGAGCGTAGTTTGAGACA(246bp)

其中，“AGTGCCCATAATTGCTCTTCCATA、ATTTATCGCTCACTTGTCCTCGAA”以及“TTCCCATTACCGGAACACTCATTA、ATACCAAGAGCGTAGTTTGAGACA”为上下游引物与DNA模板结合位置，方括号内为SNP碱基的位置及变异类型。

当SNP ID No.1位点为T时，序列如SEQ ID No.5所示；当SNP ID No.1位点为C时，序列如SEQ ID No.6所示。

当SNP ID No.2位点为C时，SNP ID No.3位点为A时，序列如SEQ ID No.7所示；当SNP ID No.2位点为C时，SNP ID No.3位点为T时，序列如SEQ ID No.8所示；当SNP ID No.2位点为T时，SNP ID No.3位点为A时，序列如SEQ ID No.9所示。

以上结果表明虽然SNP ID No.1和SNP ID No.2位点组合无法区分陆地棉中不同花药颜色的品种，但SNP ID No.1和SNP ID No.3位点组合，或SNP ID No.2和SNP ID No.3位点组合，或3个SNP位点SNP ID No.1、SNP ID No.2和SNP ID No.3的组合都可以完全区分不同种、不同花药颜色的棉花种质。3个SNP位点组合与棉花花药颜色性状紧密连锁或共分离，可作为分子标记用于棉花花药颜色性状的分子检测，还可用于棉花遗传背景分析，以及棉花花药颜色性状分子标记辅助选择育种，具有广阔的应用前景。

表1 48份棉花品种的标记鉴定

以上品种均来源于国家棉花种质资源中期库(河南省安阳市开发区黄河大道38号)。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进，这些都属于本发明的保护范围。