一株广西鸡源H9N2禽流感病毒毒株及其在灭活疫苗中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及的是一株广西鸡源H9N2禽流感病毒毒株及其在灭活疫苗中的应用。

背景技术

H9N2亚型AIV感染鸡主要引起鸡群的呼吸道、消化道和生殖系统疾病，进而造成鸡的生长缓慢和产蛋率下降等不良影响，是目前影响我国养禽业健康发展的主要亚型之一。近年来，随着我国养殖业飞速发展，我国成为养殖大国。H9N2亚型AIV是目前我国鸡群中存在的AIV的主要亚型，占禽流感总发病率90％以上。H9N2亚型禽流感发病后虽然致死率不高(一般不超过30％)，但常导致呼吸道症状，蛋鸡的产蛋下降，并使鸡群易继发严重的呼吸道疾病，影响家禽生产性能；肉鸡感染后造成免疫抑制，容易造成继发感染和混合感染，从而给肉鸡养殖业造成巨大经济损失。

目前在我国野鸟和家禽中流行的绝对大多数H9N2亚型AIV在HA基因遗传进化中分别属于不同亚系和分支，毒株的多样性给H9N2亚型AI的防控增加难度。疫苗接种仍然是预防AI发生与传播最有效的手段之一，灭活疫苗应用最普遍。目前我国正在使用的H9N2 AI疫苗种类繁多，免疫后鸡体都产生了较高的抗体水平，但发生免疫失败的案例也十分常见。积极开展流行病学调查，密切追踪AIV的分子进化和抗原变异，选择免疫保护性好的H9N2禽流感病毒疫苗株，才能保证疫苗良好的免疫效果。禽流感病毒变异非常快，及时的发现新的毒株研究其特性并最终筛选出可以作为疫苗株的毒株是保证禽流感疫苗效果的最重要方式之一。

发明内容

本发明的目的在于为解决现有技术中禽流感病毒变异快，现有疫苗跟不上防控有效措施的技术问题，为广西H9N2 AIV的分子流行病学研究提供资料、奠定基础。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：

本发明提供一株广西鸡源H9N2禽流感病毒毒株，命名为A/chicken/Guangxi/C227/2015(H9N2)(简称CK/GX/C227/15)，并提供了该毒株的全基因组序列；其保藏编号为CGMCC No.45216，2022年06月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。通过HA基因遗传进化分析阐明该毒株HA与常见的H9N2 AIV参考毒株及常用疫苗株在遗传进化上的差异，从而为广西H9N2 AIV的分子流行病学研究提供资料。

如上所述的广西鸡源H9N2禽流感病毒毒株在制备疫苗中的应用。

如上所述的广西鸡源H9N2禽流感病毒毒株在制备防治H9N2禽流感病毒的疫苗中的应用。

优选的是，所述的疫苗为灭活疫苗。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明阐明了广西鸡源H9N2禽流感病毒与其他分离毒株的抗原变异情况；该毒株制成灭活疫苗后，免疫4W SPF鸡，通过对同源和异源H9流感野毒株的攻毒免疫保护效果分析，证明该病毒株可以用作H9亚型禽流感疫苗候选株；免疫源性强。

保藏信息说明

A/chicken/Guangxi/C227/2015(H9N2)于2022年06月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.45216。

附图说明

图1是HA基因遗传进化树；其中，“■”表示分离株A/chicken/Guangxi/C227/2015(H9N2)；“▲”表示国内常用疫苗株SS株。

图2是禽流感病毒A/chicken/Guangxi/C227/2015(H9N2)毒株制成油乳剂灭活疫苗与商品化疫苗SS株(CK/GD/SS/94)在免疫SPF鸡后的抗体水平。

具体实施方式

下面结合附图以及具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。实施例中采用的原料、试剂若无特殊说明，皆为市售所得。A/Chicken/Guangxi/Lz071D5/2019(H9N2)(简称CK/GX/Lz071D5/19)采用的是广西壮族自治区兽医研究所实验室分离保存的。

实施例1

病毒分离纯化

将广西某发病鸡群采集的具有明显病变的肺脏和支气管等病料样品按比例加入生理盐水进行研磨(样品和生理盐水按照质量比1:3添加)，反复冻融3次后8000r/min离心5min，取其上清液用0.22μm一次性滤器进行过滤。采用尿囊腔接种方式将上清液接种至9-10d SPF鸡胚中，37℃孵育观察96h，收集死亡和未死亡鸡胚的尿囊液，分别以血凝试验(HA)和血凝抑制试验(HI)鉴定病毒增殖效果。其中，HI试验结果呈阳性的样品通过有限稀释法进行连续3轮的克隆纯化，纯化后的样品增殖培养并超速离心并且分装在冻存管中在-80℃冰箱保存备用。

基因组RT-PCR扩增、测序及鉴定

使用RNA提取试剂盒提取-80℃保存鸡胚尿囊液中的病毒基因组RNA，同时参照Hoffmann等(2001)的方法合成扩增引物(见表1)，并按照One Step RT-PCR Kit试剂盒说明采用一步法扩增病毒基因组的全基因片段；所得PCR产物经切胶纯化，与pMD18-T载体连接后转化DH5α感受态细胞，经扩大培养后挑取单个菌落进行PCR鉴定，鉴定结果呈阳性的菌液送至深圳华大基因公司进行测序，全基因序列如序列表第1至第8条所示。

鉴定：测序结果经BLAST检索后与NCBI中H9N2亚型禽流感病毒HA和NA基因同源性最高。因此，根据禽流感标准命名法则将毒株命名为A/chicken/Guangxi/C227/2015(H9N2)毒株简称CK/GX/C227/15。

表1.全基因引物序列

实施例2

通过实施例1纯化、鉴定后所得H9亚型AIV，进行下述的各种操作，以确定其部分生物学特性：

1、遗传进化分析

A/chicken/Guangxi/C227/2015(H9N2)的HA基因序列如说明书中所示，参考Hoffmann等(2001)设计的扩增AIV的HA基因片段的引物进行引物合成，分别扩增H9亚型AIVHA基因片段。该病毒的HA基因序列测定及遗传进化分析表明，其HA基因隶属于Y-280-like谱系，与常用疫苗株遗传距离较远，处于不同的进化分支，其具体的基因进化树如图1所示(采用的分析软件是DNAstar7.0和MEGA6.0)。

2、病毒在鸡胚中可高滴度生长，血凝素效价稳定在2

EID

3、病毒可以在SPF鸡体内产生较高抗体

将A/chicken/Guangxi/C227/2015(H9N2)病毒用β-丙内酯灭活，与白油混和均匀(体积比3:7)制成油乳剂灭活苗，免疫4W龄SPF鸡(每只鸡皮下注射0.3mL)，3W后采集血清，检测血清中H9抗体滴度。抗体在免疫后3W达到较高滴度即CK/GX/C227/15在免疫后第3W抗体就达到了7(lg2)，所以用CK/GX/C227/15病毒株作为抗原研制的灭活油苗免疫SPF鸡后容易引起鸡体产生免疫应答。

实施例3

病毒HA抗原性分析

实验方法：

1、H9单因子血清的制备

将2013-2020年分离的12株H9N2亚型AIV(其中1株为本发明毒株CK/GX/C227/15)及常用疫苗参考株SS株(CK/GD/SS/94)分别制备油乳剂灭活苗(各毒株如表2所示)。以上述油乳剂灭活苗分别免疫4W龄SPF鸡，在SPF鸡隔离饲养器内饲养制备单因子血清，用于不同毒株之间的交叉HI试验，检测CK/GX/C227/15病毒的HA抗原谱是否广谱；共免疫两次，间隔2W，第二次免疫后14d分别采集相应的鸡全血进而制备阳性血清用于交叉HI试验。

2、交叉HI试验

13株病毒为抗原，分别制备其4单位病毒，与13种单因子血清进行交叉HI试验，检测H9N2病毒的HA抗原反应性，实验重复三次，取三次实验的平均值(表2)。

上述表2实验结果用于R值分析，从而确定上述H9N2病毒HA抗原之间的相关性。抗原相关性的判定标准如下：

抗原间的相关性

R-2株病毒间的抗原性差异

r1-甲病毒对乙血清的HI滴度/甲病毒对甲血清的HI滴

r2-乙病毒对甲血清的HI滴度/乙病毒对乙血清的HI滴度

如果R＝1，表明两个毒株间抗原性相同；如果0.67≤R≤1.5，表明两个毒株间抗原性无明显差异；如果0.5≤R＜0.67，表明两个毒株间抗原性有小的差异；如果R＜0.5，表明两个毒株间抗原性的明显差异；R值越小，抗原性差异越大。结果如表3所示：

表2H9亚型AIV分离株、疫苗株交互HI抗体滴度

表3毒株之间的抗原相关性系数R值

HA抗原相关性分析

从表3中可以看出，CK/GX/C227/15病毒与其余12株H9N2病毒的HA抗原相关性均大于0.6，表明该病毒与大多数毒株的HA抗原相关性较好，但其与商品疫苗SS株(CK/GD/SS/94)的HA抗原相关性只有0.6，存在明显差异。表明CK/GX/C227/15血凝素蛋白HA抗原较为广谱，可用做H9N2禽流感疫苗的候选毒株。

实施例4

疫苗株免疫保护效果分析

1、疫苗制备及交叉免疫攻毒

将分离株CK/GX/C227/15制备油乳剂灭活苗，将所制油乳剂灭活苗分别免疫2组4WSPF鸡，免疫组每组10只，对照组6只(对照组不进行免疫操作)。免疫第21d后，同源和异源分离株病毒分别对每一组免疫组的10只SPF鸡及空白对照组的6只SPF鸡进行鼻腔感染，攻毒量为每只鸡10

结果如下：I组用CK/GX/C227/15进行攻毒，(滴鼻)剂量为100μL，(100μL含有10

2、免疫后3w检测抗体结果

将CK/GX/C227/15毒株制成油乳剂灭活苗后，免疫4W SPF鸡，免疫21d后采集血清检测抗体。结果表明实验组鸡只H9抗体效价到8左右，见表4。

表4灭活苗CK/GX/C227/15免疫SPF鸡21d后采集血清检测抗体结果

3、H9N2禽流感油乳剂灭活苗对SPF鸡免疫效果

攻毒后第1、3、5和7d采集棉拭子在9d SPF鸡胚上进行病毒滴定，具体结果见表5。攻毒后7d内，对照组6只鸡咽喉和泄殖腔都有排毒，第5和7d比第3d排毒量有所降低；免疫组对同源毒株的保护率达到80％，对异源毒株的保护率为60％。

4、H9N2禽流感油乳剂灭活苗对SPF鸡安全效果免疫后21d就开始攻毒，攻毒后实验组和对照组鸡只均未表现明显的临床症状，吃料和饮水均正常，证明该油乳剂灭活苗对鸡是安全的。

表5 H9禽流感油乳剂灭活苗对SPF鸡的免疫保护试验

表5中control指的是空白对照组

5、免疫后抗体水平监测

CK/GX/C227/15毒株制成油乳剂灭活苗与商品化疫苗SS株(CK/GD/SS/94)在免疫SPF鸡后的抗体水平如图2所示。SPF鸡在免疫CK/GX/C227/15毒株所制灭活疫苗与商品疫苗SS株(CK/GD/SS/94)免疫两周后，抗体水平达到了7log2以上。免疫第4周后，抗体HI达到最大值，CK/GX/C227/15毒株所制灭活疫苗最大可以达到12log2，而SS株商品化疫苗最大在11log2。CK/GX/C227/15免疫组SPF鸡在免疫10W后抗体水平开始缓慢下降。CK/GX/C227/15株灭活疫苗免疫SPF鸡24W时抗体水平仍可维持在6log2以上。对照组抗体水平始终在1log2以下，对照成立。由此可见CK/GX/C227/15毒株制成的油乳剂灭活苗可以使SPF鸡免疫后24W内维持比较高的抗体水平。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。