用于快速鉴别槟榔鲜果果形的SSR分子标记引物、试剂盒及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及用于快速鉴别槟榔鲜果果形的SSR分子标记引物、试剂盒及应用。

背景技术

槟榔作为中国四大南药之首，具有很高的药用价值和食用价值。果实是果树类植物重要的经济器官，其鲜明的外观特征，可直接影响肉质果实的商业价值和经济效益。槟榔果是槟榔的主要食用部分，其鲜果实为核果，呈卵形、球形或柱形，果皮厚，果肉呈纤维状，在鲜果时人们就喜爱咀嚼，槟榔果形的形成受到多种因素的控制，基因调控是其中重要的一环。

果实性状作为核果类果树重要的商品品质特征，也是其进行遗传改良的主要性状。槟榔鲜果果实的形态对槟榔干制过程和消费者对烘干过的槟榔选择有着重要的影响，此外还对市场人们对食用鲜果的选择极为重要。但对于槟榔鲜果的选取尚没有科学严谨的筛选标准，大多单纯依据槟榔鲜果的单果质量甚至是感官判断来进行筛选，这种筛选方式在当前的槟榔种植和青果生产中造成了大量低效生产和资源浪费。因此，急需一种通过差异基因的表达来判断槟榔鲜果果形的方法。

发明内容

为了解决现有槟榔鲜果果形筛选方法效率低下的问题，本发明提供了用于快速鉴别槟榔鲜果果形的SSR分子标记引物，该SSR分子标记引物对槟榔鲜果果形的鉴别具有较高的特异性，利用该SSR分子标记引物对槟榔基因组进行PCR扩增，扩增产物进行凝胶电泳，根据所得凝胶电泳图谱即可鉴别槟榔鲜果果形，将该SSR分子标记引物用于鉴别槟榔鲜果果形，具有易于操作、鉴别效率高和结果可靠的特点,具有极大的潜在应用价值。

本发明还提供了用于快速鉴别槟榔鲜果果形的试剂盒及应用。

本发明通过以下技术方案实现：

本发明提供用于快速鉴别槟榔鲜果果形的SSR分子标记引物，所述引物包括SSR-2-F和SSR-2-R，所述SSR-2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述SSR-2-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

基于同一发明构思，本发明提供用于快速鉴别槟榔鲜果果形的SSR分子标记引物在鉴别槟榔鲜果果形中的应用。

基于同一发明构思，本发明提供用于快速鉴别槟榔鲜果果形的试剂盒，所述试剂盒包含引物SSR-2-F和SSR-2-R，所述SSR-2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述SSR-2-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

基于同一发明构思，本发明还提供用于快速鉴别槟榔鲜果果形的试剂盒在鉴别槟榔鲜果果形中的应用。

进一步的，所述槟榔鲜果果形包括球形、卵形和柱形。

基于同一发明构思，本发明还提供一种快速鉴别槟榔鲜果果形的方法，所述方法包括：

以SSR-2-F和SSR-2-R为引物，对待测槟榔样品的基因组DNA进行PCR扩增；

对PCR扩增产物进行凝胶电泳，获得凝胶电泳图谱；

根据所述凝胶电泳图谱鉴别所述待测槟榔样品的鲜果果形；

其中，所述SSR-2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述SSR-2-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步的，所述待测槟榔样品包括槟榔叶片。

进一步的，所述根据所述凝胶电泳图谱鉴别所述待测槟榔样品的鲜果果形，具体包括：

若所述凝胶电泳图谱中，200bp-300bp处有一条条带且在1000bp-1500bp处还有一条条带，则所述待测槟榔样品的鲜果果形为柱形；

若所述凝胶电泳图谱中，仅在200bp-300bp处有一条条带，则所述待测槟榔样品的鲜果果形为卵形或球形。

本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

1.本发明用于快速鉴别槟榔鲜果果形的SSR分子标记引物，利用不同果形的碱基简单重复序列不同设计得到鉴别槟榔鲜果形状的检测引物，该SSR分子标记引物对槟榔鲜果果形的鉴别具有较高的特异性，只需提供正常槟榔样品，利用该SSR分子标记引物对槟榔基因组进行普通PCR扩增，扩增产物进行凝胶电泳，根据所得凝胶电泳图谱即可鉴别槟榔鲜果果形，将该SSR分子标记引物用于鉴别槟榔鲜果果形，具有易于操作、鉴别效率高和结果可靠的特点,具有极大的潜在应用价值。

2.本发明用于快速鉴别槟榔鲜果果形的SSR分子标记引物在鉴别槟榔鲜果果形中的应用，通过SSR分子标记技术，利用不同槟榔果形碱基简单重复序列的差异表达，来判断槟榔不同形状青果，本发明开发的SSR分子标记引物,只需提供样品,按照所提供的方法进行PCR检测,即可确定槟榔未成熟鲜果的果形,为后续筛选不同形状的槟榔果实、提高经济效益提供依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为本发明SSR分子标记引物的筛选方法流程图。

图2为球形、卵形和柱形的槟榔鲜果果形图。

图3为球形、卵形和柱形3种槟榔鲜果果形对应的凝胶电泳图谱。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

本发明整体思路如下：

目前，对于槟榔鲜果果形的筛选尚无科学严谨的筛选标准，大多单纯依据槟榔鲜果的单果质量甚至是感官判断来进行筛选，这种筛选方式在当前的槟榔种植和青果生产中造成了大量低效生产和资源浪费。现有的筛选技术中没有详细的通过分子水平来区分槟榔鲜果果形的方法，大多是以个人感官来判断槟榔鲜果果形，关于通过分子标记来判断筛选槟榔鲜果果实的方法尚未见报道。

简单重复序列标记(SSR)是1989年由Litt和Luty扩增到了人类基因组SSR序列，并把这种序列正式定义为微卫星，它的原理通过微卫星序列两端互补序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段，根据核心序列串联重复数目不同，最终能够用PCR的方法扩增出不同长度的PCR产物，将扩增产物进行凝胶电泳，根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率。目前，简单重复序列标记(SSR)在生物遗传多样性研究、植物品种的鉴定、亲缘关系的分析和分子标记辅助等领域有着广泛的应用。

基于此，本申请发明人去往不同槟榔种植地，采收大量不同形状未成熟期的槟榔鲜果果实及叶片，之后通过不同形状的槟榔果实基因差异，利用SSR软件进行分析和引物设计，再通过人工合成引物，进行PCR扩增和扩增产物跑凝胶电泳，通过将不同果形槟榔鲜果与条带位置和大小进行比对，最终获得一对引物SSR-2-F和SSR-2-R，并将其作为鉴别槟榔鲜果果形的SSR分子标记引物。

引物SSR-2-F和SSR-2-R鉴别槟榔鲜果果形方法如下：

以天根快捷型植物基因组DNA提取系统试剂盒提取待测槟榔样品的基因组DNA，使用试剂盒中DNA浓度的检测方法，通过超微量分光光度计测提取好的DNA浓度，以提取好的DNA与引物SSR-2-F和SSR-2-R进行PCR扩增反应，得到的扩增产物进行凝胶电泳；根据凝胶电泳图及不同果形的碱基简单重复序列差异大小来确定，引物SSR-2-F和SSR-2-R可以明显区分柱形果与卵形、球形果，具有特异性。本发明利用槟榔不同果形的微卫星重复单位的数目高度变异造成多个位点的多态性,根据差异基因在不同处理的表达量的趋势变化不同,得到鉴别槟榔鲜果果形的检测引物SSR-2-F和SSR-2-R，该引物对槟榔鲜果果形的鉴别具有较高的特异性，具有特异性强、易于操作、高多态性、高重复性、高信息量及结果可靠的特征,具有极大的潜在应用价值。本发明开发的SSR分子标记引物,只需提供样品,按照所提供的方法进行检测,即可确定槟榔未成熟鲜果的形状,为后筛选不同形状的果实提高经济效益提供依据。

下面将结合实施例及实验数据对本申请用于快速鉴别槟榔鲜果果形的SSR分子标记引物、试剂盒及应用进行详细说明。

实施例1

本实施例用于快速鉴别槟榔鲜果果形的SSR分子标记的引物SSR2的筛选方法，如图1所示，包括以下步骤：

S101，槟榔种植园收集135份槟榔无病嫩叶，其中，123份来自中国海南省，12份来自越南，每份槟榔嫩叶的种群没有明显分化，植株长势好，产量高，座果率高，叶片嫩绿。

S102，样品的收集：在同一时间段进行槟榔幼叶和槟榔鲜果的采摘工作，对不同果形的槟榔进行分类拍照，采摘后的样品用75％乙醇擦拭干净，于液氮中冷冻后置于-80℃保存，便于保存样本及提取槟榔叶片DNA，用天根快捷型植物基因组DNA提取系统试剂盒提取样品的基因组DNA，-20℃冻存。

S103，SSR设计引物：根据已有总的槟榔基因变异位点的VCF文件，利用MISA结合Primer5进行SSR设计引物进行PCR扩增，50对引物简单命名为SSR-1、SSR3-50。

具体的，利用SSR软件设计引物包括：

设计好的结果文件中data.fasta.misa:可使用任意文本编辑器打开，如Excel、NotePad++等，是展示处理结果的重要文件，包括ID:基因的ID；SSR nr.:SSR的编号；SSRtype:SSR的类型，p1代表重复一个碱基，p2是两个，c代表复杂的；SSR:A(31)代表A重复31次；size:大小；start/end:起始位点；data.statistics:基于序列和分析进行相关的统计项目；reslut.xls:完成的引物设计以及相关指标。

S104，引物特异性验证，以不同SSR引物对不同槟榔果形的DNA进行PCR扩增：分别将每种槟榔果形的不同品种DNA分别与同一引物进行PCR扩增，PCR扩增产物进行凝胶电泳，检查其电泳图条带的位置及条数，目的条带的大小分别为200bp-300bp和1000bp-1500bp。

具体的，引物特异性验证包括：以提取无病害的槟榔嫩叶的DNA为模板，不同的引物进行PCR扩增，扩增出的凝胶电泳图条带位置及条数，与SSR软件设计的引物bp大小进行比较，以检验该引物的特异性。

经过筛选，得到对槟榔鲜果果形的鉴别具有较高的特异性引物SSR2，具体如下：

SSR-2-F:GAGAAGAGGGGAAGGGAGAA

SSR-2-R:TCTTCCTGGCGGTGATCTAT

其中,所述引物对中的两条单链DNA既可上游引物F或下游引物R单独分装到一管,也可等摩尔混合包装。

本实施例中SSR软件设计的引物如下：

本实施例135份槟榔种质来源如下：

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实施例2

本实施例对SSR-2进行进一步验证，具体包括：

(1)以SSR-2-F和SSR-2-R为引物，对鲜果为球形、卵形和柱形3种果形的槟榔叶片样品的基因组DNA进行PCR扩增，其中每种果形选取5个种质，其鲜果果形如图2，PCR反应体系具体如下：

总反应体系20μL：

2*Rapid Taq Master Mix:10μL；

SSR-F:0.5μL；

SSR-R:0.5μL；

DNA:1μL；

ddH2O：8μL；

PCR反应程序：94°预变形10min；94°变性30s,55°退火30s,72°延伸90s，共35个循环；72°补延伸10min。

(2)PCR扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳检测，获得凝胶电泳图谱(如图3)。

图2中，S105为槟榔卵形鲜果，S106为槟榔球形鲜果，S107为槟榔柱形鲜果。

本实施例以5份卵形、5份柱形、5份球形槟榔鲜果果实的叶片DNA为模板进行PCR扩增，所得凝胶电泳图谱如图3所示，包括：

M,DL2000 Plus DNAMarker；

泳道1-5,依次为乐东黎族尖峰岭卵形B7、乐东黎族尖峰岭卵形B8、乐东黎族尖峰岭卵形B9、乐东黎族尖峰岭、乐东黎族尖峰岭卵形B10、乐东黎族尖峰岭卵形B11；

泳道6-10，依次为乐东黎族尖峰岭球形Y19、乐东黎族尖峰岭球形Y21、乐东黎族尖峰岭球形Y22、乐东黎族尖峰岭球形Y20、乐东黎族尖峰岭球形Y13；

泳道11-15，依次为乐东黎族尖峰岭柱形C7、乐东黎族尖峰岭柱形C8、乐东黎族尖峰岭柱形C9、乐东黎族尖峰岭柱形C10、乐东黎族尖峰岭柱形C11乐东黎族尖峰岭。

从图3可知，泳道1-10有亮度明显的条带且条带位置在200bp-300bp处，泳道11-15有条带且条带位置在200bp-300bp处，此外在1000bp-1500bp出还有一条条带。即以SSR2为引物对待测样品DNA进行PCR扩增，扩增产物进行凝胶电泳，根据电泳图的条带条数及位置，有两条条带，且位置分别在200bp-300bp和1000bp-1500bp处，则说明该果形为柱形果实，只有单条带的果形是卵、球形果实。

综上所述，本发明可利用SSR-2为引物PCR扩增待测槟榔基因组DNA，根据所述凝胶电泳图谱鉴别所述待测槟榔样品的鲜果果形：若所述凝胶电泳图谱中，有条带且条带位置在200bp-300bp处，则所述待测槟榔样品的鲜果果形为卵形或球形；若所述凝胶电泳图谱中，有两条条带，且位置分别在200bp-300bp和1000bp-1500bp处，则所述待测槟榔样品的鲜果果形为柱形。

本发明所用DNA提取方法以及所用试剂皆可在确认原理的情况下进行替换。

最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。