一种低氧环境下提高骨髓间充质干细胞活率的方法

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种低氧环境下提高骨髓间充质干细胞活率的方法。

背景技术

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是起源于生物体早期中胚层的一类多能干细胞，它们具有自我复制和向多种细胞系（向成脂、成软骨、成骨等）分化的潜能，是组织工程、再生医学和细胞治疗领域一种具有极高研究价值与应用前景的细胞类型。MSCs来源广泛，主要包括骨髓、脐带、脐带血、胎盘、外周血、牙髓、脂肪组织、肝脏和肺等，人脐带间充质干细胞（human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells，hUC-MSCs）因为具有低免疫原性、易分离获取、少伦理争议等优点，在MSCs的研究中得到的应用越来越多。

现有的低氧环境下提高细胞活率的方法包括以下几种：将细胞暴露在低氧环境中一定时间，以促进细胞适应低氧环境，提高细胞在低氧条件下的存活率和功能。或者应用适当的氧化剂和抗氧化剂、细胞保护剂、细胞工程技术等方法使细胞代谢和能量产生，减轻低氧对细胞的损伤，提高细胞的存活率和功能。总的来说，低氧环境下提高细胞活率的方法还在不断探索和完善中，需要更多的研究来验证其有效性和安全性。

现有的低氧环境下提高细胞活率的方法虽然有一定的效果，但仍存在一些缺陷，如下：

1. 方法的可靠性和稳定性有待验证：目前，低氧环境下提高细胞活率的方法研究太少，且诱导培养后的细胞增殖缓慢、存活率不能得到有效的提高。

2. 方法的安全性有待评估：在低氧环境下提高细胞活率的方法中，有些方法需要应用外源性物质，这些物质的安全性需要进一步评估。

3. 方法的操作复杂度高：有些方法需要应用复杂的细胞工程技术或代谢调节剂，操作复杂度高，需要专业技术人员进行操作。

4. 方法的成本较高：有些方法需要应用昂贵的细胞保护剂或代谢调节剂，成本较高，限制了其在临床应用中的推广。

发明内容

为此，本发明提供一种低氧环境下提高骨髓间充质干细胞活率的方法，以解决现有方法的可靠性和稳定性有待验证、操作复杂、成本高等问题。

低氧环境下提高细胞活率的研究目的是为了改善细胞在低氧条件下的存活和功能，特别是在细胞移植和组织工程等应用中。在这些应用中，细胞常常需要在低氧的环境中生长和存活，而低氧会导致细胞凋亡、代谢紊乱和功能降低等问题，从而影响治疗效果。

低氧环境下提高细胞活率的研究旨在寻找一种有效的方法来解决细胞在低氧条件下的存活和功能问题，从而为细胞移植和组织工程等应用提供更好的治疗效果。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

根据本发明提供的一种低氧环境下提高骨髓间充质干细胞活率的方法，包括：

步骤一，获取骨髓间充质干细胞，并培养至第三代（F3）；

步骤二，选取生长良好的第三代（F3）细胞，进行细胞融合培养，培养至细胞融合到70%-80%时，更换培养基；

所述培养基为在无血清去培养基中加入0.1-1 mM谷胱甘肽、0.1-1 mM维生素E、10-100μM那霉素、5-25μM水杨酸、5-10 ng/mL表皮生长因子EGF、0.1%-1%的白蛋白、15-25mM的HEPES缓冲液的混合培养基；

步骤三，更换培养基后，放到通入含5%氧气和95%氮气的三气培养箱中低氧继续培养，得骨髓间充质干细胞。

进一步的，所述步骤一中，培养的培养基为培养基为DMEM(90%)+胎牛血清(10%)+青链毒素（500U/ml）。

进一步的，所述步骤一中，培养条件为37℃、5%CO

进一步的，所述步骤一中，培养传代条件为经0.25%胰酶消化，1:2传代。

进一步的，传代培养的接种密度1×10

进一步的，所述步骤二中，融合培养接种密度为（0.05-2）×10

进一步的，所述步骤三中，培养箱温度为37℃。

进一步的，所述步骤三中，骨髓间充质干细胞阳性表达CD90和CD44；阴性表达CD34。

1.谷胱甘肽浓度范围为0.1-1 mM。

谷光甘肽是一种三肽，由谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸组成。它主要通过捕捉自由基，从而减轻氧化应激，防止细胞和组织受到氧化损伤。谷光甘肽还可以促进细胞的代谢和修复，增强机体的免疫力。

2.维生素E浓度范围为0.1-1 mM。

维生素E是一种脂溶性维生素，主要存在于细胞膜中的脂质层中，可以保护细胞膜不受自由基的氧化损伤。它主要作用于脂质过氧化反应链，通过捕捉脂质过氧化产生的自由基，从而防止细胞膜的氧化损伤。

3.那霉素优选氨基糖苷类抗生素卡那霉素，浓度范围为10-100μM。

卡那霉素(Kanamycin sulfate)是一种氨基糖苷类抗生素，对革兰氏阳性菌和阴性菌及支原体都有抑制作用，作用机制在于靶向结合细菌70S核糖体亚基，从而抑制核糖体易位和引起错误编码进一步干扰蛋白质合成。卡那霉素可用在细胞培养中抑制多种细菌污染。

4.调节细胞周期的物质水杨酸浓度范围为5-25μM。

水杨酸是一种天然的药物分子，具有多种生物活性和医学应用价值。 水杨酸可以抑制炎症介质的合成和释放，如前列腺素、白细胞介素等，从而减轻炎症反应的程度。低氧环境下，细胞会释放一些炎症介质，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）等，导致炎症反应的加剧和细胞的损伤。水杨酸可以抑制这些炎症介质的产生和释放，从而减轻炎症反应的程度，保护细胞免受炎症损伤。

5.表皮生长因子(EGF)5-10 ng/mL。

表皮生长因子（EGF）是一种生长因子，对于细胞的生长、分化和修复等方面具有重要的作用。EGF能够结合到细胞表面上的EGFR（表皮生长因子受体）上，激活EGFR的信号通路，从而促进细胞的增殖和分化。这种作用对于细胞的生长和发育非常重要，同时也可以促进组织的修复和再生。

6.0.1%-1%的白蛋白。

白蛋白是一种血浆蛋白质，占据了血浆总蛋白的60%以上。它是由肝脏合成的，主要的成分是蛋白质分子。在低氧环境中，细胞内外的渗透压差异会增大，导致细胞内的水分子向外渗透，从而导致细胞膜的破裂和细胞功能的损伤。而白蛋白可以通过维持血浆渗透压平衡，保护细胞免受水分子的损害。在低氧环境中，细胞往往会出现代谢异常，需要大量的营养物质来维持正常的代谢和生存。而白蛋白可以为细胞提供营养物质，保证细胞正常的代谢和生存。

7. HEPES缓冲液，浓度为 15-25 mM，HEPES 对细胞没有营养价值，但可以添加到pH 7.2 至 7.6 的缓冲细胞培养基中。可提供额外的缓冲能力，以帮助维持 pH 值的稳定。

本发明具有如下优点：

本发明优化细胞培养的方法，通过调节培养环境，促进细胞代谢和能量产生，增强细胞抗氧化能力，提高细胞在低氧环境下的适应能力和生存率。

本发明解决目前骨髓间充质干细胞诱导方法复杂繁琐的问题。

本发明的方法成本低，可在临床中推广。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。

本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。

图1为本发明实施例1提供的显微镜下MSC组和MSC-NTF组的细胞形态图，图中，A：MSC组；B：MSC-NTF组；

图2为本发明实施例1提供的细胞在不同环境中培养了24h后，测的细胞量的改变图；

图3为本发明实施例1提供的细胞在不同环境中培养了24h后，测的细胞活率的改变图；

图4为本发明实施例2提供的细胞在不同环境下培养不同时间段的测cck-8细胞增殖活性检测的对比图；

图5为本发明实验例提供的细胞在不同那霉素中培养了24h后，测的细胞量的改变图；

图6为本发明实验例提供的细胞在不同那霉素中培养了24h后，测的细胞活率的改变图；

图7为本发明实验例提供的细胞在不同那霉素中培养不同时间段的测cck-8细胞增殖活性检测的对比图。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例提供一种低氧环境下提高骨髓间充质干细胞活率的方法：

步骤一，大鼠BMSCs提取：

1.采集骨髓样本：选择4周龄SD大鼠，用氯化钠巴比妥腹腔注射麻醉，取大鼠的股骨或胫骨，带含有青链霉素的PBS溶液冲洗骨髓腔，收集样本。

2. 分离BMSCs：将采集到的骨髓样本通过筛网或离心等方法分离出单个的骨髓间充质细胞。

3. 培养BMSCs：将分离出的BMSCs放入培养基为DMEM(90%)+胎牛血清(10%)+青链毒素（500U/ml）置于37℃、5%CO

4. 细胞形态及鉴定：显微镜下观察细胞形态单一，呈梭形或扁平型，进行表面标记物检测，BMSCs阳性表达CD90和CD44,CD34阴性表达，符合BMSCs的表面标志物特征。证实我们体外分离培养的细胞为纯化的BMSCs。

步骤二，培养

将F3代的BMSCs进行以下实验，首先将BMSCs接种到6孔板里边，每孔的接种密度为2*10

如图1所示，MSC组显微镜下由典型的长梭形变成多角形或星形；细胞体积增大，呈宽大扁平状；胞浆内可见有细小的颗粒；细胞培养基上清中可见细胞分泌物增多；细胞折光度变差，黏附能力增加，而MSC-NTF组，细胞状态良好，呈典型的梭形细胞，且镜下细胞的密度远大于MSC组。

如图2和图3为诱导完成后对细胞计数的结果收集；发现MSC组活细胞浓度与细胞活率都远小于MSC-NTF组。

实施例2

本实施例提供一种低氧环境下提高骨髓间充质干细胞活率的方法：

步骤一，同实施例1；

步骤二，将F3代的细胞接种到96孔板中，每孔的接种密度为0.5*10

如图4所示，在低氧环境下3h、6h、12h、24h后，使用cck-8细胞增殖活性试剂盒测细胞的增殖活性，在3h和6h时，两者增殖活性基本没有发生太大改变，在第12h检测，发现两者增殖活性开始有显著差异，MSC组在低氧环境中细胞活力减慢且活性下降，24h后急剧下降，而MSC-NTF组，细胞活力没有下降，且24h后细胞还在增殖。

实施例3

本实施例提供一种低氧环境下提高骨髓间充质干细胞活率的方法：

步骤一，同实施例1；

步骤二，将F3代的细胞接种到96孔板中，每孔的接种密度为0.5*10

如图4所示，在低氧环境下3h、6h、12h、24h后，使用cck-8细胞增殖活性试剂盒测细胞的增殖活性，在3h和6h时，两者增殖活性基本没有发生太大改变，在第12h检测，发现两者增殖活性开始有显著差异，MSC组在低氧环境中细胞活力减慢且活性下降，24h后急剧下降，而MSC-NTF组，细胞活力没有下降，且24h后细胞还在增殖。

实验例

在实施例1的技术上，细胞在不同那霉素中培养了24h后，细胞的细胞量和存活率；具体为分别对使用卡那霉素（实施例1）、普那霉素（实施例2）和那他霉素（实施例3）后对细胞计数的结果收集，结果如图5所示；细胞存活率如图6所示，发现三组数据的活细胞浓度与细胞活率都没有明显差异。

在实施例2的基础上，细胞在不同那霉素中培养不同时间段的cck-8细胞增殖活性。在低氧环境下3h、6h、12h、24h后，使用cck-8细胞增殖活性试剂盒测细胞的增殖活性，如图7所示，分别使用卡那霉素（实施例1）、普那霉素（实施例2）和那他霉素（实施例3）后，三者细胞增殖活性基本没有发生太大改变。

经过上述实验验证，说明我们的诱导方案确实有利于细胞在低氧环境中的生存。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。