一种原发性肺癌辅助诊断panel、试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于基因工程及肿瘤医学技术领域，具体涉及一种原发性肺癌辅助诊断panel、试剂盒及其应用。

背景技术

肺癌已成为目前全球受累人数最多的恶性肿瘤，在全球的总体发病率和死亡率长期位居所有恶性肿瘤之首。既往研究报道，肺癌的发生受到遗传和环境因素(主要是烟草暴露)的共同作用。同等环境因素暴露下，具有不同遗传背景的个体对肺癌的易感性不同。胚系遗传变异是导致个体对肺癌发病易感性差异的重要遗传基础。近年来，在肿瘤和心脑血管疾病等常见重大疾病中，遗传变异谱辅助诊断的应用价值已初见端倪。但是，目前GWAS鉴定的常见遗传变异(最小等位基因频率≥0.5％)只能解释一小部分疾病易感性。近期测序研究发现，罕见遗传变异(最小等位基因频率＜0.5％)的数目远超过常见遗传变异，可能是疾病易感性的重要来源。

同源修复(Homologous Recombination，HR)通路和范可尼贫血(Fanconi Anemia，FA)通路在肿瘤发生发展中扮演着重要的角色，它们与维护基因组的完整性和稳定性密切相关，对于预防肿瘤的发生至关重要。同源修复通路是一种DNA修复机制，用于修复DNA双链断裂(Double-Strand Breaks，DSBs)。DNA损伤如果没有适时和有效地修复，会导致基因组不稳定性，进而促进肿瘤的形成。HR通路通过使用相同或相似的DNA序列作为模板，准确地修复双链断裂，确保了DNA的正确复制和继承。这对于维持细胞的基因组稳定性和抵御肿瘤发展至关重要。一些肿瘤细胞会发生HR通路的缺陷，从而导致其对DNA损伤更为敏感，但同时也使它们对某些特定的治疗手段更加脆弱，如PARP抑制剂等。范可尼贫血通路是一种多基因参与的DNA修复通路，它主要参与修复DNA插入/删除(Insertion/Deletion，Indels)和DNA交联，其通路中的基因产物负责维持DNA的修复和解交联能力，以防止损伤在细胞分裂中引发突变。因此范可尼贫血通路基因的缺陷会导致DNA损伤的积累，增加遗传变异和基因组不稳定性的风险。在肺癌中，这些修复通路可能受到调控、突变或功能缺陷的影响，尤其是编码区的突变可能会导致基因表达的异常，促进肺癌的发生。

综上，HR通路和FA通路在肿瘤发生发展中的重要性不可忽视。它们的功能异常或缺陷与肿瘤易感性和治疗反应性密切相关，对于深入理解肿瘤生物学以及开发新的治疗策略具有重要的指导意义。因此，基于我们研究发现，将位于HR通路和FA通路基因特定区域为主的罕见功能性变异作为原发性肺癌的生物标志物，并研制相应的诊断试剂盒，对我国原发性肺癌的筛查和早期诊断必将是一次有力的推动，也可为其药物筛选、药效评价及靶向治疗开辟新的途径。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种原发性肺癌辅助诊断panel、试剂盒及其应用。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

本发明第一方面公开了一系列罕见功能性突变区域的组合用于辅助诊断原发性肺癌，该些罕见功能性突变区域如序号1至569所示(具体参见下表1)。本发明的panel包括如下序号1至569所示的罕见功能性突变区域的90％及以上，检测的罕见功能性突变区域越多，则预测的患肺癌的风险的准确度越高。

根据某些具体实施方式，所述panel包括序号1至569所示的罕见功能性突变区域的91％及以上，优选92％及以上，优选93％及以上，优选94％及以上，优选95％及以上，优选96％及以上，优选97％及以上，优选98％及以上，优选99％及以上，最优选所述panel包括序号1至569所示的罕见功能性突变区域。

根据某些具体实施方式，所述panel为序号1至569所示的罕见功能性突变区域的组合。

本发明第二方面公开了用于检测上述原发性肺癌辅助诊断panel的特异性引物对，序号1至569所示突变区域对应的引物对如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.1138所示。

本发明第三方面公开了上述原发性肺癌辅助诊断panel在制备原发性肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。

本发明第四方面公开了所述的罕见功能性突变区域的引物对在制备肺癌辅助诊断试剂盒中的应用，每个罕见功能性突变区域对应一对引物对。该些引物对详见下表1。

本发明第五方面还公开了一种肺癌辅助诊断试剂盒，该试剂盒用于检测外周血DNA中HR通路和FA通路基因的特定区域。

本发明又公开了所述的诊断试剂盒，含有的检测罕见功能性突变区域的特异性引物。

根据某些实施方式，所述试剂盒还含有相应PCR技术所需的常用试剂，如PCR反应常用的酶和试剂，如Taq酶、dNTP、混合液、MgCl

本发明通过鉴定和研究肺癌患者及与其年龄性别匹配的健康对照外周血DNA中的罕见变异，寻找与肺癌发生相关的高特异性区域，并识别其中的罕见功能性变异，进而研制出可应用于临床或人群的肺癌辅助诊断试剂盒，为肺癌早期筛查和诊断提供支持，为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物提供数据支持。

本发明采用严密的验证和评价体系，本发明人初期采用二代测序技术对全基因组遗传变异进行扫描，并以区域为单位比较在原发性肺癌病例与健康对照中的罕见功能性变异分布差异，进而识别了与肺癌发生相关的HR通路和FA通路基因的特定区域。随后应用捕获测序方法在扩大样本散发型肺癌患者中进行了检测和验证；以上方法和策略的应用加速和保证了遗传变异生物标志物和诊断试剂盒在临床上的应用，也为其他疾病生物标志物的研制提供方法和策略上的借鉴。

本发明通过匹配的方式控制年龄对疾病发展的影响，研究罕见功能性突变在肺癌筛查和辅助诊断的应用前景，阐述这些突变对于肺癌发生的影响，揭示其应用价值。

由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

本发明提供的罕见功能性突变区域组合作为肺癌辅助判断的标志物的优越性在于：

(1)遗传变异是一种新型基因生物标志物，区别于传统生物标志物，稳定、微创、易于检测，该类生物标志物的成功开发将为肺癌的筛查和诊断开创全新局面，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。

(2)本发明获得了肺癌发病相关罕见功能性突变谱和特异性标志物；通过遗传变异序列的改变进行相关诊断试剂盒的研制和应用，可使得肺癌的筛查和诊断更加方便易行，为更快更好的识别早起肺癌患者提供可行性，为临床治疗效果评价奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。

具体实施方式

图1为实施例4的肺癌患病组与健康对照组的突变负荷评分S≥1的样本比例对比图；

图2为对比例1的肺癌患病组与健康对照组的突变负荷评分S≥1的样本比例对比图。

具体实施方式

在下文中，仅简单地描述了某些示例性实施例。正如本领域技术人员可认识到的那样，在不脱离本发明实施例的精神或范围的情况下，可通过各种不同方式修改所描述的实施例。因此，附图和描述被认为本质上是示例性的而非限制性的。在本发明实施例的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

本发明解决问题的技术方案包括(1)建立统一标准的标本库和数据库：以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料。(2)全基因组测序检测：在全基因组范围内检测与肺癌发生相关的突变。(3)通过变异筛选和外部验证发现HR通路和FA通路基因特定区域富集存在与肺癌发生相关的罕见功能性变异。(4)对筛选出的突变，进行功能注释，并计算目标区域内的突变负荷评分。(5)肺癌辅助诊断试剂盒的研制：根据肺癌病例和健康对照中筛选出的突变负荷评分S≥1的样本比例存在显著差异的区域开发辅助诊断试剂盒。

实施例1样品的收集和样品资料的整理

发明人于2010年开始至2018年从南京医科大学肿瘤中心及社区正常人群中，以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，收集了大量的肺癌患者及正常人群的血标本。通过对样品资料的整理，发明人从中选择了符合下列标准的实验样品：

1、病理学明确诊断的无家族史散发型肺癌患者初筛样本2984例；

2、病理学明确诊断的无家族史散发型肺癌患者验证样本2243例；

3、无肿瘤家族史，与病例性别年龄匹配的健康对照3020例；

并系统采集了这些样本的人口学资料和临床资料等情况。

实施例2外周血DNA中突变的测序检测

在上述符合条件的肺癌患者和健康对照中，采用二代测序检测获得相关结果。具体步骤为：

1、向储存于2ml冻存管中的白细胞加入溶血试剂，颠倒混匀后完全转入。

2、去除红细胞：用溶血试剂将5ml离心管补至4ml，颠倒混匀，4000rpm离心10分钟，弃上清。向沉淀中加入4ml溶血试剂，再次颠倒混匀清洗一次，4000rpm离心10分钟，弃上清。

3、抽提DNA：向沉淀中加1ml抽提液(每300ml中含有122.5ml 0.2M氯化钠，14.4ml0.5M乙二胺四乙酸，15ml 10％十二烷基硫酸钠，148.1ml双蒸水，下同)和8μl蛋白酶K，震荡器上充分震荡混匀，37℃水浴过夜。

4、去除蛋白质：加1ml饱和酚充分混匀(手轻摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清转入新的5ml离心管中。在上清液中加入等体积氯仿与异戊醇混合液(氯仿：异戊醇＝24：1，v/v，下同)，充分混匀后(手摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清(分入两个1.5ml的离心管)。

5、DNA沉淀：在上清液中加入3M的醋酸钠60μl,再加入与上清液等体积的冰无水乙醇，上下轻摇，可见白色絮状沉淀物，再以12000rpm离心10min。

6、DNA洗涤：在沉淀中加入冰无水乙醇1ml,12000rpm离心10min,弃上清后真空抽干或置于清洁干燥环境中蒸干。

7、测量浓度:通常能得到20-50ng/μl DNA，纯度(紫外260OD与280OD比值)在1.6-2.0。

8、DNA片段化体系50μl：包括模板35ul，片段化酶5μl，片段化缓冲液10μl。反应程序：37℃12min，4℃保存。

9、DNA末端修复加A尾体系60μl：包括上轮产物50ul，Mix酶3μl，反应缓冲液7μl。反应程序：65℃30min，4℃保存。

10、DNA接头连接体系110μl：包括上轮产物60μl，接头序列5μl，连接缓冲液30μl，连接酶10μl，H2O补足至110μl。反应程序：20℃30min，4℃保存。

11、接头产物纯化体系198μl：包括上轮产物110μl，DNA磁珠88μl。吹打彻底混匀后室温下孵育5min后置于磁力架上，弃上清液，加入200μl 80％乙醇洗脱30秒，弃上清液，重复该洗脱步骤一遍。待磁珠晾干微裂后加入25μl洗脱液洗脱。吹打混匀10次后置于室温孵育2min，再在磁力架上静置5min直到上液澄清，吸取上清液保存待用。

12、DNA文库PCR富集体系50μl：包括上轮上清液20μl，2xPCR MIX 25μl，上下游扩增引物5μl。PCR反应程序：98℃45s；(98℃15s；60℃30s；72℃30s)×6个循环；72℃1min；4℃保存。

13、PCR产物纯化体系100μl：包括上轮产物50μl，DNA磁珠50μl。吹打混匀后室温下孵育5min后置于磁力架上弃上清液，加入200μl 80％乙醇洗脱30秒，弃上清液，重复洗脱一遍。待磁珠微裂后加入30μl洗脱液洗脱。吹打混匀10次后置于室温孵育2min，磁力架上静置5min直到上液澄清，吸取上清液作为最终文库保存待用。

13、采用Illumina Nova 6000平台对最终文库进行二代测序；比较肺癌病例与健康对照中的变异分布差异。

14、使用BWA软件将序列比对到人类参考基因组(GRCh37/hg19)上，使用GATK软件进行遗传变异的基因分型。

为了进一步研究这些变异的综合指征并用于原发性肺癌的筛检，我们以序号1至569所示的突变区域集合为目标区域，对2984例肺癌患者初筛样本以及3020例健康对照的目标区域内满足条件的变异进行基因型评分，进而计算每个研究对象的突变负荷评分S。

具体来说，我们对目标区域内满足条件的变异进行基因型评分，野生纯合型＝“0”，杂合型＝“1”，变异纯合型＝“2”，进而计算每个研究对象的突变负荷评分S，计算方法如下：

运用χ2检验(用于分类变量)或者student t检验(用于连续性变量)比较人口学特征等在研究对象组间分布的差异；运用Fisher检验比较突变负荷评分S≥1的样本比例在研究对象组间的差异。

分析发现肺癌病例中S≥1的样本比例显著高于健康对照，其中，病例突变位点238个，病例携带率为277人/2984人＝9.28％，对照突变位点44个，对照携带率为50人/3020人＝1.66％，OR＝6.03，P<2e-16。

其中，病例的238个突变位点分别为：chr9:98003014TTTGGCTTTCATCTACAAA>T、chr17:33434458T>TTA、chr14:24709357A>T、chr17:56780562C>T、chr5:74892572AT>A、chr19:45922397TC>T、chr22:29095873C>A、chr17:7577538C>T、chr8:30990014C>T、chr12:2997423AAGATC>A、chr11:108155135C>T、chr6:30679456G>A、chr16:89858394ACT>A、chr7:7677535A>T、chr8:30925792C>T、chr6:26285646G>A、chr13:32912809CAA>C、chr12:2997554C>T、chr16:89806417G>GA、chr15:66641462CT>C、chr19:50906322AG>A、chr17:56809879G>T、chr16:23640959A>G、chr9:98002937C>T、chr7:73653255T>A、chr5:131931460A>AT、chr11:108121593CAA>C、chr4:84388678C>CA、chr13:32912308G>GT、chr7:116411974C>T、chr14:45644601A>T、chr12:56822139G>A、chr11:108115727C>T、chr5:74877180C>T、chr12:1025543G>A、chr16:89815120G>A、chr17:1798345C>T、chr13:32913453G>GT、chr17:33428225G>A、chr11:108114696C>G、chr2:17955667C>T、chr8:90965734A>ATCTGT、chr8:90965735A>ATCTGT、chr19:50910411GT>G、chr14:45665687C>T、chr5:131925464G>T、chr2:215593706G>C、chr10:50690757TC>T、chr3:121202346G>A、chr11:108099934CAG>C、chr22:29099491A>T、chr16:23647116G>A、chr8:31000151TG>T、chr7:116398512G>A、chr1:114454385CA>C、chr5:131945031CAAAG>C、chr3:121217450A>T、chr1:114449622C>CTAGA、chr10:50732089G>A、chr2:128047075A>AT、chr1:17350470G>A、chr5:131939690C>T、chr19:50906309G>A、chr19:44079144GCA>G、chr7:124469307C>T、chr12:4653069A>T、chr15:66629520C>T、chr11:108203577CTTATA>C、chr7:124481102G>A、chr8:95405970C>A、chr7:7679949A>G、chr17:79977182A>G、chr13:32972297A>G、chr11:94209454C>T、chr19:4182532G>T、chr13:32911297TAAAC>T、chr17:79977541C>A、chr3:121263746G>T、chr10:50732695T>TGG、chr11:108175581T>C、chr3:121187276GTCCTAAAATCAAGCAGAATAAAGACA>G、chr10:50678747G>A、chr14:45645691T>TA、chr16:89862422C>CG、chr14:68292212TGAAGGTGACTGGTC>T、chr2:215610508TTC>T、chr5:131977922CAT>C、chr5:131939148C>A、chr13:32972800C>T、chr8:90982610AT>A、chr13:32912809CA>C、chr19:44056353G>A、chr9:97873784G>T、chr8:95423454T>TA、chr7:48018345AG>A、chr14:24711466C>A、chr14:45653106G>C、chr8:95392455GC>G、chr13:32913003TGACCTTCCAGG>T、chr11:108100030TC>T、chr11:108202762G>T、chr16:89838094C>A、chr8:30938648C>T、chr16:89858347G>A、chr13:32968825G>T、chr15:66641764C>CA、chr3:121212471C>CT、chr9:116171924C>CT、chr11:94169066C>A、chr11:108160530T>C、chr17:33428385C>T、chr14:45633670C>T、chr2:128051233CG>C、chr8:30969168CA>C、chr2:17954016TA>T、chr11:94204745TA>T、chr11:108175413CTT>C、chr11:94163154T>A、chr10:50732179C>A、chr16:89805276C>CA、chr3:121208535CGGGT>C、chr8:95416360G>A、chr12:56824062G>A、chr3:121252057C>A、chr14:45645820A>AT、chr10:50678345G>A、chr8:90971083C>G、chr7:73657577C>T、chr5:68687724C>G、chr16:14026143G>A、chr10:50680507G>A、chr17:33430317G>A、chr10:50682171AC>A、chr9:133729453G>A、chr14:45658155C>T、chr2:128050332G>A、chr10:50691391C>A、chr22:29121316C>CT、chr3:121240974G>GCATTCAGA、chr16:89809333CAG>C、chr12:56816668G>A、chr19:44056323G>A、chr1:114454224TCTGG>T、chr14:104165914CTG>C、chr7:96324111G>A、chr3:121212325CT>C、chr1:114450783C>T、chr7:48018027AC>A、chr5:131978716GCT>G、chr13:32913676CA>C、chr22:29099555CTAAGAAGAGGGGG>C、chr8:30938676TA>T、chr6:26285432TA>T、chr5:131931348CAG>C、chr3:121217352G>A、chr22:29091114C>T、chr5:131927649CA>C、chr3:121207489A>T、chr8:90965672T>A、chr16:14028104AG>A、chr16:14029251A>T、chr22:38934291AAGATATACCTTCTG>A、chr16:23641306CAT>C、chr3:121208092CTATT>C、chr12:56822752TACGG>T、chr9:98002929AC>A、chr16:23614914G>GT、chr6:26285505CTG>C、chr7:116371770C>T、chr13:32914935CTA>C、chr8:31012137TAGAC>T、chr16:89842153C>A、chr12:56826907C>T、chr16:89805287T>TA、chr16:89871690G>GA、chr6:27775652CG>C、chr2:17954049GAAGT>G、chr22:29121113C>T、chr17:7577139G>A、chr11:108153504AT>A、chr12:56822050GA>G、chr22:29121258G>T、chr13:32914277AT>A、chr13:32954050G>A、chr14:45657060GAC>G、chr16:23641656GAA>G、chr8:90983520T>C、chr7:48018103G>A、chr13:32914084CAT>C、chr20:62326680G>A、chr8:90965793T>TA、chr16:89807249GAGA>G、chr22:38916095C>G、chr19:50905267G>T、chr3:121151216CAG>C、chr13:32913619TTATG>T、chr5:176385110CAG>C、chr2:215610579C>A、chr6:30671423G>GT、chr8:90965921T>C、chr6:37328291C>T、chr13:32913558C>CA、chr6:37358588G>A、chr10:50736472C>A、chr5:131923695T>A、chr3:121208067A>T、chr5:131978039G>GGATTCAATGTTCA、chr1:17349179C>T、chr13:32900726AC>A、chr9:97869349AG>A、chr4:1980623C>CA、chr7:44156101GT>G、chr8:95406084C>A、chr12:56825277G>A、chr10:50738783G>A、chr11:94192749T>C、chr12:1042188C>CA、chr19:44047763C>T、chr17:56787218A>C、chr13:32906602GA>G、chr16:89805582CTG>C、chr11:108188140AT>A、chr5:131931451T>TA、chr8:95390434TCA>T、chr8:30958448TC>T、chr13:32911601C>T、chr11:108199798AAATGGAAAAAT>A、chr5:131924436TA>T、chr16:23647422TC>T、chr13:32914973GACAA>G、chr6:26158569A>T、chr14:24709467ACCTGGCTT>A、chr4:84390189G>GT、chr3:121240921CTTAA>C、chr3:121240928G>A、chr16:23646416A>T、chr13:32913418TG>T以及chr12:2997109CT>C。

对照的44个突变位点分别为：chr11:108199798AAATGGAAAAAT>A、chr8:95384595TG>T、chr5:131931460A>AT、chr5:74892172AAAGAT>A、chr5:131973889C>T、chr5:131915055C>T、chr10:50690757TC>T、chr8:95392455GC>G、chr3:121187228C>CA、chr3:121202346G>A、chr9:98002937C>T、chr17:33428366G>A、chr16:23625413C>T、chr22:29121258G>T、chr2:17962975CAAAG>C、chr3:121187276GTCCTAAAATCAAGCAGAATAAAGACA>G、chr16:23646668T>TC、chr3:121263721T>A、chr13:32912958AAATAC>A、chr12:2997554C>T、chr13:32913032GA>G、chr16:89831344C>CAG、chr2:215645676GAT>G、chr3:121207489A>T、chr12:2997396C>A、chr10:50736472C>A、chr8:90965835TTG>T、chr2:17955667C>T、chr8:30933772CA>C、chr5:131931451T>TA、chr11:108175407AACTG>A、chr8:30958399T>TA、chr14:45605327A>ACCTCAGAGCCCTGGCAG、chr17:33428225G>A、chr9:97897627C>T、chr1:114450747C>T、chr12:2997423AAGATC>A、chr11:108106510AT>A、chr10:50678230G>T、chr5:131945031CAAAG>C、chr5:131923252A>C、chr3:121208809TTTCTTGCTCTGA>T、chr12:56824664C>T以及chr16:14026143G>A。

实施例3组合区域的特定区域捕获测序鉴定

将上述实施例2中发现与肺癌发病有关的组合区域在2243例病理学明确诊断的无家族史散发型肺癌患者进行扩大样本检测验证，具体步骤为：

1-7、从血液样本中依次按照去除红细胞、抽提DNA、去除蛋白质、DNA沉淀、DNA洗涤、测量浓度的步骤完成合格DNA的获取(步骤同实施例2)。

8、对特定区域设计长扩增子引物(如下表1所示的引物对)进行三代文库构建，采用Pacbio平台进行测序。

9、使用Pbmm2软件将测序所得的序列比对到人类参考基因组(GRCh37)上，使用Lofreq软件进行目标区域的变异检测，检测并比较肺癌病例与健康对照中目标区域的罕见功能性变异分布差异。

在2243例散发性肺癌患者中，发现验证患者中在HR通路和FA通路基因的目标区域存在罕见功能性变异的富集，突变负荷评分S≥1的样本比例为190人/2243人＝8.47％。

表1

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实施例4利用突变负荷评分进一步分析特定区域与肺癌发病

我们对实施例2和实施例3中的目标区域内满足条件的变异进行基因型评分，进而计算上述5227例肺癌病例以及3020例健康对照中的每个研究对象的突变负荷评分S。联合分析发现肺癌病例中S≥1的样本比例显著高于健康对照。其中，病例携带率为467人/5227人＝8.93％，联合分析OR＝5.92。病例组与健康对照组的结果对比图参见图1。

因此，本发明人证明了采用HR通路和FA通路基因特定区域的组合能够较好地筛检肺癌患者。

实施例5用于肺癌筛查和辅助诊断罕见功能性突变试剂盒的制作

罕见功能性突变试剂盒的制作和操作流程是基于三代测序技术。试剂盒含有一批特异性引物(见表1)，还可以有相应长片段PCR技术所需的常用试剂，如：DNA聚合酶，dNTPs，双蒸水等，这些常用试剂都是本领域技术人员熟知的，另外还可以有标准品和对照(如确定基因型的标准品和空白对照等)。此试剂盒的价值在于只需要外周血而不需要其它组织样品，通过最精简和特异的引物对检测突变，再通过突变谱辅助判断肺癌，不仅稳定，检测方便，且精确。因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导诊断和更有效的个体化治疗。

具体而言，以上区域的组合有助于肺癌的筛查和辅助诊断，为临床医生快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度，及时采取更具个性化的防治方案提供支持。

对比例1

对比例1的方案与实施例2基本相同，不同之处仅在于突变区域。对比例1采用如下表2所示的569个突变区域。

表2

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分析发现肺癌病例中S≥1的样本比例略高于健康对照，其中，病例突变位点51个，病例携带率为88人/2984人＝2.94％，对照突变位点50个，对照携带率为78人/3020人＝2.58％，OR＝1.14，P＝0.4313。

其中，病例的51个突变位点分别为：chr2:62063210G>A、chr11:82938859T>TGG、chr11:82938894GATCA>G、chr17:25928965TTTAAAGGAAAACGCTTTCAGTAAGTCAA>T、chr9:140007935G>GCC、chr9:140007938T>TC、chr11:113853842CG>C、chr19:51301596T>TG、chr19:51301661GC>G、chr19:51301690CCTCCAGCA>C、chr9:123924475GTGTT>G、chr3:190930424G>A、chr1:6253042C>A、chr2:131116804A>G、chr2:131116817C>T、chr2:157352573TAAAGC>T、chr16:74750372G>GC、chr6:74446232G>A、chr12:108091242A>T、chr17:62518965C>CT、chr1:202287881C>CCCTG、chr1:202287899AC>A、chr10:27475329T>TC、chr16:67700304T>TG、chr1:151062948C>T、chr2:27529323G>GGC、chr2:39164702T>C、chr15:90631934C>T、chr22:37271875C>T、chr15:99670282C>T、chr15:99672146CT>C、chr15:99672590CTG>C、chr1:228493000C>T、chr15:102261328C>G、chr8:21768369C>G、chr17:42089430CAG>C、chr10:134010602G>GGAGGTGCCGTGGGGCA、chr9:132400505AG>A、chr11:126144890CAG>C、chr6:32065966CT>C、chr12:22646156C>G、chr12:122213698CCT>C、chr6:3137601C>T、chr6:35745264CTGAG>C、chr11:45949843C>T、chr6:8090378A>T、chr20:23064612C>T、chr18:39576695G>A、chr7:99817847T>TG、chr15:65495699C>T以及chr1:36056280CGGAG>C。

对照的50个突变位点分别为：chr11:113848504C>T、chr2:62063210G>A、chr17:37922121CAT>C、chr1:6445630G>A、chr5:13944502G>A、chr5:137622860G>A、chr19:11030357G>GTACTGGCACT、chr9:140007935G>GCC、chr13:32711020CT>C、chr3:42739122CG>C、chr18:43319186CA>C、chr16:698121CTT>C、chr19:51301596T>TG、chr21:47737952G>A、chr16:74750429G>C、chr18:28598177G>A、chr17:38449865C>CA、chr4:37841696G>A、chr6:74446135G>A、chr17:62518965C>CT、chr11:129745360T>C、chr1:202288325C>G、chr1:202287899AC>A、chr1:202287881C>CCCTG、chr7:7514291CT>C、chr7:99699577TC>T、chr22:37271725CCT>C、chr15:99672146CT>C、chr15:99672590CTG>C、chr15:99669977C>A、chr1:228493040CAT>C、chr17:18219842C>T、chr5:54948454C>T、chr17:66416371C>T、chr17:42089341ACT>A、chr14:53150516CTAAAG>C、chr11:59622252ATT>A、chr9:139686397A>C、chr22:39496302G>T、chr11:126144890CAG>C、chr6:32065606C>A、chr11:45949843C>T、chr6:8090378A>T、chr6:8090516T>C、chr6:46604220C>T、chr12:53646962TACTC>T、chr12:53647966G>GC、chr7:99817847T>TG、chr15:65495699C>T、以及chr1:36056318C>T。

可见，对比例1的罕见突变区域不能很好的筛检肺癌患者。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化。