不产毒黄曲霉菌APqn-3、其生物菌剂及其在抑制产毒黄曲霉、花生病害防控中的应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株不产毒黄曲霉菌APqn-3、其生物菌剂及其在抑制产毒黄曲霉、花生病害防控中的应用。

背景技术

黄曲霉毒素(Aflatoxin,AFT)主要是由黄曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(A.parasiticus)产生的次生代谢产物，是一种剧毒物质，其中，黄曲霉毒素B

目前国内外已有关于从土壤中分离不产毒黄曲霉菌用于产毒黄曲霉菌防控的报道。但是这些研究仅限于实验室内抑制产毒黄曲霉菌生长的报道，并无未开展相关田间试验研究和实际应用效果报道。自然环境相对于实验室环境更加复杂多变，对不产毒黄曲霉菌的生长繁殖影响较大，往往导致田间应用效果较实验室具有很大差距。此外，霉菌在复杂多变的自然环境中繁殖，往往会导致较高比例的突变，一些不产毒的黄曲霉菌可能发生回复突变，重新产毒。因而，提供一种原生不分泌黄曲霉毒素的黄曲霉菌，并将其制备成适应多种复杂土壤环境的生物菌剂，对产毒黄曲霉菌的生物防控及预防农产品被黄曲霉毒素污染十分重要。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一株不产毒黄曲霉菌APqn-3、其生物菌剂及其在抑制产毒黄曲霉、花生病害防控中的应用。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一株不产毒黄曲霉菌，所述黄曲霉菌为黄曲霉菌(Aspergillus flavus)APqn-3菌株，保藏编号为CGMCC NO.40537。

上述不产毒黄曲霉菌在黄曲霉生物防控、花生病害防治中的应用。

上述不产毒黄曲霉菌在制备黄曲霉生物防控、花生病害防治的制剂中的应用。

一种生物菌剂，有效成分为保藏编号为CGMCC NO.40537的APqn-3菌株。

在上述方案的基础上，所述生物菌剂中黄曲霉菌孢子数量≥10

在上述方案的基础上，所述的生物菌剂的制备方法如下：

(1)菌剂培养基的制备：采集花生田地土壤，去除石块枯草等杂质，土壤和蒸馏水的质量比2:1-1:1的比例混合，121℃灭菌20min。

(2)将活化后的不产毒的黄曲霉菌株APqn-3接种到灭菌后的土壤上，30℃培养5-8天，每天摇晃一次，使黄曲霉菌在培养基上生长均匀；培养结束后把土壤培养基于45℃烘干；

(3)按土壤和蒸馏水的质量比2:1-1:1的比例向步骤(2)烘干后的土壤培养基中再次添加灭菌的蒸馏水，再将活化后的不产毒的黄曲霉菌株APqn-3接种到烘干的培养基上，30℃再次培养8-10天，45℃烘干；

(4)按土壤和蒸馏水的质量比2:1-1:1的比例向步骤(3)烘干后的土壤培养基再次添加灭菌的蒸馏水，再将活化后的不产毒的黄曲霉菌株APqn-3接种到烘干的培养基上，30℃再次培养10-12天，45℃烘干，即得。

上述的生物菌剂在黄曲霉生物防控、花生病害防治中的应用。

在上述方案的基础上，所述的花生病害为果腐病、根腐病中的至少一种。

一种黄曲霉生物防控、花生病害防治的方法，在花生播种前，将上述的生物菌剂和有机肥一块均匀撒施于花生田中，进行犁地和旋地，使生物菌剂和有机肥均匀分散于花生土壤中。

在上述方案的基础上，生物菌剂的使用量为30kg/亩。

本发明技术方案的优点：

本发明分离获得一株不产毒黄曲霉菌APqn-3菌株，该菌株不仅能够抑制产毒黄曲霉菌的生长和产毒，还对花生果腐病、根腐病等病害具有防治作用。

本发明以花生种植土壤作为培养基将APqn-3菌株制备成生物菌剂，制备方法采用接种、培养、干燥；再接种、培养、干燥的方法，从而提高了生物菌剂的抗逆性；将本发明制备的生物菌剂在春天施用，与有机肥一块施撒，经过犁地和旋地，使生物菌剂和土壤充分混匀，借助有机肥的营养，有助于APqn-3菌株的生长。本发明方法制备的生物菌剂能在旱坡地、洼地、水稻田、沙壤地和盐碱地等不同类型的土壤中快速生长繁殖，抑制产毒黄曲霉的生长和产毒；因而，本发明的菌株APqn-3具有较好的应用前景。

附图说明

图1土壤菌悬液在改良的孟加拉红培养基上的生长图；

图2菌株APqn-3在改良的孟加拉红培养基上的形态图；

图3菌株APqn-3在麦芽浸膏琼脂培养基(MEA培养基)中形态图；

图4菌株APqn-3在氯硝胺18％甘油培养基(DG18培养基)上的形态图；

图5菌株APqn-3在曲霉素琼脂基础培养基(AFPA培养基)中形态图；

图6菌株APqn-3发酵液中黄曲霉毒素含量的测定。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例1菌株的分离纯化及鉴定

1、样品采集：于2018年05月采集广东湛江花生种植土壤中。每个样品(100g)，在10×10m的范围内按对角线法取5个子样品(2cm宽，5cm深的土壤)，混合作为一个样品。将采集的样品装进塑料袋中，扎些针孔以有利于气体交换，运至实验室，放于4℃保存，用于黄曲霉菌筛选。

2、菌株的分离纯化。

(1)土壤样品菌悬液的制备

取10g土样，加入90mL 0.1％蛋白胨无菌水(w/v)，在室温震荡30min，制成10

(2)菌株的分离与纯化

每个稀释度取0.1mL菌液，涂布在改良的孟加拉红培养基上，30℃黑暗培养5d，每个稀释度重复3次。挑取长有黄绿色孢子的黄曲霉菌在改良的孟加拉红培养基上进行二次划线分离，直至得到单个菌落。挑取单个菌落的黄曲霉菌于MEA斜面试管培养基上，于30℃培养3d后保存于4℃中。

土壤菌悬液在改良的孟加拉红培养基上的生长图如图1所示。

通过上述方法，分离获得菌株APqn-3

3、菌株APqn-3的鉴定

(1)形态鉴定

菌株APqn-3在改良的孟加拉红培养基上产生黄绿色的孢子和白色菌丝(图2)；菌株APqn-3在麦芽浸膏琼脂培养基(MEA培养基)中形态如图3所示；在氯硝胺18％甘油培养基(DG18培养基)上产生黄绿色孢子(图4)，菌落表面疏松，呈散射状分布；在AFPA培养基上产生亮橘色的颜色反应(图5)；

(2)生理生化反应

将该菌株APqn-3在黄曲霉产毒培养液中培养，结果显示，不产生黄曲霉毒素。

(3)分子生物学鉴定

通过克隆菌株APqn-3的ITS基因序列进行分子生物学鉴定。所采用的引物序列如下：

ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’(SEQ ID NO:1)；

ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’(SEQ ID NO:2)。

PCR扩增条件为：PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸90s，共30个循环；72℃最后延伸7min。扩增后，产物保存于4℃。产物送至上海生工生物工程有限公司测序，测序结果BLAST researches上比对(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。

经测序可知，所克隆的菌株APqn-3的ITS序列如下：

SEQ ID NO:3(5’→3’)

GATCATTACCGAGTGTAGGGTTCCTAGCGAGCCCAACCTCCCACCCGTGTTTACTG

TACCTTAGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCATTCATGGCCGCCGGGGGCTCTCAGCCCCGGG

CCCGCGCCCGCCGGAGACACCACGAACTCTGTCTGATCTAGTGAAGTCTGAGTTGATT

GTATCGCAATCAGTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGA

ACGCAGCGAAATGCGATAACTAGTGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAGTCTT

TGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCT

GCCCATCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGTCGTCGTCCCCTCTCCGGGGGGGACGGGCC

CCAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGATCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGC

TCTGTAGGCCCGGCCGGCGCTTGCCGAACGCAAATCAATCTTTTTCCAGGTTGACCTCG

GATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAG

经ITS序列比对可知，菌株APqn-3的ITS基因序列与黄曲霉菌株LUOHE小亚基核糖体RNA基因序列的相似性100％。

采用通用引物，检测菌株APqn-3产毒基因表达情况，结果发现，该菌株APqn-3产毒基因簇上的基因中的aflT、nor-1、hypD、aflR、aflJ、adhA、estA、hypB、ordB等9个产毒关键基因没有表达，因此该菌株不产毒。

形态学鉴定结合生理生化特点和分子生物学鉴定结果，将菌株APqn-3鉴定为不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌(Aspergillus flavus)；将其于2023年03月24日保藏于：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO:40537，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，请求保藏单位为青岛农业大学。

实施例2菌株APqn-3产毒情况鉴定

(1)产毒培养

将菌株APqn-3接种于MEA斜面试管培养基上，28℃培养3d对其进行活化；将4mL无菌水加入斜面试管培养基上，冲洗，制得菌株APqn-3悬液。在显微镜下用血球计数板记录孢子的数量。

将10mL的产毒培养液(产毒培养液的组成为150.0g蔗糖，20.0g酵母提取物，10.0g大豆蛋白胨，1000mL蒸馏水，pH 5.9)加入50mL离心管中，再加入一定量的菌株APqn-3菌悬液，使孢子终浓度为10

(2)产毒培养液中黄曲霉毒素的测定

采用免疫亲和层析净化、液相色谱分离、荧光检测器检测的方法检测上述发酵液中黄曲霉毒素。具体操作为：将2mL发酵液通过免疫亲和层析柱，流速每分钟3mL，用水20mL分2次洗脱，洗脱液弃去，使空气进入柱子，将水挤出柱子，再用1.5mL甲醇分次洗脱，收集洗脱液，浓缩至0.7mL，并用水稀释至1mL，摇匀，上样，高效液相色谱分离，荧光检测器检测。

色谱条件：色谱柱为Venusil MP C18(5μm，4.6mm×150mm)；柱温为40℃；流动相为甲醇:水(V:V＝45:55)；流速为1.3mL/min；采用柱后光化学衍生法：光化学衍生器254nm；以荧光检测器检测，激发波长360nm，发射波长450nm，进样量20μL。

结果如图6所示(从上往下依次为黄曲霉标准品和APqn-3检测结果)，菌株APqn-3产毒发酵液中未检出黄曲霉毒素，进一步证实菌株APqn-3为不产毒黄曲霉菌株。

实施例3含菌株APqn-3的生物菌剂

一种生物菌剂，有效成分包含菌株APqn-3。制备方法如下：

(1)菌种活化：将菌株APqn-3接种在MEA培养基上，30℃培养3-5天，直到产生黄绿色孢子为宜。

(2)菌剂培养基的制备：采集花生田地土壤，去除石块枯草等杂质，土壤和蒸馏水的质量比2:1-1:1的比例混合，121℃灭菌20min。

(3)将活化后的不产毒的黄曲霉菌株APqn-3接种到灭菌后的土壤上，接种量为每100g培养基接种10

(4)按土壤和蒸馏水的质量比2:1-1:1的比例向步骤(3)烘干后的土壤培养基中再次添加灭菌的蒸馏水，再将活化后的不产毒的黄曲霉菌株APqn-3接种到烘干的培养基上，接种量为每100g培养基接种10

(5)按土壤和蒸馏水的质量比2:1-1:1的比例向步骤(4)烘干后的土壤培养基再次添加灭菌的蒸馏水，再将活化后的不产毒的黄曲霉菌株APqn-3接种到烘干的培养基上，接种量为每100g培养基接种10

对比例1

一种生物菌剂，有效成分包含菌株APqn-3。制备方法如下：

(1)菌种活化：将菌株APqn-3接种在MEA培养基上，30℃培养3-5天，直到产生黄绿色孢子为宜。

(2)菌剂的制备：将上述长满孢子的MEA培养基上，在45℃烘箱烘干，粉碎，即得生物菌剂对照1。

对比例2

一种生物菌剂，有效成分包含菌株APqn-3。制备方法如下：

(1)菌种活化：将菌株APqn-3接种在MEA培养基上，30℃培养3-5天，直到产生黄绿色孢子为宜。

(2)菌剂培养基的制备：采集花生田地土壤，去除石块枯草等杂质，土壤和蒸馏水的质量比2:1-1:1的比例混合，121℃灭菌20min。

(3)将活化后的不产毒的黄曲霉菌株APqn-3接种到灭菌后的土壤上，接种量为每100g培养基接种10

对比例3

(1)菌种活化：将菌株APqn-3接种在MEA培养基上，30℃培养3-5天，直到产生黄绿色孢子为宜。

(2)菌剂培养基的制备：采集花生田地土壤，去除石块枯草等杂质，土壤和蒸馏水的质量比2:1-1:1的比例混合，121℃灭菌20min。

(3)将活化后的不产毒的黄曲霉菌株APqn-3接种到灭菌后的土壤上，接种量为每100g培养基接种10

(4)步骤(3)培养结束后，再将活化后的不产毒的黄曲霉菌株接种到步骤(3)培养后的培养基上，接种量为每100g培养基接种10

(5)步骤(4)培养结束后，再将活化后的不产毒的黄曲霉菌株接种到步骤(4)培养后的培养基上，接种量为每100g培养基接种10

实施例4含菌株APqn-3的生物菌剂在抑制黄曲霉菌产毒中的应用

(1)基质准备

挑选完整的没有破损的玉米和花生颗粒，然后分别称取10g大小均匀的花生和玉米，放入三角瓶中，121℃15分钟灭菌。

(2)菌悬液的制备

将产毒的黄曲霉菌NRRL3357接种于MEA斜面试管培养基上，20℃培养5天，然后用棉签蘸取培养基上的孢子于无菌水中，利用涡旋振荡器震荡均匀，然后用血球计数板将孢子浓度调整到2×10

称取0.1g实施例3制备的生物菌剂于无菌水中，利用涡旋振荡器震荡均匀，然后用血球计数板将孢子浓度调整到2×10

(3)抑制效果试验

向上述装有花生或玉米的三角瓶中分别加入上述稀释的1mL上述制备的生物菌剂菌悬液和产毒黄曲霉菌孢子菌悬液(10

(4)黄曲霉毒素含量测定

将培养好的玉米和花生样品放入高压灭菌锅里121℃，30min下进行灭菌(使黄曲霉失活)；将灭完菌的样品放入高速万能粉碎机中捣碎，然后并向三角瓶中加入50mlL 80％的甲醇，用振荡器高速震荡30min，然后用灭过菌的滤纸进行过滤，提取液用HPLC进行测定黄曲霉毒素B

表1生物菌剂抑制产毒菌的效果

从表1可以看出，生物菌剂在花生中对产毒菌的抑制产毒率为92.78±0.32％，在玉米中的对产毒菌的抑制产毒率为88.91±0.63％，该生物菌剂能够很好的抑制产毒菌的产毒。

实施例5含菌株APqn-3的生物菌剂在拮抗不同类型的土壤中产毒黄曲霉菌中的应用

将实施例3和对比例1-3制备的生物菌剂和有机肥一块均匀撒于春季未播种的花生田地中，生物菌剂使用量是30kg/亩，进行犁地和旋地，使生物菌剂和有机肥均匀分散于花生土壤中。花生田地分别选择旱坡地、洼地、水稻田、沙壤地和盐碱地等五种常见的不同类型的花生种植土壤类型；对照组为空白；其他日常管理试验组和对照组相同。

施用生物菌剂前及施菌后收获时各取一次土壤样品，检测土样中菌体数量并对黄曲霉菌进行分离鉴定，比较施用拮抗菌前后土样中的黄曲霉数量及产毒黄曲霉比例变化情况。结果如表2所示。

表2施用生物菌剂后土壤中黄曲霉数量及比例变化情况

从表2可以看出，实施例3制备的生物菌剂能在不同类型的土壤中，不仅能在沙壤平原土中快速繁殖，也能在条件较恶劣的旱坡地、水稻田和洼地等土壤类型中生长繁殖，更能在盐碱地土壤环境中生存，因而，实施例3制备的生物菌剂的适应力强。

同时比较实施例3制备的生物菌剂与对比例1-3不同方法制备的生物菌剂可以看出：以微生物常规琼脂培养基(MEA)为培养基制备的菌剂(对比例1)，在土壤中的繁殖能力很弱，施用后土壤中黄曲霉菌菌落数为325.6±4.3-634.6±5.2cfu/g土壤，对产毒菌的抑制作用也小，不同土壤类型产毒黄曲霉降低比例范围为6.5-19.01％，且在条件恶劣的水稻田、洼地和盐碱地，抑制作用更小，施用对比例1的生物菌剂后，洼地产毒菌比例减少8.1％，水稻田产毒菌比例减少9％、盐碱地产毒菌比例减少6.5％，而施用实施例3制备的生物菌剂后，产毒菌比例降至0.77±0.41％—3.89±0.45％，不仅对常见的沙壤地能很好的抑制产毒黄曲霉的生长，在条件恶劣的水稻田、洼地和盐碱地等土壤，也能很好的抑制产毒黄曲霉菌的生长。

由对比例1和对比例2可以看出，将培养基由MEA琼脂培养基变成土壤后，其制备的生物菌剂在田间的应用能力明显增加，施用对比例1土壤中的黄曲霉菌落数的325.6±4.3-634.6±5.2cfu/g土壤，施用对比例2土壤中的黄曲霉菌落数增加到547.5±6.2-1437.8±7.2cfu/g土壤，说明以土壤作为培养基制备拮抗菌剂更适宜田间应用，并提高菌剂在田间的存活能力，其原因是拮抗菌剂在田间应用主要是以土壤作为基质，因此在菌剂制备过程中，以土壤作为培养基，能够让拮抗菌很好的适应土壤环境，提高其繁殖能力。

由拮抗菌剂对照2和对照3可以看出，在制备菌剂的过程成，经过重复3次的接菌培养比只有1次接菌培养能更好的提高菌剂在田间应用对的存活能力，施用对照2土壤中的黄曲霉菌落数为547.5±6.2-1437.8±7.2cfu/g土壤，施用对比例3土壤中的黄曲霉菌落数增加到1347.4±7.5-2965±5.3cfu/g土壤，说明菌剂多次重复培养能提高菌剂的田间生存能力。

由拮抗菌剂对照3和拮抗菌剂可以看出，在制备菌剂的过程成，添加干燥步骤，能够显著提高菌剂在田间的适应能力，特别是在条件恶劣的土壤环境，如盐碱地、洼地以及水稻田等，施用对照3土壤中的黄曲霉菌落数为1347.4±7.5-2965±5.3cfu/g土壤，施用实施例3制备的生物菌剂土壤中的黄曲霉菌落数增加到6043.3±26.4-8793.3±20.1cfu/g土壤。分析其原因是菌剂制备过程中以低营养的土壤作为培养基，施撒后能更好的适应土壤的环境，同时菌剂在制备过程中经过培养、干燥再培养、再干燥、再培养再干燥的过程，抗逆性增强，使其能够适应不同的土壤环境。

从以上结果可以看出，施用实施例3制备的生物菌剂后，不产毒菌能在花生土壤中迅速生长、繁殖，并能竞争抑制产毒黄曲霉菌的生长繁殖，降低产毒菌的比例，从试验可以看出，施用不产毒菌后，产毒菌所占的比例从对照组的60.8±0.51％—71.3±0.47％降低到收获前的0.77±0.41％—3.89±0.45％，产毒菌所占的比例迅速降低，从而降低产毒菌侵染花生的比例，降低花生黄曲霉毒素污染风险。

实施例6含菌株APqn-3的生物菌剂在防治花生根腐病中的应用

将实施例3制备的生物菌剂和有机肥一块均匀撒于春季未播种的花生田地中，生物菌剂使用量是30kg/亩，进行犁地和旋地，使生物菌剂和有机肥均匀分散于花生土壤中。花生田地分别选择旱坡地、洼地、水稻田、沙壤地和盐碱地等五种常见的不同类型的花生种植土壤类型；对照组为空白；其他日常管理试验组和对照组相同。

采摘旱坡地、洼地、水稻田、沙壤地以及盐碱地种植的花生，随机选择100株花生，挑选根部腐烂的植株，按照以下公式计算花生根腐病发病率：

花生根腐病发病率％＝根部腐烂植株的数量/总花生植株的数量*100。

每个土壤类型做三次重复，结果如表3所示：

表3生物菌剂对花生根腐病的影响

表3可以看出，实施例3的生物菌剂的添加能显著减少花生根腐病的得病率，不同类型的土壤根腐病发病率都有显著下降，旱坡地下降8.41％，洼地下降5.69％，沙壤平原下降5.19％，水稻田下降8.62％，盐碱地下降6.42％。

实施例7含菌株APqn-3的生物菌剂在防治花生果腐病中的应用

将实施例3制备的生物菌剂和有机肥一块均匀撒于春季未播种的花生田地中，生物菌剂使用量是30kg/亩，进行犁地和旋地，使生物菌剂和有机肥均匀分散于花生土壤中。花生田地分别选择旱坡地、洼地、水稻田、沙壤地和盐碱地等五种常见的不同类型的花生种植土壤类型；对照组为空白；其他日常管理试验组和对照组相同。

采摘旱坡地、洼地、水稻田、沙壤地以及盐碱地种植的花生，随机选择100株花生，采摘100株花生的花生果，计算100株花生的荚果数，挑选烂果，统计烂果的数量，按照以下公式计算得到烂果率：

烂果率％＝烂果的数量/荚果数量*100。

每个土壤类型做三次重复，结果如表4所示：

表4生物菌剂对花生果腐病的影响

表4可以看出，实施例3制备的生物菌剂的添加能减少花生烂果，不同类型的土壤烂果率都有显著下降，旱坡地下降3.48％，洼地下降3.91％，沙壤平原下降4.59％，水稻田下降4.78％，盐碱地下降2.05％

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。