青霉ZJUT23及其在制备吡喃酮类化合物中的应用

(一)技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株青霉菌及其在制备γ-吡喃酮类化合物中的应用，有助于解决高纯度γ-吡喃酮类化合物的规模化制备这一难题。

(二)背景技术

Streptopyrone是由链霉菌产生的一种γ-吡喃酮类次级代谢产物，分子式为C

Streptopyrone是一种强效的微管蛋白聚集抑制剂和有丝分裂抑制剂，可作为探针分子用于研究微管蛋白的聚合过程及其详细机制，在生命科学领域有着重要的应用前景。然而，截至目前，仅有文献报道少数链霉菌可产生streptopyrone，尚无该化合物的规模化制备方法报道。从真菌中筛选Streptopyrone高产菌株，并开发经济、便捷的微生物发酵工艺，对于高纯度streptopyrone的规模化制备具有重要意义。

(三)发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的缺陷，另辟蹊径，提供一株新菌株——青霉ZJUT23及其在制备γ-吡喃酮类化合物中的应用，本发明以特殊生境真菌——青霉菌为筛选对象，经过大量的创造性实验，筛选得到青霉ZJUT23，通过菌株的发酵培养和发酵产物的提取分离，以高产率获得高纯度γ-吡喃酮类化合物(Ⅰ)，解决了现有的技术缺陷。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案是：

本发明提供一株高产高纯度γ-吡喃酮类化合物(Ⅰ)的新菌株--青霉(Penicillium sp.)ZJUT23，分离于玛索海沟来源的海泥样品，该菌株已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2023年4月6日，保藏编号为CCTCC NO:M2023475，地址为中国，武汉，武汉大学。

本发明还提供了一种所述青霉ZJUT23在制γ-吡喃酮类化合物(Ⅰ)中的应用，所述应用的方法为：(1)将青霉ZJUT23接种至发酵培养基，28℃,180rpm在震荡培养箱中培养7天，再静置培养7天，获得发酵液；所述发酵培养基组成：酵母提取物2g/L、MgSO

优选的，步骤(1)所述青霉ZJUT23接种至发酵培养基前，先进行活化培养，再将活化后的菌悬液以体积分数0.1～1％的接种量接种号液体培养基，所述活化是指将青霉ZJUT23接种至马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基，28℃培养，使菌株活化，将活化后的菌株用含体积浓度2％吐温80的无菌水重悬，得到菌悬液；所述菌悬液中菌体浓度为1×10

优选的，步骤(2)所述有机溶剂为乙酸乙酯，每次萃取所用有机溶剂与发酵液的体积比为0.05-0.5:1，优选0.07:1；萃取3～5次。

优选的，步骤(3)方法为：萃取物浸膏以甲醇溶解后进行MCI CHP20P柱层析，依次以体积比为20:80、30:70、40:60、50:50、60:40、70:30、80:20、90:10和100:0的甲醇/水混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱，每一梯度洗脱2～5个(优选2个)柱体积，流速均为10～20mL/min(优选15mL/min)；收集体积比20:80的甲醇-水洗脱部位，减压浓缩至干，得浓缩物。

优选的，将步骤(4)所得浓缩物进行硅胶柱层析，以体积比为5:1～1:1的石油醚/丙酮混合溶剂为洗脱液进行梯度洗脱，每一梯度洗脱2～5个(优选2个)柱体积，流速均为10～20mL/min(优选15mL/min)，收集体积比5:1的石油醚/丙酮洗脱部位，减压浓缩至干，得到式(Ⅰ)所示γ-吡喃酮类化合物。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

本发明提供一种经多年实验筛选获得的保藏编号为CCTCC NO：M 2023475的青霉ZJUT23，并首次报道了利用该菌株发酵培养，高产率(40mg/L)制备高纯度streptopyrone的方法，纯度达到99％；该制备方法具有发酵条件简单、菌种易培养、工艺步骤少、生产周期短等优势，具有工业化、规模化生产的潜力。本方法对于解决高纯度Streptopyrone标准品或对照品的规模化制备这一问题具有重要意义。

(四)附图说明

图1是青霉ZJUT 23的菌落照片。

图2是streptopyrone的

图3是streptopyrone的

图4是streptopyrone的高效液相色谱图。

(五)具体实施方式

本发明结合附图和实施例，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

本发明所述室温是指25～30℃。所述PDA培养基组成为：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂18g/L，溶剂为蒸馏水，pH自然。

发酵培养基组成：酵母提取物2g/L、MgSO

实施例1、菌株ZJUT23的筛选

(1)海泥样品的采集

用于分离菌株的海泥样品于2019年12月采集自玛索海沟。

(2)菌株的分离

取采集到的海泥样品2g，加入20mL无菌水，混匀，获得处理液，作为10

培养4天后，待菌落出现后，根据菌落的形态、颜色的差异及菌落长出时间的不同，分别挑取培养基边缘的菌丝接种于新的PDA培养基上进行分离培养，直至筛选出单一的菌落，记为菌株ZJUT 23。

实施例2、菌株ZJUT 23的鉴定

1、菌落形态

将实施例1筛选的菌株ZJUT 23接入PDA培养基斜面，28℃暗培养7天后(图1)，转至4℃冰箱内保存备用。如图1所示，培养起初，菌丝呈白色絮状；培养7天，菌落即铺满整皿，菌落呈绿色、干燥、不透明、边缘不平整菌株。

2、分子生物学鉴定

(1)基因组DNA的提取

使用TSINGKE植物DNA提取试剂盒(通用型，北京擎科生物科技有限公司)提取菌株ZJUT 23基因组DNA，具体步骤如下：

1)将Spin Column置于Collection Tube中，加入250μL Buffer BL，12000rpm离心1min活化硅胶膜；

2)挑取实施例1平板上菌株ZJUT 23单克隆菌于1.5mL离心管内，加入400μLBuffer gP1，涡旋振荡1min，65℃水浴20min，期间可取出颠倒混匀以充分裂解；

3)加入150μL Buffer gP2，涡旋振荡1min，冰浴5min；

4)12000rpm离心5min，将上清转移至新的离心管中；

5)加入上清等体积的无水乙醇，立即充分振荡混匀，液体全部转入Spin Column中，12000rpm离心30s，弃废液；

6)向Spin Column中加入500μL Buffer Pw(使用前已加入无水乙醇)，12000rpm离心30s，弃废液；

7)向Spin Column中加入500μL Wash Buffer(使用前已加入无水乙醇)，12000rpm离心30s，弃废液；

8)重复操作步骤7；

9)将Spin Column放回Collection Tube中，12000rpm离心2min，开盖晾干1min；

10)取出Spin Column，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中央处加75μL TEBuffer(65℃预热TE Buffer)，20℃放置2min，12,000rpm离心2min，获得基因组DNA。

(2)ITS区序列的PCR扩增

1)引物序列如下：

ITS1:5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3’

ITS4:5’TCCTCCGCTTATTGATATGC 3’

2)PCR反应体系

PCR体系(50μL)构成为：基因组DNA模板(10P)1μL，Primer 1(10P)2μL，Primer 2(10P)2μL，1×TSE 101金牌mix 45μL。

3)PCR程序设定为：98℃预变性2min，98℃变性10s，55℃复性10s，72℃延伸15s，35个循环，最后72℃延伸5min。

4)PCR扩增产物电泳纯化与测序

将扩增好的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳(2μL样品+6μL溴酚蓝)，300V电压下12分钟。由PCR产物电泳结果切割所需DNA目的条带，经DNA凝胶回收试剂盒(厂家：生工生物工程(上海)有限公司)纯化。纯化产物由北京擎科生物科技有限公司采用Sanger法测序，测得ITS碱基序列(SEQ ID NO.1)为：TTCCTTCCCGGCTTTAGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTATCCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTGAAAAAATAGATTGAGGGGGGTCGGCTGGCGCCGGCCGGGCCTACAAGAGCGGGTGACGAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGCCCCCCCAGCGCGGGGGGGGCGGGGGCCCAACACACAAGCCGTGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCTCCGGAATACCAGAGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTAGTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAACTAATTTAGCTAGTTTCTCAGACTGCAACTTCAGACAGCGTTCACAGGTGTCTTCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGGCGGAAGCCCCCCGGCGGCCGTGAGGCGGGCCCGCCGAAGCAACAGGGTTCGGAAAACACGGGTGGGAGGTTGGACCCAGAGGGCCCTCACTCGGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTACATTTTTTTTCTTCCAAACGATCC。

(3)数据处理

序列数据在美国国立生物信息中心(National Center for BiotechnologyInformation USA，NCBI)的Genbank中进行同源序列搜索比对，分析其同源性。将上述序列与GenBank中的序列比较，鉴定该菌株为青霉属真菌,命名为青霉(Penicillium sp.)ZJUT23，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2023年4月6日，保藏编号为CCTCC NO:M2023475，保藏单位地址为中国，武汉，武汉大学。

实施例3、青霉ZJUT 23发酵制备streptopyrone

1、菌株活化

取出保存于-80℃冰箱的青霉ZJUT 23菌株冻存管，于4℃解冻后，在超净台内用无菌棉棒从冻存管蘸取适量孢子悬液，接种至PDA培养基，于28℃恒温培养箱中静置培养7天，进行菌种活化。

2、菌株发酵

活化7天后，用10mL含有体积浓度2％吐温80的无菌水将菌株孢子洗下，置于装有100mL含体积浓度2％吐温80的无菌水中，得到孢子悬液(孢子浓度为1×10

3、Streptopyrone的提取分离

1)将步骤2制备的50升发酵液用乙酸乙酯萃取，每次3.5L，萃取4次，合并乙酸乙酯相，并减压浓缩至干，得到乙酸乙酯萃取物浸膏90.4g。

2)将步骤1)乙酸乙酯萃取物浸膏90.4g溶解于100mL甲醇后进行MCI CHP20P柱层析(直径d＝5.5cm，高h＝30cm)，依次以体积比为20:80、30:70、40:60、50:50、60:40、70:30、80:20、90:10和100:0的甲醇/水混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱，每一梯度洗脱1.5L(2个柱体积)，流速均为15mL/min；收集甲醇/水＝20:80(v/v)的洗脱部位，合并，减压浓缩至干，得浓缩物3.9g。

3)将步骤2)中的浓缩物3.9g用甲醇溶解后进行硅胶柱层析分离(硅胶200-300目，高37.5cm，直径5cm)，分别以体积比5:1、4:1、3:1、2:1、1:1的石油醚/丙酮混合溶剂为洗脱液进行梯度洗脱，每一梯度洗脱速度均为15mL/min，洗脱量均为2个柱体积，收集体积比为5:1的石油醚/丙酮混合溶剂洗脱部位，减压浓缩至干，得浓缩物2g(产率为40mg/L)，即得式(I)所示γ-吡喃酮类化合物，即为Streptopyrone，化学名称为(3S)-2,3-Dihydro-3-hydroxy-5-methoxy-6-methyl-4H-pyran-4-one。

4、Streptopyrone的结构鉴定

Streptopyrone：无色透明油状物。其

5、Streptopyrone的纯度检测

1)将上述步骤3制备所得的streptopyrone用甲醇溶解，定量稀释配制成浓度为100μg/mL的样品溶液。

2)取样品溶液进行高效液相色谱分析，色谱条件如下。仪器：Agilent1260series；色谱柱：Cosmosil 5C18-PAQ(4.6mm I.D.×250mm)；流动相：0min(甲醇:水＝10:90),50min(甲醇:水＝100:0)；流速：1mL/min；检测波长：254nm；进样量：50μL；柱温：室温。检测记录色谱图。

3)待测样品的高效液相色谱检测结果如图4所示。Streptopyrone的保留时间为8.360min，峰面积分析其纯度达99％。

以上所述的实施例只是本发明的较佳方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。