一种棘孢木霉HG1与枯草芽孢杆菌Tpb55的固态发酵方法及其应用

技术领域

本发明涉及菌种共培养技术领域，特别是涉及一种棘孢木霉HG1与枯草芽孢杆菌Tpb55的固态发酵方法及其应用。

背景技术

烟草疫霉(Phytophthora nicotianae)是引起烟草黑胫病主要的病原菌，对烟草种植造成巨大的危害。目前，烟草黑胫病的防治依然是以农药为主的化学防治。但是，化学防治也导致了抗药性、农药残留和环境污染等问题，因此，开发对环境更加友好的生物防治方法和产品具有重要意义。生防微生物通过产生抑菌物质、与病原菌竞争营养和空间、寄生在病原菌内或使植物产生诱抗作用来发挥防病和抗病作用，具有无毒害、无残留、安全环保等优点，成为烟草病害生物防治的重要方法和手段。

木霉和芽孢杆菌作为应用最为广泛、效果最为显著的生防菌，对多种植物病原菌具有明显的抑制作用。然而，单一菌种的生防效果不稳定，采用不同生防菌株进行共培养发酵，可以提高优势菌株生存及生防效果的潜力。

目前的共培养菌剂的发酵主要为液态发酵，但液体发酵共培养过程中两株菌的菌量和代谢产物产量未达到预期效果。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种棘孢木霉HG1与枯草芽孢杆菌Tpb55的固态发酵方法及其应用。本发明提供的固态发酵方法有效的提高了共培养后两株生防菌的菌量；并进行了盆栽实验，获得了显著的防治效果。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种棘孢木霉(Trichoderma asperellum)HG1与枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)Tpb55的固态发酵方法，包括：

将枯草芽孢杆菌Tpb55种子液接种到大米培养基中，静置培养12～14h后，接种棘孢木霉HG1种子液，继续静置培养，得到共培养混合物；所述棘孢木霉HG1种子液与枯草芽孢杆菌Tpb55种子液的接种体积比为2：1；所述棘孢木霉HG1种子液的孢子浓度为≥1×10

优选的，所述静置培养的温度为25～28℃。

优选的，所述枯草芽孢杆菌Tpb55种子液和大米培养基的体积质量比为3mL：100g。

优选的，继续静置培养的时间为14～30d。

优选的，所述大米培养基包括大米和水。

优选的，所述大米培养基中大米和水的质量体积比为8～9g：11mL。

优选的，所述大米培养基的制备方法包括：将大米和水混合后，高温灭菌，得到所述大米培养基。

优选的，所述高温灭菌包括：121℃灭菌20min或115℃或30min。

本发明还提供了一种生防制剂，所述生防制剂的制备方法包括：利用上述技术方案所述固态发酵方法制备得到共培养混合物；利用乙酸乙酯将所述共培养混合物洗脱，得到洗脱液为所述生防菌剂。

本发明还提供了利用上述技术方案所述固态发酵方法制备得到共培养混合物或上述技术方案所述的生防制剂在防治烟草疫霉和/或促进植物生长中的应用。

有益效果：

本发明提供了一种棘孢木霉(Trichoderma asperellum)HG1与枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)Tpb55的固态发酵方法，包括：将枯草芽孢杆菌Tpb55种子液接种到大米培养基中，静置培养12～14h后，接种棘孢木霉HG1种子液，继续静置培养，得到共培养混合物；所述棘孢木霉HG1种子液与枯草芽孢杆菌Tpb55种子液的接种体积比为2：1；所述棘孢木霉HG1种子液的孢子浓度为≥1×10

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为不同接种时间的提取物组分的减压组分对烟草疫霉的抑菌效果；

图2为盆栽试验7d时各处理发病情况。

具体实施方式

本发明提供了一种棘孢木霉HG1与枯草芽孢杆菌Tpb55的固态发酵方法，其特征在于，包括：

将枯草芽孢杆菌Tpb55种子液接种到大米培养基中，静置培养12～14h后，接种棘孢木霉HG1种子液，继续静置培养，得到共培养混合物；所述棘孢木霉HG1种子液与枯草芽孢杆菌Tpb55种子液的接种体积比为2：1；所述棘孢木霉HG1种子液的孢子浓度为≥1×10

在本发明中，所述静置培养的时间优选为12h。

本发明所述棘孢木霉HG1与枯草芽孢杆菌Tpb55公开于文献【Xi-FenZhang,Qing-Yu Li,Mei Wang,Si-Qi Ma,Yan-Fen Zheng,Yi-Qiang Li,Dong-Lin Zhao,Cheng-ShengZhang.2E,4E-Decadienoic Acid,a Novel Anti-Oomycete Agent from CocultureofBacillus subtilis and Trichoderma asperellum.Microbiology Spectrum,10.4】。

在本发明中，所述所述棘孢木霉HG1种子液的孢子浓度优选为1×10

在本发明中，所述棘孢木霉HG1种子液的制备方法优选包括：将棘孢木霉HG1在PDA平板上28℃培养10d后，无菌水稀释，得到所述棘孢木霉HG1种子液。

在本发明中，所述枯草芽孢杆菌Tpb55种子液的制备方法优选包括：将活化的枯草芽孢杆菌Tpb55接种到NA液体培养基中，扩繁培养，得到所述枯草芽孢杆菌Tpb55种子液；所述活化的培养基优选包括NA培养基，活化的温度优选为28℃，活化的时间优选为12h；所述扩繁培养的温度优选为28℃。

在本发明中，所述静置培养的温度优选为25～28℃，更优选为25℃；所述枯草芽孢杆菌Tpb55种子液和大米培养基的体积质量比优选为3mL：100g。本发明所述继续静置培养的时间优选为14～30d，更优选为30d。

在本发明中，所述大米培养基优选包括大米和水；所述水优选包括蒸馏水；所述大米培养基中大米和水的质量体积比优选为8～9g：11mL，更优选为9g：11mL；所述大米培养基的制备方法优选包括：将大米和水混合后，高温灭菌，得到所述大米培养基；所述高温灭菌优选包括：121℃灭菌20min或115℃或30min。

本发明将棘孢木霉HG1与枯草芽孢杆菌Tpb55在大米培养基中进行固态共培养，可以有效的提高共培养后两株生防菌的菌量；本发明提供的共培养方法具有产量高、产物稳定性好、生产成本低、后期处理简单、污染少等优点。与液体发酵相比，本发明提供的大米培养基含水量较少，养分和代谢产物呈现明显的分层现象，从而能够更好刺激微生物持续发酵。另外，本发明提供的共培养方法代谢产物对菌株的抑制效果较小，发酵产物的终浓度高，能够产生更多的次级代谢产物，得到的共培养混合物对烟草疫霉具有更好的防治效果。

本发明提供了一种生防制剂，所述生防制剂的制备方法包括：利用上述技术方案所述固态发酵方法制备得到共培养混合物；利用乙酸乙酯将所述共培养混合物洗脱，得到洗脱液为所述生防菌剂。本发明利用乙酸乙酯将所述共培养混合物洗脱，可以将主要抑菌活性成分进行富集。

本发明提供了利用上述技术方案所述固态发酵方法制备得到共培养混合物或上述技术方案所述的生防制剂在防治烟草疫霉和/或促进植物生长中的应用。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种棘孢木霉HG1与枯草芽孢杆菌Tpb55的固态发酵方法及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

共培养接种比例的优化

(1)固态培养基制备

1000mL锥形瓶中加入90g大米(艳河牌香米，长粒香梗米)和110mL蒸馏水，121℃高温灭菌20min。

(2)种子液制备

棘孢木霉HG1种子液制备：棘孢木霉在PDA平板上28℃培养10d。无菌水冲洗，使用纱布过滤菌丝，吸取上清，用血细胞计数板在显微镜下确定棘孢木霉孢子液浓度。无菌水稀释成1×10

枯草芽孢杆菌tpb55种子液制备：在NA平板上划线上28℃培养12h，挑取单菌落于NB液体培养基里，28℃，180rpm培养12h。测菌液OD

(3)棘孢木霉HG1和枯草芽孢杆菌tpb55共培养接种比例的确定

设置枯草芽孢杆菌tpb55单培养(t)，棘孢木霉HG1单培养(h)，枯草芽孢杆菌tpb55种子液：棘孢木霉HG1种子液按1：1，1：2，2：1，1：10，10：1的体积比共培养接种，分别加入到步骤(1)制备得到的大米培养基中后搅拌使其混合；单培养时，不同组种子液的接种量均为1.5mL；共培养时，不同组的枯草芽孢杆菌tpb55种子液和棘孢木霉HG1种子液的总体积为3mL。

接种完成后，于25℃静置培养30d。取1g培养基，用1mL无菌水稀释成10

静置培养30d后，大米培养基先使用乙酸乙酯超声浸取两遍，浸取的乙酸乙酯旋蒸浓缩至干。再使用甲醇和二氯甲烷(体积比为1：1)超声浸取两遍，浸取液先旋蒸浓缩后用水转出，在水相中加入等体积的乙酸乙酯萃取三次，旋蒸至干。两次蒸干的乙酸乙酯相，合并后得到提取物。

(4)共培养提取物对烟草疫霉的抑制率分析

采用菌丝生长速率法测定提取物对烟草疫霉的抑菌率：取30mg提取物加入150μL二甲亚砜(DMSO)溶解，配置成200mg/mL的溶液，取50μL溶液加入到10mL的燕麦培养基中，配成终浓度1mg/mL的含药培养基，倒入6cm的培养皿中制成平板培养基。用打孔器从活化7d的烟草疫霉(烟草疫霉JM01，分离自烟草黑胫病株，公开于文献【ZHANG C S,GAO J M,HAN Tet al.Integrated control of tobacco black shank by combined use of riboflavinand Bacillus subtilis strain Tpb55[J].Bio Control,2017,62(6):835-845.】)平板上取5mm的菌碟，倒置在平板中央，28℃培养36h。采用十字交叉法测量菌丝生长的直径，以只加入DMSO的燕麦培养基作空白对照。每个处理重复3次。

菌落直径(cm)＝测量菌落直径-0.5；

抑菌率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100。

(5)实验结果

棘孢木霉HG1和枯草芽孢杆菌tpb55不同的接种比例在发酵30d菌量如表1所示，当枯草芽孢杆菌tpb55和棘孢木霉HG1接种比例为2：1时，枯草芽孢杆菌tpb55(5.5×10

表1 HG1和tpb55不同的接种比例在发酵30d菌量

不同接种比例下的提取物对烟草疫霉抑菌率，如表2所示，当枯草芽孢杆菌tpb55和棘孢木霉HG1接种比例为2：1时，提取物的抑菌率(46.17％)显著高于其它处理。

表2 HG1和tpb55不同接种比例提取物对烟草疫霉的抑菌率

实施例2

棘孢木霉HG1和枯草芽孢杆菌tpb55共培养接种的顺序和时间优化

(1)共培养后棘孢木霉HG1和枯草芽孢杆菌tpb55菌量

按照优化后的接种比例，设置枯草芽孢杆菌tpb55和棘孢木霉HG1不同接种顺序和时间：枯草芽孢杆菌tpb55单培养(t)；棘孢木霉HG1单培养(h)；枯草芽孢杆菌tpb55和棘孢木霉HG1同时接种(th)；其它共培养分别在先接种枯草芽孢杆菌tpb55，12h(th12)、24h(th24)、36h(th36)后再接棘孢木霉HG1；先接棘孢木霉HG1，24h(ht24)、36h(ht36)、48h(ht48)后再接枯草芽孢杆菌tpb55。在发酵14d(以接种第一种种子液时计时)时涂板，统计菌量。其他试验操作与实施例1中的步骤(3)相同。

(2)共培养后提取物对烟草疫霉的抑菌率

在发酵14d时提取代谢产物。将提取物经过减压硅胶柱色谱，乙酸乙酯/石油醚(10％)，乙酸乙酯(100％)，甲醇/水(10％)三个梯度进行洗脱，采用菌丝生长速率法测定各个组分在1mg/mL的浓度下对烟草疫霉的抑制率。

(3)实验结果

棘孢木霉HG1和枯草芽孢杆菌tpb55不同的接种时间在发酵14d的菌量如表3所示，在枯草芽孢杆菌tpb55先接种12h后再接种棘孢木霉HG1，枯草芽孢杆菌tpb55(9.72×10

表3 HG1和tpb55不同的接种时间在发酵14d的菌量

不同接种时间的提取物组分的减压组分对烟草疫霉的抑制率如表4所示，100％乙酸乙酯提取的组分抑菌活性最高，而10％乙酸乙酯组分(乙酸乙酯与石油醚的体积比为10：90)和10％甲醇组分(甲醇和乙酸乙酯的体积比为10：90)活性较低，说明抑菌活性成分主要集中在100％乙酸乙酯组分中。枯草芽孢杆菌tpb55先接种12h后再接种棘孢木霉HG1时，提取物的抑菌率(73.25％)显著高于其他的处理。

表4不同接种时间的提取物的减压组分对烟草疫霉的抑制率

注：h1、h2、h3分别为棘孢木霉HG1单培养的提取物的10％乙酸乙酯，100％乙酸乙酯和10％甲醇三个梯度洗脱后的组分，其它代号后的1、2、3也是代表各个处理的提取物三个梯度洗脱后的组分。

综上所述，固态共培养发酵条件：在枯草芽孢杆菌tpb55接种12h后接种棘孢木霉HG1，枯草芽孢杆菌tpb55(10

实施例3

盆栽防病实验

(1)试验材料

制备烟草疫霉菌谷：将谷子置于蒸馏水中煮20min，待2/3谷子开花后，用纱布滤干水分置于锥形瓶中，用封口膜封口后高压灭菌(121℃，20min)。将烟草疫霉接种于OA培养基平板活化4天后，用5mm打孔器取菌饼置于灭菌的谷子培养基中(每瓶3～5个菌饼)，28℃下培养14天，即为烟草疫霉菌谷。

供试土壤来自中国农业科学院烟草研究所即墨试验基地(田间自然土：灭菌基质土的体积比＝7：3)。将180g土壤与1.2g疫霉菌谷混匀作为防病盆栽试验的病土，将不同发酵的大米固体培养基3g与病土180g混匀作为处理。

(2)试验设计

盆栽实验总共设置3个处理：枯草芽孢杆菌tpb55单培养(t)、棘孢木霉HG1单培养(h)、枯草芽孢杆菌tpb55和棘孢木霉HG1共培养(ht)，以只加入疫霉菌谷的病土作对照。取长势一致的烟苗移入土中，设置3个重复，每个处理30株烟苗。移栽7d后统计发病率和病情指数，计算防病效果。烟草黑胫病的病情分级参照中华人民共和国烟草行业标准(GB/T23222—2008)进行统计。

(3)盆栽土壤理化性质测定

盆栽试验第14d，取盆栽土。自然风干后，通过20mm筛，测定土壤理化性质。包括pH值、电导率、有机质含量(重铬酸钾容量法)、速效钾含量(NH

(4)实验结果

盆栽试验证实了棘孢木霉HG1与枯草芽孢杆菌tpb55的固态发酵培养基对烟草黑胫病有明显的防治效果。如表5所示，在处理后第7d，棘孢木霉HG1与枯草芽孢杆菌tpb55共培养的防治效果显著好于棘孢木霉HG1、枯草芽孢杆菌tpb55单培养，其病情指数为27.78，防治效果为61.94％。

表5盆栽试验7d时的病情指数和防治效果

土壤理化试验表明，施加固态共培养棘孢木霉HG1与枯草芽孢杆菌tpb55后，对土壤理化性质有所改善。如表6所示，处理14d后，处理组的盆栽土壤pH值相比较对照组显著提升，而电导率则比对照组土样有所下降，与对照组相比，处理组的土壤中硝态氮和有效磷含量得到提升。

表6土壤理化性质

综上所述，本发明改善了棘孢木霉HG1与枯草芽孢杆菌tpb55液体共培养发酵后菌量较小的问题，有效的提高了共培养后棘孢木霉HG1的菌量，在盆栽防病试验中也取得显著的效果。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。