检测HTLV-1前病毒DNA的多酶恒温扩增试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于分子检测技术领域的一种检测HTLV-1前病毒DNA的试剂盒，具体涉及一种检测HTLV-1前病毒DNA的多酶恒温扩增试剂盒及检测方法。

背景技术

人类T细胞白血病病毒(Human T-lymphotropic virus，HTLV)是最早发现的一种人类逆转录病毒，其中以HTLV-1型最为常见。人类感染HTLV-1型后多表现为无症状感染，潜伏期长达20多年，后期可能引起成人T细胞白血病、HTLV相关的脊髓病/热带痉挛性截瘫以及各种神经系统疾病，严重者可致死亡。HTLV主要通过母乳喂养、性接触和血液途径传播。

目前国内采供血机构主要采用酶联免疫吸附实验(ELISA)的方法进行HTLV抗体检测。但是抗体筛查存在一些缺点，比如检测窗口期较长，容易发生漏检；ELISA方法易出现更多的假阳性结果。HTLV前病毒DNA检测是HTLV抗体筛查阳性标本的确认方法，与ELISA法相比，前病毒DNA检测具备更高的特异性，因此很有必要开发检测HTLV前病毒DNA的试剂。

以实时荧光定量PCR为代表的分子诊断技术因其灵敏度高、特异性强被认为是强有力的病原体诊断工具，但对实验仪器、环境和操作人员的技术水平有严格的要求，而且操作繁琐费时，不适宜在基层医疗机构推广应用。多酶恒温快速扩增(multienzymeisothermal rapid amplification，MIRA)技术是一种新型的核酸快速恒温扩增技术。该技术使用4种核心蛋白(重组酶、DNA解旋酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶)在25-42℃恒温条件下对靶基因进行扩增。该方法5-20min内即可完成，操作简单快速，对操作人员要求不高，且不需要大型的精密仪器设备，仅一台水浴锅或恒温仪便可进行。此外，将MIRA技术与胶体金侧流层析技术相结合，可通过肉眼观察条带对检测结果实现可视化。与PCR方法相比，MIRA技术具有灵敏度高、特异性强、快速便携、操作简单、结果可视化、适合现场快速检测等优点。

发明内容

针对背景技术中的问题，本发明提供一种检测HTLV-1前病毒DNA的多酶恒温扩增试剂盒及检测方法。本发明基于MIRA技术建立快速检测HTLV-1前病毒DNA的侧向流层析试纸条检测方法，在保证高灵敏度与特异性的同时，极大地降低对环境、设备与操作人员的要求，并且操作简单快速，在实验室资源匮乏的基层医疗机构或血液中心(血站)具有很高的应用价值。

本发明的技术方案如下：

一、一种检测HTLV-1前病毒DNA的多酶恒温扩增试剂盒

所述多酶恒温扩增试剂盒包括引物探针混合液、A buffer、冻干酶粉、B buffer、侧向流层析试纸条、阳性对照物和阴性对照物。

所述引物探针混合液包括检测HTLV-1前病毒DNA的特异性引物对和探针；所述检测HTLV-1前病毒DNA的特异性引物对由检测HTLV-1前病毒DNA的上游引物和下游引物组成，其中检测HTLV-1前病毒DNA的上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物序列如SEQ IDNO.2所示，探针序列如SEQ ID NO.3所示。

所述SEQ ID NO.2所示引物的5’端标记生物素基团；所述SEQ ID NO.3所示探针的5’端标记FAM荧光基团，在距5’端30nt序列位置上标记一个dSpacer(四氢呋喃，THF)，3’端标记修饰基团C3-spacer。

所述阳性对照物为含有HTLV-1特异性扩增基因片段的质粒，其中HTLV-1特异性扩增片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

所述阴性对照物为DEPC(焦碳酸二乙酯)处理水、去离子水和无菌水中的任意一种。

所述冻干酶粉包括重组酶、DNA解旋酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶。

所述A buffer包括恒温扩增缓冲液、dNTP；所述B buffer包括醋酸镁溶液。

二、一种基于MIRA的HTLV-1前病毒DNA检测方法

HTLV-1前病毒DNA检测方法采用所述的一种检测HTLV-1前病毒DNA的多酶恒温扩增试剂盒，方法包括以下步骤：

1)利用基因组DNA提取试剂盒提取待测血液样本的基因组DNA后，获得样本基因组DNA提取物；

2)利用多酶恒温扩增试剂盒中的引物探针混合液、A buffer、冻干酶粉、B buffer配制MIRA反应液，将样本基因组DNA提取物、阳性对照物和阴性对照物分别放入对应的MIRA反应液中后，获得样本检测液、阳性检测液和阴性检测液，然后将以上三种检测液放置于水浴锅或者恒温仪中进行反应；

3)采用侧向流层析试纸条分别对反应后的样本检测液、阳性检测液和阴性检测液进行检测，通过肉眼观察侧向流层析试纸条质控线和检测线显色情况后获得三类侧向流层析试纸条的显色结果，进而获得HTLV-1前病毒DNA检测结果。

所述2)中，样本检测液、阳性检测液和阴性检测液在水浴锅或者恒温仪中进行MIRA反应时，其反应温度为37-38℃，反应时间为15-20min。

所述2)中，样本基因组DNA提取物至少为一份，阳性对照物和阴性对照物均为一份。

所述3)中，当阴性检测液对应的显色结果中质控线为蓝色，检测线为无色，且阳性检测液对应的显色结果中质控线为蓝色，检测线为红色时，此次实验有效；否则实验视为无效，实验需重复；实验有效下，样本基因组DNA提取物对应的显色结果中，当质控线为蓝色，检测线为红色时，则判定为阳性；当质控线为蓝色，检测线为无色时，则判定为阴性；当质控线和检测线均为无色，则判定为无效，实验需重复。

方法具体包括以下步骤：

(1)本发明所述试剂盒不含基因组DNA提取试剂，血液样本可以使用市售的基因组DNA提取试剂盒，如血液基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，北京，中国)，具体提取步骤请参照提取试剂盒说明书，获得n-3份样本基因组DNA提取物。

(2)每次反应的总体积为50μl，按反应样本数n(反应样本数＝待检样本数+阴性对照1个+阳性对照1个+1)配制50μl×n的MIRA反应液：具体是取A buffer n×29.4μL、引物探针混合液n×4.6μL、无菌ddH

(3)取n-3份样本基因组DNA提取物、1份阴性对照物、1份阳性对照物各5μL分别加入对应的冻干酶粉反应管中震荡混匀，低速离心数秒，然后每个反应管中加入2.5μL Bbuffer，上下颠倒充分混匀后，立即置于水浴锅或恒温仪中，37-38℃孵育15 -20min。

(4)反应结束后，将样本检测液、阳性检测液和阴性检测液稀释10-20倍后，再将侧向流层析试纸条的样品端插入离心管中室温平衡，10min内观察质控线与检测线，获得对应的显色结果。

(5)当阴性检测液对应的显色结果中质控线为蓝色，检测线为无色，且阳性检测液对应的显色结果中质控线为蓝色，检测线为红色时，此次实验有效；否则实验视为无效，实验需重复；实验有效下，样本基因组DNA提取物对应的显色结果中，当质控线为蓝色，检测线为红色时，则判定为阳性；当质控线为蓝色，检测线为无色时，则判定为阴性；当质控线和检测线均为无色，则判定为无效，实验需重复。

本发明特别适用于对病原微生物的现场快速筛查，可在第一时间提供诊断依据，提高检测效率。本发明提供的检测HTLV-1前病毒DNA的多酶恒温扩增试剂盒及检测方法，能够实现血液中HTLV-1的快速准确鉴定，提高了检测HTLV-1的效率，简单快速便携，解决了现有技术存在操作流程繁琐，依赖大型精密设备(如PCR仪)，检测效率低，耗时等问题，特别适合于基层和现场检测，具有很广阔的应用前景。

本发明的有益效果在于：

(1)能够提高检测效率：MIRA整个试验过程只需要15-20min，该时间远远低于qPCR的60min，极大的缩短了扩增时间，提高了检测效率。

(2)能够降低反应温度：MIRA只需要恒温37-38℃即可完成试验，该温度远远低于qPCR的60℃-95℃。

(3)操作简单、可视化：对操作人员要求不高，不需要大型精密仪器设备，一只水浴锅或恒温仪便可进行实验，适用于对病原微生物的现场快速筛查；利用侧向流层析试纸条检测扩增产物，使结果可视化。

(4)灵敏度高、特异性强：通过优化反应时间和温度，提高检测方法的灵敏度和特异性。

附图说明

图1为本发明检测HTLV-1最优反应温度结果图；

图2为本发明检测HTLV-1最优反应时间结果图；

图3为本发明试剂盒检测HTLV-1标准品的灵敏度结果图；

图4为本发明试剂盒的特异性结果图，1：HTLV-1；2：HBV；3：HCV；4：HEV；5：CMV；6：HSV；7：B19；8：EBV；9：阴性对照；10：阳性对照。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方式进行详细说明。

实施例一

检测HTLV-1前病毒DNA的多酶恒温扩增试剂盒的制备

1.引物探针的设计合成

通过NCBI基因库下载HTLV-1的基因序列，下载完成后，利用DNAMAN软件进行多序列比对，筛选基因保守区域，根据MIRA引物探针设计原则，用primer premier 5.0设计引物探针，再将设计出的引物探针序列输入至NCBI BLAST上进行特异性比对，筛选出能够扩增出HTLV-1且不与其它病原体发生特异性扩增的引物探针，检测HTLV-1前病毒DNA的上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2所示，探针序列如SEQ ID NO.3所示。

其中，所述SEQ ID NO.2所示引物的5’端标记生物素基团；所述SEQ ID NO.3所示探针的5’端标记FAM荧光基团，在距5’端30nt序列位置上标记一个dSpacer(四氢呋喃，THF)，3’端标记修饰基团C3-spacer。

上述引物和探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。

2.阳性质粒制备

将HTLV-1特异性扩增基因片段通过分子克隆技术连接到质粒载体pUC57(生工生物工程(上海)股份有限公司)上，经转化、培养、鉴定后提取质粒DNA，利用NanoDrop2000超微量分光光度计测定质粒DNA浓度，根据copies/μl＝(6.02×10

HTLV-1特异性扩增片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.MIRA反应体系的建立及反应温度和反应时间的确定

用DNA恒温快速扩增试剂盒(胶体金型)(潍坊安普未来生物科技有限公司)进行MIRA反应，包括含冻干酶粉的反应管、A buffer以及B buffer。

MIRA体系如下：反应总体积为50μl，其中A buffer 29.4μl，引物探针混合液4.6μl，提取的基因组DNA模板、阴性对照、阳性对照分别各5μl，无菌ddH

为了筛选出最佳反应条件，以10

优化后的最佳反应条件：37℃孵育15min。反应结束后，取8μL加入含有152μL无菌ddH

试验一：本发明试剂盒的灵敏度评价

对实施例一所述的检测HTLV-1前病毒DNA的多酶恒温扩增试剂盒的灵敏度进行评价，具体方法是：将浓度为10

结果如图3所示，10

试验二：本发明试剂盒的特异性评价

对实施例一所述的检测HTLV-1前病毒DNA的多酶恒温扩增试剂盒的特异性进行评价，具体方法是：按照实施例一优化得到的恒温扩增检测方法对HTLV-1阳性标本和其他病毒如乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、戊型肝炎病毒(HEV)、人巨细胞病毒(CMV)、单纯疱疹病毒(HSV)、人细小病毒(B19)、Epstein-Barr病毒(EBV)阳性标本进行检测，并设阴性对照和阳性对照。

结果如图4所示，只有HTLV-1阳性标本和阳性对照的扩增产物同时出现质控线和检测线，其他7种病毒和阴性对照仅出现质控线，说明本发明试剂盒具有良好的特异性，能够将HTLV-1特异性地检测出，并且与上述其他病原体无交叉反应。

试验三：本发明试剂盒对临床样本的检测

收集临床血液样本500份，使用市售的基因组DNA提取试剂盒提取样本基因组DNA，然后采用本发明所述的恒温扩增试剂盒，按照实施例一所述的恒温扩增检测方法对从500份临床样本中提取的基因组DNA进行检测，结果如下：临床血液样本共500份，筛查出HTLV-1阳性标本1份，与荧光定量PCR检测结果相符，验证了本发明试剂盒的准确性。

以上实施例仅用于阐述本发明的原理与应用，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以上实施例。

本发明中涉及到的基因序列如下：

SEQ ID No.1；

名称：上游引物

来源：synthetic construct

类型：other DNA

5’-AGACCCCGGACTCCGGCCCCAAAACCTG-3’

SEQ ID No.2；

名称：下游引物

来源：synthetic construct

类型：other DNA

5’-Biotin-GGCGTGCCATCGGTAAATGTCCAAATAA-3’

SEQ ID No.3；

名称：探针

来源：synthetic construct

类型：other DNA

5’-FAM-GCCAGCTCGGGGCCTTCCTCACCAATGTTC/THF/

CTACAAGCGAATAGA-3’C3spacer

SEQ ID No.4；

名称：HTLV-1特异性扩增片段

来源：synthetic construct

类型：other DNA

AGACCCCGGACTCCGGCCCCAAAACCTGTACACCCTCTGGGGAGGCTCCGTTGTCTGCATGTACCTCTACCAGCTTTCCCCCCCCATCACCTGGCCCCTCCTGCCCCACGTGATTTTTTGCCACCCCGGCCAGCTCGGGGCCTTCCTCACCAATGTTCCCTACAAGCGAATAGAAGAACTCCTCTATAAAATTTCCCTCACCACAGGGGCCCTAATAATTCTACCCGAAGACTGTTTGCCCACCACCCTTTTCCAGCCTGCTAGGGCACCCGTCACGCTAACAGCCTGGCAAAACGGCCTCCTTCCGTTCCACTCAACCCTCACCACTCCAGGCCTTATTTGGACATTTACCGATGGCACGCC

<110>浙江大学医学院附属第一医院

<120>检测HTLV-1前病毒DNA的多酶恒温扩增试剂盒及检测方法

<160>4

<170>SIPOSequenceListing 1.0

<210>1

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

agaccccgga ctccggcccc aaaacctg 28

<210>2

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>2

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<210>3

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>3

gccagctcgg ggccttcctc accaatgttc ctacaagcga ataga 45

<210>4

<211>363

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>4