一种高效连接mRNA片段的方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高效连接mRNA片段的方法及其应用。

背景技术

随着基因治疗领域和mRNA药物研发的迅猛发展，越来越多的mRNA药物研究需要用到工业量级如毫克和克级高纯度mRNA。目前常规mRNA获得主要有两种方法，包括化学合成法和体外转录法。

化学合成法的最大优点是可以规模化大量合成，且可以给特定的碱基加上特定的修饰。但其价格昂贵，且现有合成技术水平只能合成短链RNA分子，当合成RNA的长度超过170nt后，其合成效率大幅降低，副产物序列增多，极大增加了下游的纯化步骤和成本。

体外转录法理论上转录长度不受限制，但也存在诸多问题。如需要RNA聚合酶，且需要制备大量的质粒并用DNA限制性内切酶切成线性质粒或需要通过大量的PCR反应获得线性模板，这极易导致操作过程中引入突变产物。

工业级别的酶需求以及大量质粒模板的制备极大增加了成本和放大难度，进一步的，体外转录无法给mRNA的特定碱基加特定修饰，polyA尾的长度受限制，且长度无法精确控制。

目前已有规模化合成长链RNA的方法及定点修饰长链RNA的方法，该方法首先利用化学法合成大量RNA短链片段，然后通过合成的DNA夹板将RNA短链片段连接成长链RNA。但该方法操作复杂，化学合成多段RNA片段成本高，且多片段连接效率不能保证，也无法打破polyA尾的长度限制。因此，开发一种利用特殊设计的DNA夹板将不同的IVT产物和不同的化学合成片段高效快速连接的方法在核酸分子合成中具有重要的应用前景。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种高效连接mRNA片段的方法及其应用。本发明将体外转录和化学合成相结合，分别利用各自的优势，用特殊设计的DNA夹板将不同的体外转录产物和不同的化学合成片段高效连接，可制备不同长度的mRNA，并可以突破polyA尾的长度限制，长度可精确控制，且可引入特定的修饰。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种高效连接mRNA片段的方法，所述方法包括：将第一mRNA片段、第二mRNA片段与DNA夹板混合，并用RNA连接酶进行连接反应；

所述DNA夹板由互补序列1和互补序列2组成；所述互补序列1与第一mRNA片段的3’末端互补配对；所述互补序列2与第二mRNA片段的5’末端互补配对；所述互补序列1与第一mRNA片段的3’末端互补配对后第一mRNA片段的3’末端含有3-10个碱基冗余(例如可以是3、4、5、6、7、8、9或10)。

本发明通过DNA夹板将不同长度和序列特征的mRNA连接成为长片段mRNA，效率高，制备方法简单，可制备长poly(A)mRNA。

优选地，所述互补序列1的碱基数为15-30，优选为18-25，进一步优选为20，碱基数例如可以是15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。

优选地，所述互补序列2的碱基数为15-30，优选为18-25，进一步优选为20，碱基数例如可以是15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。

优选地，所述连接反应的具体步骤包括：

将DNA夹板与第二mRNA片段进行退火反应，得到DNA夹板适配体；将所得DNA夹板适配体、第一mRNA片段和RNA连接酶孵育。

优选地，所述DNA夹板与第二mRNA片段的摩尔比为1:(0.8-1.2)，例如可以是1:0.8、1:0.9、1:1、1:1.1或1:1.2等。

优选地，所述退火反应的程序为：热盖47±2℃，40±2℃孵育1±0.5min，0.2±0.1℃/s降温至16±2℃，16±2℃保温。

优选地，所述DNA夹板适配体与第一mRNA片段的摩尔比为1:(1-1.5)，例如可以是1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4或1:1.5等。

优选地，所述DNA夹板适配体的终浓度为1.8-2.2μM，例如可以是1.8μM、1.9μM、2μM、2.1μM或2.2μM等。

优选地，所述第一mRNA片段的终浓度为1-3μM，例如可以是1μM、1.5μM、2μM、2.5μM或3μM等。

优选地，所述RNA连接酶的终浓度为0.8-1.2unit/μL，例如可以是0.8unit/μL、0.9unit/μL、1unit/μL、1.1unit/μL或1.2unit/μL等。

优选地，所述连接反应后还包括采用DNA酶消化DNA夹板，纯化去除杂质的步骤。

优选地，所述DNA酶为DNA酶I。

优选地，所述DNA酶I的反应程序为：热盖47±2℃，37±0.5℃孵育30±0.5min，16±2℃保温。

优选地，所述纯化去除杂质的步骤包括：采用氯化锂溶液对消化后的mRNA进行沉淀，孵育后离心收集沉淀；采用Oligo d(T)磁珠纯化连接成功的mRNA。

优选地，所述所述氯化锂溶液的终浓度为1-1.25M，例如可以是1M、1.1M、1.15M、1.2M或1.25M等。

本发明先通过体外转录或化学合成制备不同长度的mRNA，设计不同碱基互补配对的DNA夹板，用RNA连接酶将两段或多段mRNA连接起来，通过DNA酶消化，去除DNA夹板，从而获得不同长度的长片段或长poly(A)的mRNA。

第二方面，本发明提供一种提高mRNA连接效率的DNA夹板，所述DNA夹板将第一mRNA片段和第二mRNA片段连接成长片段mRNA，所述DNA夹板由互补序列1和互补序列2组成；所述互补序列1的碱基数为15-30；所述互补序列2的碱基数为15-30；

所述互补序列1与第一mRNA片段的3’末端互补配对；所述互补序列2与第二mRNA片段的5’末端互补配对；所述互补序列1与第一mRNA片段的3’末端互补配对后第一mRNA片段的3’末端含有3-10个碱基冗余(例如可以是3、4、5、6、7、8、9或10)。

第三方面，本发明提供第一方面所述的高效连接mRNA片段的方法和/或第二方面所述的提高mRNA连接效率的DNA夹板在制备mRNA药物中的应用。

本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种能够显著提高体外转录RNA和合成RNA连接效率的DNA夹板，所述DNA夹板与体外转录mRNA 3’末端有数个碱基冗余不配对，且DNA夹板长度为30-60bp，并且通过所述DNA夹板和特定的RNA连接方法可将不同长度和序列特征的mRNA高效连接成为长片段mRNA，可制备不同长度的mRNA，并可以突破polyA尾的长度限制，长度可精确控制，且可引入特定的修饰。

附图说明

图1是DNA夹板W196的连接示意图。

图2是DNA夹板W197的连接示意图。

图3是DNA夹板的连接效率结果统计(一)。

图4是DNA夹板W254的连接示意图。

图5是DNA夹板W255的连接示意图。

图6是DNA夹板W256的连接示意图。

图7是DNA夹板W257的连接示意图。

图8是DNA夹板W258的连接示意图。

图9是DNA夹板W259的连接示意图。

图10是DNA夹板W260的连接示意图。

图11是DNA夹板W261的连接示意图。

图12是DNA夹板W262的连接示意图。

图13是DNA夹板W263的连接示意图。

图14是DNA夹板W264的连接示意图。

图15是DNA夹板W321的连接示意图。

图16是DNA夹板W322的连接示意图。

图17是DNA夹板W1177的连接示意图。

图18是DNA夹板W1178的连接示意图。

图19是DNA夹板W1179的连接示意图。

图20是DNA夹板W1180的连接示意图。

图21是DNA夹板W1181的连接示意图。

图22是DNA夹板的连接效率结果统计(二)。

图23是高效连接mRNA片段的方法的示意图。

图24是DNA夹板适配体制备及RNA连接的结果。

图25为连接反应后-RNA纯化前的样品毛细管电泳检测结果。

图26为连接反应后-RNA LiCl沉淀后样品毛细管电泳检测结果。

图27为连接反应后-RNA磁珠纯化后样品毛细管电泳检测结果。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1

本实施例以nLuc作为研究对象，体外转录一段不带polyA的nLuc mRNA(SEQ IDNO.1)，化学合成一段69nt的RNA(末端带有49个A，SEQ ID NO.2)，同时化学合成一段末端完全互补配对的DNA夹板(W196，SEQ ID NO.3)，采用如图1所示的常规连接方法进行连接。

连接的具体步骤如下所示：

(1)将DNA夹板与第二mRNA片段进行退火反应，得到DNA夹板适配体。

退火反应体系中包括1×T4 RNA连接酶缓冲液(50mM Tris-HCl，2mM MgCl

(2)DNA夹板适配体、第一mRNA片段和RNA连接酶孵育

将DNA夹板适配体和第一mRNA片段混合，所述DNA夹板适配体的终浓度为2μM，所述第一mRNA片段的终浓度为1.5-3μM；并向约20pmol的RNA混合物中加入10U RNA连接酶II(NEB，M0239L)，37℃孵育30分钟。

(3)采用DNA酶消化DNA夹板，纯化去除杂质

采用DNA酶I(碧云天，D7076)消化DNA夹板，消化反应的条件为37℃反应30分钟，以去除得到的长链RNA中用于连接的夹板DNA。将得到的长链RNA用R1卡夹进行毛细管电泳检测，以获得DNA夹板作用下的RNA连接效率。

对得到的长链RNA进行氯化锂沉淀和Oligo d(T)磁珠纯化，以获得纯化后的长链RNA。对纯化后的长链RNA用R1卡夹进行毛细管电泳检测，以检测其纯度。

实施例2

本实施例提供一种高效连接mRNA片段的方法，所述方法包括：将第一mRNA片段、第二mRNA片段与DNA夹板混合，并用RNA连接酶进行连接反应。

所述第一mRNA片段为体外转录的不带polyA的nLuc mRNA(SEQ ID NO.1)，所述第二mRNA片段为化学合成的一段69nt的RNA(末端带有49个A，SEQ ID NO.2)；所述DNA夹板为一段与体外转录mRNA 3’末端有6个碱基冗余不配对的DNA夹板(W197，SEQ ID NO.4)；采用如图2所示的连接方法将第一mRNA片段、第二mRNA片段与DNA夹板进行连接。

连接的具体步骤如下所示：

(1)将DNA夹板与第二mRNA片段进行退火反应，得到DNA夹板适配体。

退火反应体系中包括1×T4 RNA连接酶缓冲液(50mM Tris-HCl，2mM MgCl

(2)DNA夹板适配体、第一mRNA片段和RNA连接酶孵育

将DNA夹板适配体和第一mRNA片段混合，所述DNA夹板适配体的终浓度为2μM，所述第二mRNA片段的终浓度为1.5-3μM；并向约20pmol的RNA混合物中加入10U RNA连接酶II(NEB，M0239L)，37℃孵育30分钟。

(3)采用DNA酶消化DNA夹板，纯化去除杂质

采用DNA酶I(碧云天，D7076)消化DNA夹板，消化反应的条件为37℃反应30分钟，以去除得到的长链RNA中用于连接的夹板DNA。将得到的长链RNA用R1卡夹进行毛细管电泳检测，以获得DNA夹板作用下的RNA连接效率。

对得到的长链RNA进行氯化锂沉淀和Oligo d(T)磁珠纯化，以获得纯化后的长链RNA。对纯化后的长链RNA用R1卡夹进行毛细管电泳检测，以检测其纯度。

实施例1中的DNA夹板W196和实施例2中的DNA夹板W197的连接效率结果如图3所示，相比于末端完全互补配对的DNA夹板W196，在体外转录mRNA3’末端冗余6个碱基的W197的连接效率提高2.144倍。

实施例3

本实施例提供一种高效连接mRNA片段的方法，所述方法与实施例2的区别仅在于，所述DNA夹板如表1所示。

表1

本实施例探究了单侧体外转录mRNA 3’末端不同数目碱基冗余对RNA连接效率的影响。上述夹板(W254、W255、W256，如SEQ ID NO.5-7所示，图4-6)，与体外转录mRNA 3’末端分别有2个、4个和8个碱基冗余不配对。

实施例4

本实施例提供一种高效连接mRNA片段的方法，所述方法与实施例2的区别仅在于，所述DNA夹板如表2所示。

表2

本实施例探究了单侧合成RNA的5’末端不同数目碱基冗余对RNA连接效率的影响。上述夹板(W257、W258、W259、W260，如SEQ ID NO.8-11所示，图7-10)，与合成RNA5’末端有2个、4个、6个和8个碱基冗余不配对。

实施例5

本实施例提供一种高效连接mRNA片段的方法，所述方法与实施例2的区别仅在于，所述DNA夹板如表3所示。

表3

本实施例探究了双侧空出碱基长度对连接效率的影响。上述夹板(W261、W262、W263、W264，如SEQ ID NO.12-15所示，图11-14)，为双侧RNA分别冗余2和6个碱基、4和4个碱基、6和2个碱基、6和6个碱基。

实施例3-5中分别对不同DNA夹板的连接效率进行验证，结果如图3所示：在多种DNA夹板的对比中，W197的连接效率最高，为53.6％，与之连接效率相当的DNA夹板为W255，其效率为52.8％。即在体外转录mRNA 3’末端冗余4-6个碱基且与合成RNA5’末端完全互补配对的DNA夹板对IVT mRNA和合成RNA具有相对更高的连接效率。

实施例6

本实施例提供一种高效连接mRNA片段的方法，所述方法与实施例2的区别仅在于，所述DNA夹板如表4所示。

表4

本实施例中探究了夹板中间空缺碱基长度对连接效率的影响，在DNA夹板W197的基础上测试了通过夹板将两段RNA间隔开的碱基数目对RNA连接效率的影响，两段RNA之间分别间隔2个碱基和4个碱基(W321、W322，如SEQ ID NO.16-17所示，图15-16)时，其连接效率分别为45.7％和45.1％，两者无差异，但相较W197均发生降低。

实施例7

本实施例提供一种高效连接mRNA片段的方法，所述方法与实施例2的区别仅在于，所述DNA夹板如表5所示。

表5

本实施例探究了不同夹板长度对连接效率的影响，本实施例在W197的基础上测试了不同DNA夹板的长度，如16nt、20nt、30nt、40nt、50nt、60nt DNA夹板(W1177-W1181，如SEQID NO.18-22所示，图17-21)对RNA连接效率的影响，结果如图22所示：相比于40nt的W197，50nt的DNA夹板W1180的连接效率与之接近，两者分别为48.0％和47.7％，当DNA夹板长度减短时，连接效率逐渐降低。

应用例1

本应用例基于上述验证的W197在测试的多种DNA夹板中对IVT的nLuc mRNA(662nt)和合成的RNA(69nt)具有相对最高的连接效率，发明者使用W197对更长或更短的目标mRNA进行连接测试，以验证该DNA夹板在目前的连接方案下可实现不同长度mRNA的连接。

(1)300nt和400nt RNA连接测试

依据前述连接方案，使用兆维mRNA体外转录系统分别体外转录制备300nt和400ntmRNA(如SEQ ID NO.23-24所示)，向10μL体外转录结束后的RNA反应液中加入10μL DNA夹板适配体(DNA夹板适配体为W197和69nt Poly A退火形成的桥接片段，如图23)，并向反应液中加入2μLRNA连接酶II，混匀后37℃孵育30分钟。向连接反应液中继续加入1.2μLDNA酶I，37℃孵育30分钟，毛细管电泳检测。

DNA夹板适配体制备及RNA连接的结果如图24所示，300nt RNA的连接效率约为25.5％，400nt RNA的连接效率约为12.8％。由于RNA片段太短，体外转录结果纯度较低，致使RNA连接效率偏低。

(2)1796nt RNA连接测试

依据前述连接方案，使用兆维mRNA体外转录系统制备1796nt mRNA(以SEQ IDNO.25所示DNA序列为模板体外转录制备)，向10μL体外转录结束后的RNA反应液中加入10μLDNA夹板适配体(DNA夹板适配体为W197和69nt Poly A退火形成的桥接片段)，并向反应液中加入2μL RNA连接酶II，混匀后37℃孵育30分钟。向连接反应液中继续加入1.2μL DNA酶I，37℃孵育30分钟。

由于在使用毛细管电泳检测较大的RNA片段时，无法区分69nt的大小差异，DNA酶I消化后的大片段RNA样品需通过LiCl沉淀去除大部分Poly A残留，再使用Oligo d(T)磁珠纯化回收含Poly A尾的mRNA，即连接成功的RNA。纯化前后的样品毛细管电泳检测，结果如图25-27所示，图25为连接反应后-RNA纯化前的样品毛细管电泳检测结果，图26为连接反应后-RNA LiCl沉淀后样品毛细管电泳检测结果，图27为连接反应后-RNA磁珠纯化后样品毛细管电泳检测结果，该RNA连接方法可实现较大片段RNA的连接。

综上，本发明开发出一种能够显著提高体外转录RNA和合成RNA连接效率的DNA夹板，并且通过该夹板和特定的RNA连接方法可将不同长度和序列特征的mRNA高效连接成为长片段mRNA。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。