一种多肽水凝胶负载充质干细胞及其制备工艺

技术领域

本发明涉及多肽水凝胶技术领域，具体为一种多肽水凝胶负载充质干细胞及其制备工艺。

背景技术

水凝胶是具有网状交联结构的水溶性高分子，是一种高分子网络体系，广泛应用于化妆品、医疗用品等领域。美国约翰·霍普金斯大学医学院报告公布了一种新型的水凝胶生物材料，在软骨修复手术中，将其注入骨骼小洞，能够帮助刺激病人的骨髓产生干细胞，长出新的软骨，新生软骨覆盖率高达86％，大大减轻了术后疼痛。水凝胶在医学上的应用非常广泛。

多肽水凝胶可通过化学交联或物理交联的方式制备，具有良好的生物相容性，是一种新型的绿色环保的凝胶材料，在生物医药材料、食品添加剂等方面具有非常广阔的应用前景。在论文《功能化多肽水凝胶细胞外基质对神经干细胞增殖分化的调控研究》中报道了一种RGD环肽水凝胶，可培养各种工程靶细胞、胚胎等，多肽的加入使得干细胞的生长状态更加完善，对后期的观察研究起到了积极的作用。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种多肽水凝胶负载充质干细胞及其制备工艺，为充质干细胞的培养提供了一个更加完善的平台。

(二)技术方案

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种多肽水凝胶，其制备方法如下步骤：

(1)将蚕茧剪成小片，用去离子水反复冲洗，再用索氏萃取器在丙酮中除去蜡质和色素成分，然后将蚕茧置于去离子水中煮沸1-3h，然后将得到的丝胶溶液与聚乙烯醇溶液混合，70-90℃水浴加热，搅拌2-5h，混合均匀，静置备用；

(2)取100-120mL混合溶液倒入平底容器中，使溶液高度保持5-8mm，倒入浓度为90-95％的工业酒精，冷冻20-40h，再置于室温下解冻4-8h，循环2-6次，完成后取出凝胶，用平板上下压住，得到聚乙烯醇凝胶薄膜；

(3)将1-5g聚乙烯醇加入到溶剂二甲亚砜中，浸泡30-60min，搅拌下加热至40-60℃，滴加丙烯酰氯，搅拌10-30min，然后加入巯基乙酸，恒温震荡2-6h，然后置于摇床室温下震荡12-18h，呈凝胶状，得到丙烯酰氯-聚乙烯醇-巯基；

(4)将2-10mg的多肽IKVAV(异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸)溶解到2-10mL的磷酸缓冲盐溶液中，制备出IKVAV溶液，再将4-10mg的丙烯酰氯-聚乙烯醇-巯基溶解到1-10mL的磷酸缓冲盐溶液中，制备出丙烯酰氯-聚乙烯醇-巯基溶液，然后将IKVAV溶液逐滴加入丙烯酰氯-聚乙烯醇-巯基溶液并不断搅拌，加完后继续搅拌2-5h，得到丙烯酰氯-聚乙烯醇-IKVAV溶液；

(5)吸取丙烯酰氯-聚乙烯醇-IKVAV溶液滴加到制备好的水凝胶薄膜上，并使其分布均匀，然后将其移入到通氮气的石英管中，用紫外灯照射石英管5-10min，得到多肽水凝胶，即IKVAV水凝胶；

(6)将充质干细胞制成细胞悬液，把用磷酸缓冲盐溶液洗过的水凝胶移入培养皿中，加入10-20mL的充质干细胞悬液，放入36-38℃培养箱中进行培养，观察充质干细胞的生长状态。

优选的，所述步骤(1)中聚乙烯醇溶液的浓度为10-20％。

优选的，所述步骤(2)中冷冻温度为-10--30℃。

优选的，所述步骤(3)中聚乙烯醇与丙烯酰氯的摩尔比为1:1-1.5。

优选的，所述步骤(3)中丙烯酰氯-聚乙烯醇与巯基乙酸的质量比为1:2-5。

优选的，所述步骤(4)中多肽IKVAV与丙烯酰氯-聚乙烯醇-巯基的质量比为1:1-3。

优选的，所述步骤(5)中丙烯酰氯-聚乙烯醇-IKVAV溶液的体积为3-10μl。

优选的，所述步骤(6)中充质干细胞悬液的密度为1×10

(三)有益的技术效果

将蚕茧制成丝胶溶液与聚乙烯醇溶液混合，制成凝胶，将聚乙烯醇、丙烯酰氯、巯基乙酸混合反应，多肽IKVAV和丙烯酰氯-聚乙烯醇-巯基溶解到磷酸缓冲盐溶液中制成溶液，得到丙烯酰氯-聚乙烯醇-IKVAV溶液，并滴加到水凝胶薄膜上，紫外灯照射得多肽水凝胶，将充质干细胞置于水凝胶培养，观察充质干细胞的后续生长状态。

水凝胶与多肽的融合，填补了水凝胶在负载干细胞方面功能单一化的缺点，所选取的多肽对干细胞的生长、分化方能有着重要的作用，在负载细胞的同时，也能更好的为干细胞提供一个更完善的生存环境。同时此多肽水凝胶制作简单，对实验和医疗方面的制作难度较低，控制成本。

附图说明

图1是IKVAV水凝胶接种的充质干细胞吸光值测试。

图2是细胞粘附率测试。

图3是多肽接枝率测试。

具体实施方式

实施例1

(1)将蚕茧剪成小片，用去离子水反复冲洗，再用索氏萃取器在丙酮中除去蜡质和色素成分，然后将蚕茧置于去离子水中煮沸3h，然后将得到的丝胶溶液与浓度为20％的聚乙烯醇溶液混合，90℃水浴加热，搅拌5h，混合均匀，静置备用。

(2)取100mL混合溶液倒入平底容器中，使溶液高度保持5mm，倒入浓度为90％的工业酒精，-10℃冷冻20-40h，再置于室温下解冻4h，循环2次，完成后取出凝胶，用平板上下压住，得到聚乙烯醇凝胶薄膜。

(3)将4g聚乙烯醇加入到溶剂二甲亚砜中，浸泡55min，搅拌下加热至55℃，滴加9mL丙烯酰氯，搅拌20min，然后加入25g巯基乙酸，恒温震荡5h，然后置于摇床室温下震荡17h，呈凝胶状，得到丙烯酰氯-聚乙烯醇-巯基。

(4)将10mg的多肽IKVAV(异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸)溶解到10mL的磷酸缓冲盐溶液中，制备出IKVAV溶液，再将10mg的丙烯酰氯-聚乙烯醇-巯基溶解到10mL的磷酸缓冲盐溶液中，制备出丙烯酰氯-聚乙烯醇-巯基溶液，然后将IKVAV溶液逐滴加入丙烯酰氯-聚乙烯醇-巯基溶液并不断搅拌，加完后继续搅拌5h，得到丙烯酰氯-聚乙烯醇-IKVAV溶液。

(5)吸取3μl的丙烯酰氯-聚乙烯醇-IKVAV溶液滴加到制备好的水凝胶薄膜上，并使其分布均匀，然后将其移入到通氮气的石英管中，用紫外灯照射石英管5min，得到多肽水凝胶，即IKVAV水凝胶。

(6)将充质干细胞制成细胞悬液，密度为1×10

实施例2

(1)将蚕茧剪成小片，用去离子水反复冲洗，再用索氏萃取器在丙酮中除去蜡质和色素成分，然后将蚕茧置于去离子水中煮沸1h，然后将得到的丝胶溶液与浓度为10％的聚乙烯醇溶液混合，70℃水浴加热，搅拌2h，混合均匀，静置备用。

(2)取100-120mL混合溶液倒入平底容器中，使溶液高度保持8mm，倒入浓度为95％的工业酒精，-30℃冷冻40h，再置于室温下解冻8h，循环2-6次，完成后取出凝胶，用平板上下压住，得到聚乙烯醇凝胶薄膜。

(3)将1g聚乙烯醇加入到溶剂二甲亚砜中，浸泡30min，搅拌下加热至40℃，滴加2mL丙烯酰氯，搅拌10min，然后加入5g巯基乙酸，恒温震荡2h，然后置于摇床室温下震荡12h，呈凝胶状，得到丙烯酰氯-聚乙烯醇-巯基。

(4)将2mg的多肽IKVAV(异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸)溶解到2mL的磷酸缓冲盐溶液中，制备出IKVAV溶液，再将4mg的丙烯酰氯-聚乙烯醇-巯基溶解到1mL的磷酸缓冲盐溶液中，制备出丙烯酰氯-聚乙烯醇-巯基溶液，然后将IKVAV溶液逐滴加入丙烯酰氯-聚乙烯醇-巯基溶液并不断搅拌，加完后继续搅拌2h，得到丙烯酰氯-聚乙烯醇-IKVAV溶液。

(5)吸取10μl的丙烯酰氯-聚乙烯醇-IKVAV溶液滴加到制备好的水凝胶薄膜上，并使其分布均匀，然后将其移入到通氮气的石英管中，用紫外灯照射石英管10min，得到多肽水凝胶，即IKVAV水凝胶。

(6)将充质干细胞制成细胞悬液，密度为1×10

实施例3

(1)将蚕茧剪成小片，用去离子水反复冲洗，再用索氏萃取器在丙酮中除去蜡质和色素成分，然后将蚕茧置于去离子水中煮沸2h，然后将得到的丝胶溶液与浓度为15％的聚乙烯醇溶液混合，75℃水浴加热，搅拌3h，混合均匀，静置备用。

(2)取115mL混合溶液倒入平底容器中，使溶液高度保持7mm，倒入浓度为95％的工业酒精，-28℃冷冻30h，再置于室温下解冻5h，循环5次，完成后取出凝胶，用平板上下压住，得到聚乙烯醇凝胶薄膜。

(3)将5g聚乙烯醇加入到溶剂二甲亚砜中，浸泡60min，搅拌下加热至60℃，滴加10mL丙烯酰氯，搅拌30min，然后加入30g巯基乙酸，恒温震荡6h，然后置于摇床室温下震荡18h，呈凝胶状，得到丙烯酰氯-聚乙烯醇-巯基。

(4)将5mg的多肽IKVAV(异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸)溶解到6mL的磷酸缓冲盐溶液中，制备出IKVAV溶液，再将8mg的丙烯酰氯-聚乙烯醇-巯基溶解到4mL的磷酸缓冲盐溶液中，制备出丙烯酰氯-聚乙烯醇-巯基溶液，然后将IKVAV溶液逐滴加入丙烯酰氯-聚乙烯醇-巯基溶液并不断搅拌，加完后继续搅拌3h，得到丙烯酰氯-聚乙烯醇-IKVAV溶液。

(5)吸取8μl的丙烯酰氯-聚乙烯醇-IKVAV溶液滴加到制备好的水凝胶薄膜上，并使其分布均匀，然后将其移入到通氮气的石英管中，用紫外灯照射石英管7min，得到多肽水凝胶，即IKVAV水凝胶。

(6)将充质干细胞制成细胞悬液，密度为1.2×10

实施例4

(1)将蚕茧剪成小片，用去离子水反复冲洗，再用索氏萃取器在丙酮中除去蜡质和色素成分，然后将蚕茧置于去离子水中煮沸1.5h，然后将得到的丝胶溶液与浓度为12％的聚乙烯醇溶液混合，80℃水浴加热，搅拌4h，混合均匀，静置备用。

(2)取105mL混合溶液倒入平底容器中，使溶液高度保持7mm，倒入浓度为90％的工业酒精，-20℃冷冻25h，再置于室温下解冻7h，循环3次，完成后取出凝胶，用平板上下压住，得到聚乙烯醇凝胶薄膜。

(3)将3g聚乙烯醇加入到溶剂二甲亚砜中，浸泡40min，搅拌下加热至45℃，滴加5mL丙烯酰氯，搅拌15min，然后加入10g巯基乙酸，恒温震荡3h，然后置于摇床室温下震荡15h，呈凝胶状，得到丙烯酰氯-聚乙烯醇-巯基。

(4)将4mg的多肽IKVAV(异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸)溶解到8mL的磷酸缓冲盐溶液中，制备出IKVAV溶液，再将4mg的丙烯酰氯-聚乙烯醇-巯基溶解到7mL的磷酸缓冲盐溶液中，制备出丙烯酰氯-聚乙烯醇-巯基溶液，然后将IKVAV溶液逐滴加入丙烯酰氯-聚乙烯醇-巯基溶液并不断搅拌，加完后继续搅拌4h，得到丙烯酰氯-聚乙烯醇-IKVAV溶液。

(5)吸取5μl的丙烯酰氯-聚乙烯醇-IKVAV溶液滴加到制备好的水凝胶薄膜上，并使其分布均匀，然后将其移入到通氮气的石英管中，用紫外灯照射石英管6min，得到多肽水凝胶，即IKVAV水凝胶。

(6)将充质干细胞制成细胞悬液，密度为1.3×10

实施例5

(1)将蚕茧剪成小片，用去离子水反复冲洗，再用索氏萃取器在丙酮中除去蜡质和色素成分，然后将蚕茧置于去离子水中煮沸2.5h，然后将得到的丝胶溶液与浓度为12％的聚乙烯醇溶液混合，85℃水浴加热，搅拌4h，混合均匀，静置备用。

(2)取110mL混合溶液倒入平底容器中，使溶液高度保持6mm，倒入浓度为95％的工业酒精，-15℃冷冻30h，再置于室温下解冻5h，循环5次，完成后取出凝胶，用平板上下压住，得到聚乙烯醇凝胶薄膜。

(3)将4g聚乙烯醇加入到溶剂二甲亚砜中，浸泡55min，搅拌下加热至55℃，滴加9mL丙烯酰氯，搅拌18min，然后加入22g巯基乙酸，恒温震荡5h，然后置于摇床室温下震荡15h，呈凝胶状，得到丙烯酰氯-聚乙烯醇-巯基。

(4)将3mg的多肽IKVAV(异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸)溶解到6mL的磷酸缓冲盐溶液中，制备出IKVAV溶液，再将5mg的丙烯酰氯-聚乙烯醇-巯基溶解到3mL的磷酸缓冲盐溶液中，制备出丙烯酰氯-聚乙烯醇-巯基溶液，然后将IKVAV溶液逐滴加入丙烯酰氯-聚乙烯醇-巯基溶液并不断搅拌，加完后继续搅拌3h，得到丙烯酰氯-聚乙烯醇-IKVAV溶液。

(5)吸取7μl的丙烯酰氯-聚乙烯醇-IKVAV溶液滴加到制备好的水凝胶薄膜上，并使其分布均匀，然后将其移入到通氮气的石英管中，用紫外灯照射石英管6min，得到多肽水凝胶，即IKVAV水凝胶。

(6)将充质干细胞制成细胞悬液，密度为1.3×10

噻唑蓝法检测充质干细胞活性

把培养12h的接种了充质干细胞的水凝胶薄膜换到新的24孔板中，每孔加入200μl(5mg/ml)的噻唑蓝溶液，继续培养4h，终止培养，吸出孔内培养液，在每孔中加入1ml二甲基亚砜溶液，酶标仪570nm下测吸光值。

结果：充质干细胞能够较多的粘附在接枝IKVAV的水凝胶薄膜上，通过吸光度的检测，吸光值明显较高，这样可以说明充质干细胞不仅粘附在了多肽IKVAV改性的水凝胶薄膜表面而且在凝胶表面已经可以生长具有活性，说明IKVAV改性水凝胶是可行的。