一种防治药用植物根结线虫的土壤改良剂

技术领域

一种防治药用植物根结线虫的土壤改良剂的制备方法，属于农学领域。

背景技术

根结线虫对植物的危害主要体现在对植物根部的直接侵害。受害作物的根部会形成瘤状突起，导致生长不良、沤根腐烂。由于根系受到影响，大多数受害植株初期地上部分生长迟缓，叶片变小、变黄，呈点片缺肥状，不结实或结实不良。严重时生长停滞，节间缩短，植株矮小甚至萎蔫。此外，根结线虫破坏了根组织的正常分化和生理活动，水分和养料的运输受到阻碍，光合作用下降，果实常发生畸形或着色不均匀，最终造成产量下降，品质降低。

加拿大一枝黄花其提取物含有如黄酮类、多糖类等多种具有杀线虫的有效活性物质，其提取物也越来越被应用在防止根结线虫的防治应用中。为进一步防止根结线虫对植物的危害越来越多的学者利用植物源中提取出具有杀虫效果的有效成分，发明以植物源型农药或土壤改良剂来防治根结线虫的危害。但现有技术存在有效物质提取纯度不高，防止效果不好等特点。

发明内容

为了克服现有技术领域存在的上述技术问题，本发明的目的在于，提供一种防治药用植物根结线虫的土壤改良剂制备方法。

本发明提供一种防治药用植物根结线虫的土壤改良剂，包括以下步骤：

步骤（1）加拿大一枝黄花的粉碎

取一定新鲜的加拿大一枝黄花，将其洗净，然后干燥一段时间，使用颚式破碎机破碎，破碎过程中加入一定惰性气体且将温度控制在合适温度下，破碎后获得适宜粒度的加拿大一枝黄花粉末；

步骤（2）超声协同酶法提取

S21将破碎后的加拿大一枝黄花粉末与配制好的β-葡萄糖苷酶溶液充分混合，确保粉末均匀湿润；

S22将混合后的溶液置于超声波处理设备中。调整超声波的频率、功率和处理时间，进行超声处理；

S23超声处理完成后，让混合物静置一段时间，使β-葡萄糖苷酶充分作用；

S24在酶解反应完成后，加入适量的酶抑制剂亮肽素，终止酶解反应，并将终止酶解后的混合物使用离心机进行离心分离，获得加拿大一枝黄花粗提取物；

步骤（3）吸附柱色谱法分离

将硅胶作为吸附剂与甲醇溶液混合，搅拌以除去空气泡，徐徐倾入色谱柱中，然后再加入甲醇溶液，将附着于管壁的吸附剂洗下，使色谱柱表面平整；去一定加拿大一枝黄花粗提取物溶于甲醇溶剂中，与少量吸附剂混匀，再使溶剂挥发去尽后使呈松散状，分离结束后得到杀线虫生物活性物质提取物；

步骤（4）土壤改良剂的制备

高岭土、腐叶堆肥、碳酸钙、杀线虫生物活性物质提取物按照一定比例混合在一起，并将原料混合搅拌，使其充分混合；加入一定量的酸碱调节剂熟石灰调节pH至合适值，然后将混合物经过挤压造粒获得合适粒径的土壤改良剂。

作为优选，步骤（1）加拿大一枝黄花的粉碎包括取20~40g的加拿大一枝黄花，将其洗净，然后干燥2~3h，使用颚式破碎机破碎，破碎过程中加入一定惰性气体且将温度控制在30~50℃下，破碎后获得100~300目的加拿大一枝黄花粉末。

本发明在对加拿大一枝黄花的粉碎处理中，使用加入惰性气体为粉碎过程中的避免加拿大一枝黄花中杀线虫的有效成分被空气中的氧气氧化。破碎后控制粉末的粒度至合适范围，提到粉末的比表面，使得后续粉末与各溶剂进行充分接触，提高提取效率。

作为优选，步骤（2）超声协同酶法提取包括S21取8~15g破碎后的加拿大一枝黄花粉末与配制好的80~120mLβ-葡萄糖苷酶溶液充分混合，确保粉末均匀湿润；S22将混合后的溶液置于超声波处理设备中。设置频率500~800千赫兹、100~250W，进行超声处理0.5~1.5h；S23超声处理完成后，让混合物静置1~3h，使β-葡萄糖苷酶充分作用；S24在酶解反应完成后，加入1~3g酶抑制剂亮肽素，终止酶解反应，并将终止酶解后的混合物使用离心机进行离心分离，获得加拿大一枝黄花粗提取物。

本方法使用超声协同酶法进行提取加拿大一枝黄花中的有效成分，使用β-葡萄糖苷酶先一步酶解，充分破坏细胞壁，可以增加有效成分的溶出率，在辅以超声波处理进一步提高加拿大一枝黄花提取物的提取效果。本方法具有提取效率高，操作简单，可重复性好，结合酶解提取和超声提取法，不仅增加有效成分的溶出率，还能以超声波的能量促进内部细胞与周围溶剂之间的高质量传递，从而进一步提高提取效率。

作为优选，步骤（3）吸附柱色谱法分离包括将硅胶作为吸附剂与甲醇溶液混合，搅拌以除去空气泡，徐徐倾入色谱柱中，然后再加入100~200mL甲醇溶液，将附着于管壁的吸附剂洗下，使色谱柱表面平整；取20~30mL加拿大一枝黄花粗提取物溶于100~200mL甲醇溶剂中，与少量吸附剂混匀，再使溶剂挥发去尽后使呈松散状，分离结束后得到杀线虫生物活性物质提取物。

本方法创造性的对超声辅助酶法提取后的提取物，通过吸附柱色谱法进一步分离，利用吸附柱色谱的高分离能力、良好的选择性、广泛的应用范围、可靠性和重复性以及可逆性和再生性得到更高纯度提取物。而且根据加拿大一枝黄花中杀线虫的有效组分的性质，可以针对性的选择色谱柱和固定相，实现对特定成分的选择性分离。

作为优选，步骤（4）土壤改良剂的制备包括高岭土、腐叶堆肥、碳酸钙、杀线虫生物活性物质提取物按照(1~3):(1~3):(1~2):1混合在一起，并将原料混合搅拌，使其充分混合；加入2~5g的酸碱调节剂熟石灰调节pH至7~9，然后将混合物经过挤压造粒获得合适粒径的土壤改良剂。

本方法在制备土壤改良剂中出了加入了对杀线虫具有优异杀虫效果的加拿大一枝黄花杀线虫活性物质外，加入了高岭土，利用其具有良好的吸水性和离子交换能力，可以增加土壤的透气性和有机质，提高土壤的保水能力，改善土壤结构。加入的腐叶堆肥则富含有机质和微生物，可以增加土壤中的有机质含量，促进土壤微生物的活动，改善土壤环境，提高土壤的肥力和抗旱能力。

采用本发明，制备的土壤改良剂具有防止植物根结线虫的优异效果，而且还能够改善土壤的的透气性和有机质，改善土壤结构，提高土壤的抗旱能力和肥力，能有效降低土壤根结线虫虫口密度的优点，可广泛用于预防药用植物根结线虫病害领域。

附图说明

图1是一种防治药用植物根结线虫的土壤改良剂制备工艺流程图。

具体实施方式

实施例1

本发明提供一种防治药用植物根结线虫的土壤改良剂，包括以下步骤：

步骤（1）加拿大一枝黄花的粉碎

取20g新鲜的加拿大一枝黄花，将其洗净，然后干燥2h，使用颚式破碎机破碎，破碎过程中加入一定惰性气体且将温度控制在30℃下，破碎后获得100目的加拿大一枝黄花粉末；

步骤（2）超声协同酶法提取

S21取破碎后的8g加拿大一枝黄花粉末与配制好的80mLβ-葡萄糖苷酶溶液充分混合，确保粉末均匀湿润；

S22将混合后的溶液置于超声波处理设备中。设置频率500千赫兹、100W，进行超声处理0.5h；

S23超声处理完成后，让混合物静置1h，使β-葡萄糖苷酶充分作用；

S24在酶解反应完成后，加入1g的酶抑制剂亮肽素，终止酶解反应，并将终止酶解后的混合物使用离心机进行离心分离，获得加拿大一枝黄花粗提取物；

步骤（3）吸附柱色谱法分离

将硅胶作为吸附剂与甲醇溶液混合，搅拌以除去空气泡，徐徐倾入色谱柱中，然后再加入100mL甲醇溶液，将附着于管壁的吸附剂洗下，使色谱柱表面平整；取20mL加拿大一枝黄花粗提取物溶于100mL甲醇溶剂中，与少量吸附剂混匀，再使溶剂挥发去尽后使呈松散状，分离结束后得到杀线虫生物活性物质提取物；

步骤（4）土壤改良剂的制备

高岭土、腐叶堆肥、碳酸钙、杀线虫生物活性物质提取物1：1：1：1比例混合在一起，并将原料混合搅拌，使其充分混合；加入2g酸碱调节剂熟石灰调节pH至7，然后将混合物经过挤压造粒获得合适粒径的土壤改良剂。

实施例2

步骤（1）加拿大一枝黄花的粉碎

取24g新鲜的加拿大一枝黄花，将其洗净，然后干燥2.2h，使用颚式破碎机破碎，破碎过程中加入一定惰性气体且将温度控制在35℃下，破碎后获得150目的加拿大一枝黄花粉末；

步骤（2）超声协同酶法提取

S21取破碎后的10g加拿大一枝黄花粉末与配制好的90mLβ-葡萄糖苷酶溶液充分混合，确保粉末均匀湿润；

S22将混合后的溶液置于超声波处理设备中。设置频率550千赫兹、150W，进行超声处理0.8h；

S23超声处理完成后，让混合物静置1.5h，使β-葡萄糖苷酶充分作用；

S24在酶解反应完成后，加入1.5g的酶抑制剂亮肽素，终止酶解反应，并将终止酶解后的混合物使用离心机进行离心分离，获得加拿大一枝黄花粗提取物；

步骤（3）吸附柱色谱法分离

将硅胶作为吸附剂与甲醇溶液混合，搅拌以除去空气泡，徐徐倾入色谱柱中，然后再加入120mL甲醇溶液，将附着于管壁的吸附剂洗下，使色谱柱表面平整；取22mL加拿大一枝黄花粗提取物溶于120mL甲醇溶剂中，与少量吸附剂混匀，再使溶剂挥发去尽后使呈松散状，分离结束后得到杀线虫生物活性物质提取物；

步骤（4）土壤改良剂的制备

高岭土、腐叶堆肥、碳酸钙、杀线虫生物活性物质提取物2：2：1：1比例混合在一起，并将原料混合搅拌，使其充分混合；加入3g酸碱调节剂熟石灰调节pH至7，然后将混合物经过挤压造粒获得合适粒径的土壤改良剂。

实施例3

步骤（1）加拿大一枝黄花的粉碎

取30g新鲜的加拿大一枝黄花，将其洗净，然后干燥2.5h，使用颚式破碎机破碎，破碎过程中加入一定惰性气体且将温度控制在40℃下，破碎后获得200目的加拿大一枝黄花粉末；

步骤（2）超声协同酶法提取

S21取破碎后的13g加拿大一枝黄花粉末与配制好的100mLβ-葡萄糖苷酶溶液充分混合，确保粉末均匀湿润；

S22将混合后的溶液置于超声波处理设备中。设置频率600千赫兹、200W，进行超声处理1h；

S23超声处理完成后，让混合物静置2h，使β-葡萄糖苷酶充分作用；

S24在酶解反应完成后，加入2.0g的酶抑制剂亮肽素，终止酶解反应，并将终止酶解后的混合物使用离心机进行离心分离，获得加拿大一枝黄花粗提取物；

步骤（3）吸附柱色谱法分离

将硅胶作为吸附剂与甲醇溶液混合，搅拌以除去空气泡，徐徐倾入色谱柱中，然后再加入150mL甲醇溶液，将附着于管壁的吸附剂洗下，使色谱柱表面平整；取25mL加拿大一枝黄花粗提取物溶于150mL甲醇溶剂中，与少量吸附剂混匀，再使溶剂挥发去尽后使呈松散状，分离结束后得到杀线虫生物活性物质提取物；

步骤（4）土壤改良剂的制备

高岭土、腐叶堆肥、碳酸钙、杀线虫生物活性物质提取物2：2：2：1比例混合在一起，并将原料混合搅拌，使其充分混合；加入4g酸碱调节剂熟石灰调节pH至7.5，然后将混合物经过挤压造粒获得合适粒径的土壤改良剂。

实施例4

步骤（1）加拿大一枝黄花的粉碎

取40g新鲜的加拿大一枝黄花，将其洗净，然后干燥3.0h，使用颚式破碎机破碎，破碎过程中加入一定惰性气体且将温度控制在50℃下，破碎后获得300目的加拿大一枝黄花粉末；

步骤（2）超声协同酶法提取

S21取破碎后的15g加拿大一枝黄花粉末与配制好的120mLβ-葡萄糖苷酶溶液充分混合，确保粉末均匀湿润；

S22将混合后的溶液置于超声波处理设备中。设置频率800千赫兹、250W，进行超声处理1.5h；

S23超声处理完成后，让混合物静置3h，使β-葡萄糖苷酶充分作用；

S24在酶解反应完成后，加入3.0g的酶抑制剂亮肽素，终止酶解反应，并将终止酶解后的混合物使用离心机进行离心分离，获得加拿大一枝黄花粗提取物；

步骤（3）吸附柱色谱法分离

将硅胶作为吸附剂与甲醇溶液混合，搅拌以除去空气泡，徐徐倾入色谱柱中，然后再加入180mL甲醇溶液，将附着于管壁的吸附剂洗下，使色谱柱表面平整；取30mL加拿大一枝黄花粗提取物溶于180mL甲醇溶剂中，与少量吸附剂混匀，再使溶剂挥发去尽后使呈松散状，分离结束后得到杀线虫生物活性物质提取物；

步骤（4）土壤改良剂的制备

高岭土、腐叶堆肥、碳酸钙、杀线虫生物活性物质提取物3：2：2：1比例混合在一起，并将原料混合搅拌，使其充分混合；加入4g酸碱调节剂熟石灰调节pH至7.5，然后将混合物经过挤压造粒获得合适粒径的土壤改良剂。

对比例1

步骤（1）加拿大一枝黄花的粉碎

取20g新鲜的加拿大一枝黄花，将其洗净，然后干燥2h，使用颚式破碎机破碎，破碎过程中加入一定惰性气体且将温度控制在30℃下，破碎后获得100目的加拿大一枝黄花粉末；

步骤（2）超声协同酶法提取

（1）取破碎后的8g加拿大一枝黄花粉末与配制好的80mL果胶酶溶液充分混合，确保粉末均匀湿润；

（2）将混合后的溶液置于超声波处理设备中。设置频率500千赫兹、100W，进行超声处理0.5h；

（3）超声处理完成后，让混合物静置1h，使果胶酶充分作用；

（4）在酶解反应完成后，加入1g的酶抑制胰蛋白酶抑制剂，终止酶解反应，并将终止酶解后的混合物使用离心机进行离心分离，获得加拿大一枝黄花粗提取物；

步骤（3）吸附柱色谱法分离

将氧化铝作为吸附剂与丙酮溶液混合，搅拌以除去空气泡，徐徐倾入色谱柱中，然后再加入100mL丙酮溶液，将附着于管壁的吸附剂洗下，使色谱柱表面平整；取20mL加拿大一枝黄花粗提取物溶于100mL丙酮溶剂中，与少量吸附剂混匀，再使溶剂挥发去尽后使呈松散状，分离结束后得到杀线虫生物活性物质提取物；

步骤（4）土壤改良剂的制备

高岭土、腐叶堆肥、蒙脱石、杀线虫生物活性物质提取物1：1：1：1比例混合在一起，并将原料混合搅拌，使其充分混合；加入2g酸碱调节剂熟石灰调节pH至7，然后将混合物经过挤压造粒获得合适粒径的土壤改良剂。

对比例2

步骤（1）加拿大一枝黄花的粉碎

取40g新鲜的加拿大一枝黄花，将其洗净，然后干燥3h，使用颚式破碎机破碎，破碎过程中加入一定惰性气体且将温度控制在45℃下，破碎后获得200目的加拿大一枝黄花粉末；

步骤（2）超声协同酶法提取

（1）取破碎后的8g加拿大一枝黄花粉末与配制好的100mL果胶酶溶液充分混合，确保粉末均匀湿润；

（2）将混合后的溶液置于超声波处理设备中。设置频率700千赫兹、200W，进行超声处理1.0h；

（3）超声处理完成后，让混合物静置2h，使果胶酶充分作用；

（4）在酶解反应完成后，加入2g的酶抑制胰蛋白酶抑制剂，终止酶解反应，并将终止酶解后的混合物使用离心机进行离心分离，获得加拿大一枝黄花粗提取物；

步骤（3）吸附柱色谱法分离

将氧化铝作为吸附剂与丙酮溶液混合，搅拌以除去空气泡，徐徐倾入色谱柱中，然后再加入180mL丙酮溶液，将附着于管壁的吸附剂洗下，使色谱柱表面平整；取30mL加拿大一枝黄花粗提取物溶于180mL丙酮溶剂中，与少量吸附剂混匀，再使溶剂挥发去尽后使呈松散状，分离结束后得到杀线虫生物活性物质提取物；

步骤（4）土壤改良剂的制备

高岭土、腐叶堆肥、蒙脱石、杀线虫生物活性物质提取物3：2：2：1比例混合在一起，并将原料混合搅拌，使其充分混合；加入2g酸碱调节剂熟石灰调节pH至7.5，然后将混合物经过挤压造粒获得合适粒径的土壤改良剂。

将实施例1-4和对比例1和2制备的防治药用植物根结线虫的土壤改良剂分别进行检测，具体检测方法如下：

密度测试

根据ISO2811-1标准，使用TG22-10ML型比重瓶，利用比重瓶法测量土壤改良剂在比重瓶中的质量和体积，从而计算出其密度，多次测量取平均值。

根结线虫防治测试

准备多个等体积的盆栽，确保每个盆栽都有良好的排水性，将实施例1-4和对比例1和2制备的土壤改良剂分别按照相同的比例与土壤混合均匀，然后装入盆栽中，另外设置不加土壤改良剂的对照组，定期观察植物生长情况，记录是否有根结线虫感染状况，并与实验组参照对照组计算相应的根结线虫感染率。

由表1可得，对比例1和2制备的土壤改良剂的密度均远大于实施例1-4，由于对比例制备过程中使用粘结性更好的蒙脱石作为土壤改良剂的主要成分之一，使得制备的密度稍大，而较大密度的土壤改良剂会更难以在土壤中分散均匀，从而降低其防治效果。而实施例1~4制备的土壤改良剂均在适宜范围内，使用过程中更容易被土壤颗粒吸附，其防治效果也会更好。

由表2可得实施例1-4和对比例1和2的根结线虫感染率都较低均低于正常植物感染率的20%，而且实施例所制备防治根结线虫感染率更低防治效果更好。实施例在提取有效组分过程中使用效果更好的β-葡萄糖苷酶进行酶解，使得有效组分的粗提取率更高，制备的土壤改良剂的效果更好。且吸附柱色谱法分离过程中也使用了与加拿大一枝黄花所富含的杀线虫有效组分特异性相容更好的甲醇溶液作为溶剂相，进一步提高了提纯效果，增强了土壤改良剂的防治根结线虫的效果。

本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。