葡萄糖脱氢酶突变体及其用途

技术领域

本发明涉及功能酶改造技术领域，具体涉及一种来源于油橄榄芽孢杆菌(Bacillus oleivorans)的葡萄糖脱氢酶突变体、其编码核酸分子、重组载体、重组细胞，辅酶循环再生催化系统及其制备方法以及在催化制备(R)-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯中的用途。

背景技术

L-左旋肉碱是一种非常重要的手性活性物质，在人体中主要负责将长链脂肪酸从线粒体外膜运输到线粒体内膜上进行脂肪β氧化，正常人的体内合成可基本满足身体需要，但婴幼儿欠缺自身合成的能力，且运动、健身的人群对添加有L-左旋肉碱的产品也有较大需求，由此产生了L-左旋肉碱的市场需求。

由(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯为原料经化学法制备L-左旋肉碱是一种非常有效的手段。(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯本身是一种非常有价值且重要的手性化合物，通常以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物，经手性催化剂催化制备，而选择以生物催化剂如酮还原酶、醇脱氢酶等作为手性催化剂催化制备，由于选择的大肠杆菌表达宿主自身携带的辅酶再生系统不够完善，由代谢产生的辅酶量满足不了反应需求，因此需要额外添加还原型辅酶NADH/NADPH作为电子传递供体。但是，辅酶NADH/NADPH的价格较高，直接在酶催化反应体系中添加会大大增加工业制备成本。所以，设计、构建一套可有效实现辅酶循环再生的酶催化反应系统、高效催化4-氯乙酰乙酸乙酯转化为(R)-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯将是非常有意义的。

发明内容

本发明目的在于提供一种来源于油橄榄芽孢杆菌(Bacillus oleivorans)的葡萄糖脱氢酶突变体以及构建一套辅酶循环再生催化系统，旨在使葡萄糖脱氢酶突变体与酮还原酶相匹配，在无需额外添加NADH的情况下高效催化生成(R)-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯。

为了实现上述发明目的，本发明从油橄榄芽孢杆菌(Bacillus oleivorans)中获得葡萄糖脱氢酶，并进一步对其进行突变处理，得到在转化率、反应速度得到显著改善的葡萄糖脱氢酶突变体。

具体地，第一方面，本发明提供了一种葡萄糖脱氢酶突变体，其氨基酸序列如SEQID NO:1所示。

第二方面，本发明提供了编码所述葡萄糖脱氢酶突变体的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

第三方面，本发明提供了一种重组载体，其包含编码所述葡萄糖脱氢酶突变体的核酸分子。

第四方面，本发明提供了一种重组细胞，其包含本发明所述的重组载体。

第五方面，本发明提供了一种辅酶循环再生催化系统，其包含本发明所述的重组细胞，所述重组细胞包含重组共表达载体，所述重组共表达载体包含权利要求2所述的核酸分子以及编码酮还原酶的如SEQ ID NO:3所示的核酸分子。

第六方面，本发明提供了一种辅酶循环再生催化系统的制备方法，包括：

对本发明提供的所述重组细胞进行诱导培养，得到培养物；

以及可选地从所述培养物中分离所述本发明所述的葡萄糖脱氢酶突变体和酮还原酶的步骤；

其中，所述酮还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

第七方面，本发明提供了本发明所述葡萄糖脱氢酶突变体、所述核酸分子、所述重组载体、所述重组细胞、所述辅酶循环再生催化系统和/或所述制备方法制备得到的辅酶循环再生催化系统在催化制备(R)-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯中的用途。

第八方面，本发明提供了一种(R)-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯的制备方法，包括：

以本发明所述重组细胞、所述辅酶循环再生催化系统和/或所述制备方法制备得到的所述辅酶循环再生催化系统作为催化剂，对4-氯乙酰乙酸乙酯进行催化反应，得到(R)-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯。

本发明首次提供了一种来源于油橄榄芽孢杆菌(Bacillus oleivorans)的葡萄糖脱氢酶突变体，与突变前的葡萄糖脱氢酶相比，该突变体在转化率、反应速度得到显著改善。同时，本发明基于该葡萄糖脱氢酶突变体还构建了辅酶循环再生催化系统，该催化系统通过将葡萄糖脱氢酶突变体和酮还原酶进行组合，使两步酶催化反应速度更加匹配，从而进一步提高组合酶的催化活力和底物转化率，有利于高效生产(R)-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯。

附图说明

图1为葡萄糖脱氢酶和酮还原酶催化合成(R)-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯的反应图；

图2为4-氯乙酰乙酸乙酯标准品的气相色谱图；

图3为(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯标准品的气相色谱图；

图4为本发明实施例5的反应过程的气相色谱图。

具体实施方式

本发明实施例提供的葡萄糖脱氢酶突变体是通过对葡萄糖脱氢酶进行改造得到。具体地，本发明实施例通过基因挖掘手段，发现来源于Bacillus oleivorans菌株的葡萄糖脱氢酶，其具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，以及如SEQ ID NO:5所示的编码核酸序列。同时，发明人发现该葡萄糖脱氢酶有进一步改造提高的潜力。因此，本发明实施例通过采用半理性设计方法对其进行改造，首先采用易错PCR技术对其进行突变处理，获得96个突变蛋白质分子库，经过高通量筛选后，发现葡萄糖脱氢酶的活性改造热点可能在(G727C(D243H)、C1231G(P411A)。随后在其氨基酸序列243、411位点处分别设计并进行定点饱和突变，经筛选获得2个较好的阳性突变体(D243E、P411R)。随后将单一位点突变和组合位点突变，与酮还原酶共转化后进行酶催化反应筛选，获得在整体催化效果包括转化率、反应速度得到显著改善的最优葡萄糖脱氢酶突变体D243E，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

来源于油橄榄芽孢杆菌(Bacillus oleivorans)的葡萄糖脱氢酶突变体的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)：

MLHIPEKLLVREFIWCEVNNRFYKHLYQYADDRAEGPINVLLKAQSEQTNMILYLMNLFSISKPAFDEEEVRYMDEPHSLITEVIEREKELTLIYESYPYFLANFPNLSPLIHRLRYLQHEKLNELNKLKSQFQKFNHLETNERIDRDYWLEEGYELEKIASGFTFPTSIAFDDEGELFVGESGYSYGPAYAKARILNIRKDGQIQEIASGFEGPLTGIAWYKGYFYVITGGFDGKVYRVSK

相应地，编码所述葡萄糖脱氢酶突变体的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

编码来源于油橄榄芽孢杆菌(Bacillus oleivorans)的葡萄糖脱氢酶突变体的核苷酸序列(SEQ ID NO:2)：

atgttgcacatacctgaaaaattactggtgagggagtttatttggtgtgaagtaaataatcgattttacaagcatttatatcaatatgcggatgatcgtgctgaaggtccaatcaatgtcttgttgaaagctcaatcggagcaaaccaacatgattctttatttaatgaatttgttttcgatatcaaagcctgctttcgatgaggaagaagtaagatatatggatgagccccattcgttgattaccgaagtaatagaaagggaaaaagagctgacattaatctatgaatcttatccgtattttttagctaatttccccaacctttctccgcttattcaccgcttacgttatcttcaacacgaaaagttgaatgagttaaataagttaaaatctcaatttcaaaagtttaatcatttggagactaatgaaagaatcgatagggattattggctggaagaggggtatgagttagaaaaaatagcttcaggctttacgtttccaacaagtatagcctttgatgatgagggtgaactatttgttggagagtcgggatattcctatgggcccgcctatgcaaaagccaggattctaaacatcaggaaagatgggcagatccaagaaattgcttcaggttttgaaggaccactgaccggaattgcatggtataaaggatacttttatgtgattacaggaggttttgatggaaaggtatatcgagtaagcaaa

来源于油橄榄芽孢杆菌(Bacillus oleivorans)的葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)：

MLHIPEKLLVREFIWCEVNNRFYKHLYQYADDRAEGPINVLLKAQSEQTNMILYLMNLFSISKPAFDEEEVRYMDEPHSLITEVIEREKELTLIYESYPYFLANFPNLSPLIHRLRYLQHEKLNELNKLKSQFQKFNHLETNERIDRDYWLEEGYELEKIASGFTFPTSIAFDDEGELFVGESGYSYGPAYAKARILNIRKDGQIQEIASGFEGPLTGIAWYKGYFYVITGGFDGKVYRVSK

编码来源于油橄榄芽孢杆菌(Bacillus oleivorans)的葡萄糖脱氢酶的核苷酸序列(SEQ ID NO:6)：

atgttgcacatacctgaaaaattactggtgagggagtttatttggtgtgaagtaaataatcgattttacaagcatttatatcaatatgcggatgatcgtgctgaaggtccaatcaatgtcttgttgaaagctcaatcggagcaaaccaacatgattctttatttaatgaatttgttttcgatatcaaagcctgctttcgatgaggaagaagtaagatatatggatgagccccattcgttgattaccgaagtaatagaaagggaaaaagagctgacattaatctatgaatcttatccgtattttttagctaatttccccaacctttctccgcttattcaccgcttacgttatcttcaacacgaaaagttgaatgagttaaataagttaaaatctcaatttcaaaagtttaatcatttggagactaatgaaagaatcgatagggattattggctggaagaggggtatgagttagaaaaaatagcttcaggctttacgtttccaacaagtatagcctttgatgatgagggtgaactatttgttggagagtcgggatattcctatgggcccgcctatgcaaaagccaggattctaaacatcaggaaagatgggcagatccaagaaattgcttcaggttttgaaggaccactgaccggaattgcatggtataaaggatacttttatgtgattacaggaggttttgatggaaaggtatatcgagtaagcaaa

本发明实施例提供的所述葡萄糖脱氢酶突变体可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到，例如使用重组技术从原核宿主(例如大肠杆菌)或真核宿主(例如酵母、高等植物)中表达获得。

在一些实施方案中，上述葡萄糖脱氢酶突变体是通过将含有其编码基因的重组载体导入表达宿主(例如E.coli BL21(DE3))中得到重组基因工程菌，然后将该重组基因工程菌进行诱导表达得到葡萄糖脱氢酶突变体。

本发明实施例提供的所述葡萄糖脱氢酶突变体的核酸分子通常可以通过PCR扩增或人工合成的方法获得。

本发明实施例还提供了一种重组载体，其包括编码所述葡萄糖脱氢酶突变体的核酸分子。具体地，所述重组载体包括克隆载体和表达载体，所述克隆载体用于复制相关序列，所述表达载体用于表达相关基因。

在一些实施方案中，所述重组载体还包含编码酮还原酶(来源于Lachnellulahyalina)的如SEQ ID NO:3所示的核酸分子，用于共表达葡萄糖脱氢酶突变体和酮还原酶。

编码酮还原酶的核酸分子的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)：atgaaggtctttctgagcggaggaagtggcttcatcgccgcccacgtcctcgacatcctactcgagcatggccatactgtcatcacctcggttcgttcccaagagaaagccaacaagatcacagaggcgcaccccaacacgcctgcctcccagctcgagttccggattgtcaaagacatagcacaggagggggcctttgacgaagccatcaagattgacggcctggaagcggtgattcacacagcctcgcctttccatttcaacgtcacagatgtcaagaaagacttgcttgaccctgccataatcggcacaacaggtatcctgaaagccatcaagaagaatgctcccagcgtgaagagagtcgtcatcacgagttcctttgccaacatcgtcaatccaagtaagggaaactcctggaccgagcacacgtacagcgaggaggactggaaccccatcacggaagaagaggcggtgctgaaccccagcaatggatacagagccagcaagacgttcgccgagaaagctgcgtgggagtttgccgagaaggagaaaccaaactttacgttgagcactatgtgccctcctttagttataggtccaattgtccactacctcaacagcctcgatagcctcaacacctctaaccagcgaaccgccaacctcatgaccggcaagaacaagtctgaaatccccgacaccggtacctacatctggatcgatgtgcgagatctcgccctcgcccacgtcaaagccatcgagctcccagaagccgcgaacaagcgattcttcatcaccgctggttacttctccaaccaggagatcgctgagattatccgcaagaacttccccgcgctcgaaaaggaattgccggcgaaggacgtcaagggtggagattacccgaaagagggattatataaggagtga

相应地，编码酮还原酶的核酸分子所编码的酮还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

来源于Lachnellula hyalina的酮还原酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)：MKVFLSGGSGFIAAHVLDILLEHGHTVITSVRSQEKANKITEAHPNTPASQLEFRIVKDIAQEGAFDEAIKIDGLEAVIHTASPFHFNVTDVKKDLLDPAIIGTTGILKAIKKNAPSVKRVVITSSFANIVNPSKGNSWTEHTYSEEDWNPITEEEAVLNPSNGYRASKTFAEKAAWEFAEKEKPNFTLSTMCPPLVIGPIVHYLNSLDSLNTSNQRTANLMTGKNKSEIPDTGTYIWIDVRDLALAHVKAIELPEAANKRFFITAGYFSNQEIAEIIRKNFPALEKELPAKDVKGGDYPKEGLYKE

本发明实施例所述葡萄糖脱氢酶突变体和所述酮还原酶可以分别克隆至表达载体中，然后分别转化至表达宿主中进行表达。在一些实施方案中，所述表达载体为pET-28a(+)。

在一些实施方案中，所述重组载体为pACYCDuet-1-TE-GE或pACYCDuet-1-TE-GEM，分别是将编码上述酮还原酶和葡萄糖脱氢酶突变体的核酸分子分别替换pACYCDuet-1的Ned1和Xho 1&EcoRI和HindIII酶切位点间序列，其余序列保持不变得到的。

在一些实施方案中，所述重组载体为克隆有所述葡萄糖脱氢酶突变体和所述酮还原酶的编码核酸分子的重组共表达载体。

相应地，本发明实施例还提供了一种重组细胞，其包含上述的重组载体。

在一些实施方案中，所述重组细胞是将所述重组共表达载体转化到表达宿主得到。

在一些实施方案中，所述重组细胞为原核生物生物细胞或真核生物细胞，例如大肠杆菌、酵母等，优选大肠杆菌表达宿主E.coli BL21(DE3)。

更具体地，所述重组细胞的构建方法包含如下步骤：

(i)葡萄糖脱氢酶阳性突变体基因的筛选获得；

(ii)重组共表达表达载体的构建；

(iii)重组共表达载体转化进入宿主菌株；

(iv)平板抗性培养基筛选得到阳性克隆菌株。

相应地，本发明实施例还提供了一种生物催化剂，其包含本发明所述葡萄糖脱氢酶突变体和所述酮还原酶。

本发明实施例还提供了一种辅酶循环再生催化系统，其包含本发明所述的重组细胞，所述重组细胞包含所述重组共表达载体。

本发明实施例所提供的辅酶循环再生催化系统，可以不需额外添加NADH即可催化4-氯乙酰乙酸乙酯生成(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。同时，该系统通过将经改造的葡萄糖脱氢酶突变体与酮还原酶组合，与原始葡萄糖脱氢酶与酮还原酶组合的体系相比，由于所述辅酶循环再生催化系统中两步酶催化反应速度相对更加匹配，使得在组合酶催化活力及底物转化率上得到进一步提高。

本发明提供的辅酶循环再生催化系统，可以是分别将本发明所述的葡萄糖脱氢酶突变体和酮还原酶进行纯化后，按照比例混合得到。在一些实施方案中，所述辅酶循环再生催化系统为全细胞辅酶循环再生系统，其比游离酶具有更低的成本优势和较好的酶稳定性保持。进一步地，由于催化反应体系涉及酶添加比例、固定化等条件的优化，优选使用含有所述重组共表达表达载体的单一表达菌株(重组细胞)，使葡萄糖脱氢酶突变体与酮还原酶的催化反应速度更加匹配，比双菌株耦合反应传质效果更优越。

相应地，本发明实施例提供了一种辅酶循环再生催化系统的制备方法，其包括：对本发明所述的重组细胞进行诱导培养，得到培养物的步骤；以及可选地从所述培养物中分离本发明所述的葡萄糖脱氢酶突变体和酮还原酶的步骤；

其中，所述酮还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

具体地，所述重组细胞包含重组共表达载体，所述重组共表达载体包含权利要求2所述的核酸分子以及编码酮还原酶的如SEQ ID NO:3所示的核酸分子。

本发明实施例对所述诱导培养时的培养方法和培养条件没有特殊要求，保证重组细胞正常生长即可。在一些实施方案中，所使用的的培养基是本领域内可表达蛋白质的培养基，优选TB培养基。

在一些实施方案中，所述诱导培养是在18℃条件下，使用终浓度为0.5mM的IPTG诱导表达。

从培养物中分离葡萄糖脱氢酶突变体和酮还原酶的方法可以是本领域的常规方法。

本发明实施例提供的辅酶循环再生催化系统，既可以将所述重组细胞诱导培养后，按照本领域常规方法对重组细胞进行冻干处理以获得菌体冻干粉，之后将该菌体冻干粉与底物进行催化反应，还可以将所述重组细胞诱导培养之后，对其培养表达所得的酶进行分离后用于催化反应。

本发明实施例还提供了本发明所述葡萄糖脱氢酶突变体、所述核酸分子、所述重组载体、所述重组细胞、所述辅酶循环再生催化系统和/或所述制备方法制备得到的辅酶循环再生催化系统在催化制备(R)-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯中的用途。

相应地，本发明实施例还提供了一种(R)-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯的制备方法，包括：

以本发明所述重组细胞、所述辅酶NADH循环再生催化系统和/或所述制备方法制备得到的所述辅酶循环再生催化系统作为催化剂，对4-氯乙酰乙酸乙酯进行催化反应，得到(R)-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯。

本发明实施例提供的制备方法可以可以高效催化4-氯乙酰乙酸乙酯转化为(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，24h转化率为84.7％，是原始葡萄糖脱氢酶(野生型)所构建的辅酶循环再生系统转化率(52.3％)的1.619倍。

应当理解的是，本发明实施例提供的所述葡萄糖脱氢酶突变体和酮还原酶可以以工程菌全细胞形式使用，也可以是未经纯化的粗酶形式使用，也可以是部分纯化的或完全纯化的酶的形式使用；还可以利用本领域已知的固定化技术将本发明所述葡萄糖脱氢酶突变体和酮还原酶制成固定化酶或固定化细胞形式的催化剂。

在一些实施方案中，所述4-氯乙酰乙酸乙酯的浓度为0.2-0.6M，优选0.45M。

在一些实施方案中，将所述重组细胞制成冻干粉，作为催化剂。制备冻干粉的方法可以是本领域的常规方法，例如将诱导完成的重组细胞(菌体)离心收集、洗涤后，于-20℃过夜冻存。运行真空冷冻干燥机，-20℃、真空度15Pa进行冷冻干燥，得到菌体冻干粉。在一些具体实施方案中，所述菌体冻干粉与所述4-氯乙酰乙酸乙酯的质量比为(0.1-0.2):1，优选0.15:1。

作为本领域已知的催化反应，可以理解的是，在催化制备(R)-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯过程中例如可以加入葡萄糖和NAD+等。在一些实施方案中，所述葡萄糖的浓度与所述4-氯乙酰乙酸乙酯的浓度相等；所述NAD+的浓度为0.01-0.05mM，优选0.03mM。

在一些实施方案中，所述催化反应的反应温度为25-40℃，优选35℃；初始pH为6.0-7.5，优选7.0，可以使用Tris或盐酸(例如500mM的Tris和1M的盐酸)进行调节；反应时间为24-36h，优选24h。

为使本发明上述实施细节和操作能清楚地被本领域技术人员理解，以及本发明实施例葡萄糖脱氢酶突变体及其用途的进步性能显著地体现，以下通过实施例来举例说明上述技术方案。

下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照分子生物学领域常规的实验方法进行，包括但不限于M.R.格林所著《分子克隆实验指南》[Molecular Cloning:ALaboratory Manual]、Robert·F·Weaver所著《分子生物学》[Molecular Biology]等所述的实验方法，或按照试剂盒及仪器设备厂商所建议的实验方法。实施例中使用的试剂和生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。

油橄榄芽孢杆菌(Bacillus oleivorans)在文献Sasikala,et al."Bacillusoleivorans sp nov.a diesel oil-degrading and solvent-tolerant bacterium."International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 65.Pt.4(2015):1310-1315.中已公开，公众可从万华化学集团股份有限公司获得。

实施例1：葡萄糖脱氢酶的基因挖掘

(11)提取油橄榄芽孢杆菌(Bacillus oleivorans)的基因组DNA；

(12)以步骤(11)获得的基因组DNA为模板，以引物1(ggatccgaattcatgttgcacat，SEQ ID NO:7)和引物2(aagcttctatttccgtttaactcgcc，SEQ ID NO:8)为引物对进行PCR，获得含有野生型葡萄糖脱氢酶基因的PCR扩增片段。其中，该葡萄糖脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，其编码的葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。

实施例2：利用易错PCR技术获得随机葡萄糖脱氢酶的突变体

以实施例1的PCR扩增片段为模板，以引物1和引物2为引物按照如下反应体系进行易错PCR，获得葡萄糖脱氢酶基因96个突变体。

易错PCR反应体系：10×扩增缓冲液5μl，4种dNTP混合物4μl(2.5mM)，引物各1.5μl，模板DNA1.5μl，Taq DNA聚合酶1μL，Mn

PCR反应程序：(1)预变性：94℃、3min；(2)变性：94℃、30s；退火：58℃、30s；延伸：72℃、1.5min，30个循环；(3)后延伸：72℃、10min；(4)4℃保温。

实施例3：高通量筛选得到葡萄糖脱氢酶突变体并进行定点饱和突变

将实施例2中获得的葡萄糖脱氢酶基因PCR扩增片段，分别使用EcoRI和HindIII双酶切至pET-28a(+)载体上，各自得到重组表达质粒，测序无误后，将重组表达质粒分别通过热激法转入表达宿主E.coli BL21(DE3)中，将筛选得到的阳性克隆菌株在5ml TB培养基中进行培养8h后，加入终浓度0.5mM的IPTG于18℃低温诱导12h，离心500μL菌液并用1mL pH7.0PBS重悬，转移100μL至96孔板中，加入100μL葡萄糖脱氢酶反应预混液(0.5mM NAD+；20mM葡萄糖；pH 7.0PBS溶液)，37℃、120rpm孵育2h，置于340nm波长处扫描测定吸光度。

提取吸光度值较高反应液所对应的菌株(重组菌35、83)的质粒，并进行测序，得到编码葡萄糖脱氢酶的发生的突变位点：第243位的氨基酸D突变为H，第411位的氨基酸P突变为A。针对这两个位点氨基酸，分别设计将密码子使用NNK进行定点饱和突变，筛选方法如本实施例第一段所述，筛选得到2个具有较好催化效果的阳性突变体：第243位的氨基酸D突变为E，第411位的氨基酸P突变为R。

定点饱和突变全质粒PCR反应体系：DNA聚合酶混合液10μl，243位引物3为(aaggtatatcgagtaagcaaannkggaca，SEQ ID NO:9)、引物4为(cgctgattaatacctttttctgtccnnkttt，SEQ ID NO:10)；411位引物5为(agggggattgggacnnktta，SEQ ID NO:11)、引物6为(ctcgtataannkgtcccaatcccc，SEQ IDNO:12)，引物和模板各1μl，加双蒸水至20μl。

PCR反应程序：(1)预变性：96℃、3min(2)变性：96℃、30s；退火：58℃、30s；延伸：72℃、2.0min，循环30次；(3)延伸：72℃、5min；(4)4℃持续保温。

实施例4：最优组合酶——酮还原酶&葡萄糖脱氢酶突变体组合的筛选

分别使用Ned1&Xho I和EcoRI&HindIII双酶切位点，将酮还原酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，编码核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示)和2个葡萄糖脱氢酶突变体以及组合突变位点的基因片段分别连接至pACYCDuet-1共表达质粒载体上，得到3个重组共表达质粒。将测序无误的重组共表达质粒，通过热激转化法转入表达宿主E.coli BL21(DE3)中，挑取经氯霉素筛选得到的单克隆菌落，分别转接至100ml TB培养基中，37℃进行摇瓶培养8h，加入终浓度0.5mM的IPTG于18℃低温诱导12h，离心2ml菌液，并用PBS洗涤菌体，将洗涤好的菌体用1ml PBS重悬，加入1ml 35℃预热后的催化反应预混液(0.06mM NAD+；0.9M 4-氯乙酰乙酸乙酯；0.9M葡萄糖；pH 7.0PBS溶液)，反应24h后使用气相色谱测定转化率，确定葡萄糖脱氢酶最优的突变体为：D243E，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。相应地，该葡萄糖脱氢酶突变体D243E与上述酮还原酶即为最优组合酶。

实施例5：最优组合酶与野生组合酶产物生成的测定与对比

野生组合酶是实施例1所得原始葡萄糖脱氢酶与上述酮还原酶的组合。

按照实施例4的方法，分别构建最优组合酶和表达野生组合酶的重组共表达菌，将诱导完成的重组共表达菌分别离心收集、洗涤后，于-20℃过夜冻存。运行真空冷冻干燥机，-20℃、真空度15Pa进行冷冻干燥，得到菌体冻干粉。将菌体冻干粉分别加入到反应体系(0.0 3mM NAD+；0.45M 4-氯乙酰乙酸乙酯；0.45M葡萄糖；pH 7.0 PBS溶液)中，使菌体冻干粉与4-氯乙酰乙酸乙酯的质量比为0.15:1，分别进行催化反应。待反应结束后，取反应液离心上清400μL，加入800μL乙酸乙酯后混合均匀，过膜后用于气相色谱分析转化率，使用安捷伦DB-5毛细管柱，载气为氮气，使用氢离子检测器，进样口温度为250℃，检测器温度为250℃，柱温箱温度为90℃，进样量为1μL，柱流速为1mL/min。

如图2和图3所示，4-氯乙酰乙酸乙酯标准品的出峰时间为6.61min，(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯标准品的出峰时间为7.12min；如图4所示，本实施例反应过程的气相谱图中反应产物的出峰时间与图3相同，说明反应产物为(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。

结果表明，突变发生在第243(D-E)的葡萄糖脱氢酶突变体经与酮还原酶共表达后构建的最优组合酶具有更好的转化率：24h转化率为84.7％，是野生组合酶构建的辅酶循环再生系统转化率(52.3％)的1.619倍。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。