一种精准鉴定苦瓜枯萎病抗性的方法

技术领域

本发明涉及农作物种植技术领域，尤其涉及一种精准鉴定苦瓜枯萎病抗性的方法。

背景技术

苦瓜是葫芦科苦瓜属植物，是重要的食药同源蔬菜作物，亦是海南省冬种北运的主要蔬菜作物，占据着冬季蔬菜市场的重要份额。苦瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌苦瓜专化型引起的一种严重危害苦瓜产量和品质的土传病害，在任何生育期均能侵染并造成危害，严重时可引起整株萎蔫死亡。随着复种指数的逐年增加，苦瓜枯萎病日益加剧，严重制约着苦瓜产业的健康发展。苦瓜枯萎病菌在土壤中的存活力和致病力较强，难防难治，选育抗病品种是最经济有效的方法，而高效精准的鉴定评价技术体系是抗病品种选育的重要基础。近年来有关瓜类作物枯萎病抗性鉴定评价的研究多集中在黄瓜和西瓜等，关于苦瓜枯萎病抗性鉴定技术鲜有报道，仍未形成完善的精准的高效的鉴定评价技术体系。尖孢镰刀菌常用的接种方法有灌根法、胚根法、伤根法、蘸根法、浸根法等。种质来源、环境条件、接种方法、接种浓度、鉴定时间等均能影响苦瓜枯萎病的抗性鉴定，因此，制定简单、高效、统一的鉴定评价方法是解决这一问题的重要手段。

发明内容

鉴于此，本发明提出一种精准鉴定苦瓜枯萎病抗性的方法，能构建最精准最高效的枯萎病抗性鉴定评价技术体系。

本发明的技术方案是这样实现的：

本发明提出一种精准鉴定苦瓜枯萎病抗性的方法，包括如下步骤：

将露白的苦瓜种子播种于装满灭菌基质的营养钵，保证基质湿润，待苦瓜幼苗生长至两叶一心时采用灌根法在距根际1±0.2cm处用注射器注入20±1mL枯萎病菌菌液；通过计算病情指数，记录抗病等级，分析根系形态及生理指标，精准鉴定出苦瓜枯萎病抗性。

进一步说明，所述枯萎病菌菌液接种菌液浓度为1×10

进一步说明，所述枯萎病菌菌液接种菌液浓度为1×10

进一步说明，所述生理指标包括苯丙氨酸解氨酶活性、多酚氧化酶活性、叶绿素和可溶性蛋白质含量中的一项或几项。

进一步说明，所述露白的苦瓜种子为：将苦瓜种子浸泡于温水中，用湿润的纱布包裹种子，放置于培养箱中培养，获得露白的苦瓜种子。

进一步说明，所述枯萎病菌菌液为：将尖孢镰刀菌接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，于培养箱中培养，取菌饼接种到马铃薯葡萄糖肉汤培养基中，振荡培养，过滤菌丝，得枯萎病菌菌液。

进一步说明，苦瓜种子的培养条件为：放置在28±2℃培养箱中催芽2-3d。

进一步说明，尖孢镰刀菌在培养箱中培养的条件为：于28±2℃培养箱中培养7-10d。

进一步说明，所述振荡培养的条件为：在26-28℃下、120r/min振荡培养7d。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明以中抗枯萎病品种热科2号苦瓜为试验材料，采用不同接种方法、不同菌液浓度、不同鉴定时间等方法研究苦瓜枯萎病的抗性生理，综合分析病情指数、根系形态及各项生理指标等，构建高效精准的鉴定评价技术体系，为提高苦瓜种质枯萎病鉴定评价效率和精准性、抗病品种选育提供理论和技术支撑。

(2)本发明以苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性、多酚氧化酶(PPO)活性、叶绿素和可溶性蛋白质含量作为判断植物抗病能力强弱的生理指标，苯丙氨酸解氨酶是植物体内合成酚类化合物的关键酶，多酚氧化酶是一种重要的抗氧化酶，叶绿素和可溶性蛋白是植物中的重要生理成分，都能客观反映植物抗病性的强弱。

(3)本发明采用灌根法接种苦瓜枯萎病菌，这种方法操作简便，可行性强，相对于其他方法来说，操作较为简便，能够节省时间和人力成本，在试验的过程中能够有效地减少接种过程中的人为因素影响及准确地控制接种的菌液浓度和时间，从而保证结果的准确性和可重复性，有利于精准的筛选出具有抗病性的苦瓜种质资源，为抗病品种育种和抗病资源鉴定评价提供理论依据和实践指导。

附图说明

图1是不同接种方法及不同菌液浓度的苦瓜叶片苯丙氨酸解氨酶活性对比分析数据图；

图2是不同接种方法及不同菌液浓度的苦瓜叶片多酚氧化酶活性对比分析数据图；

图3是不同接种方法及不同菌液浓度的苦瓜叶片叶绿素含量对比分析数据图；

图4是不同接种方法及不同菌液浓度的苦瓜叶片可溶性蛋白含量对比分析数据图；

图5是采用灌根法、胚根法接种不同浓度枯萎病菌菌液的苦瓜根系形态对比分析图。

具体实施方式

为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。

本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

一种精准鉴定苦瓜枯萎病抗性的方法，包括如下步骤：

(1)试验材料

苦瓜品种：热科2号，由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所自主选育；

供试病原菌：苦瓜枯萎病致病菌尖孢镰刀菌4501，由广西壮族自治区农业科学院蔬菜研究所陈振东研究员提供。

(2)浸种催芽

供试苦瓜种子浸泡于55℃温水中8h，用湿润的四层纱布包裹种子，放置在28±2℃培养箱中催芽2-3d，种子露白待用。

(3)枯萎病菌菌液的制备

将尖孢镰刀菌4501接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上于28±2℃培养箱中培养7-10d，用打孔器取直径7mm的菌饼接种到马铃薯葡萄糖肉汤培养基(PDB)中，26-28℃、120r/min振荡培养7d，用双层纱布过滤菌丝，母液待用。

(4)试验方法

为提高鉴定评价的精准度，所有试验均在人工培养室中进行，室内温度保持在28±1℃，湿度为80％，光照强度为2500lx。

将露白的苦瓜种子播种于装满灭菌基质的营养钵(7×7cm)置于塑料托盘中，每个托盘放21个营养钵，每隔两天在托盘中加入500mL水以保证基质湿润。待苦瓜幼苗生长至两叶一心时采用灌根法接种枯萎病菌，在距根际1±0.2cm处用注射器注入20±1mL菌液，菌液浓度分别为1×10

对比例1

一种精准鉴定苦瓜枯萎病抗性的方法，包括如下步骤：

(1)试验材料

苦瓜品种：热科2号，由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所自主选育；

供试病原菌：苦瓜枯萎病致病菌尖孢镰刀菌4501，由广西壮族自治区农业科学院蔬菜研究所陈振东研究员提供。

(2)浸种催芽

供试苦瓜种子浸泡于55℃温水中8h，用湿润的四层纱布包裹种子，放置在28±2℃培养箱中培养2-3d，种子露白待用。

(3)枯萎病菌菌液的制备

将尖孢镰刀菌4501接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上于28±2℃培养箱中培养7-10d，用打孔器取直径7mm的菌饼接种到马铃薯葡萄糖肉汤培养基(PDB)中，26-28℃、120r/min振荡培养7d，用双层纱布过滤菌丝，母液待用。

(4)试验方法

为提高鉴定评价的精准度，所有试验均在人工培养室中进行，室内温度保持在28±1℃，湿度为80％，光照强度为2500lx。

种子露白后待胚根长至1±0.2cm时采用胚根法接种枯萎病菌，将种子浸泡在菌液中1h，菌液浓度分别为1×10

对比例2

一种精准鉴定苦瓜枯萎病抗性的方法，包括如下步骤：

(1)试验材料

苦瓜品种：热科2号，由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所自主选育；

供试病原菌：苦瓜枯萎病致病菌尖孢镰刀菌4501，由广西壮族自治区农业科学院蔬菜研究所陈振东研究员提供。

(2)浸种催芽

供试苦瓜种子浸泡于55℃温水中8h，用湿润的四层纱布包裹种子，放置在28±2℃培养箱中培养2-3d，种子露白待用。

(3)枯萎病菌菌液的制备

将尖孢镰刀菌4501接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上于28±2℃培养箱中培养7-10d，用打孔器取直径7mm的菌饼接种到马铃薯葡萄糖肉汤培养基(PDB)中，26-28℃、120r/min振荡培养7d，用双层纱布过滤菌丝，母液待用。

(4)试验方法

为提高鉴定评价的精准度，所有试验均在人工培养室中进行，室内温度保持在28±1℃，湿度为80％，光照强度为2500lx。

将露白的苦瓜种子播种于装满灭菌基质的营养钵(7×7cm)置于塑料托盘中，每个托盘放21个营养钵，当幼苗长至两叶一心时采用伤根法接种枯萎病菌，将幼苗根部基质洗净，剪掉根的三分之一，在孢子悬浮液中浸泡30min，菌液浓度分别为1×10

实验结果

1)抗病分级标准

病情指数＝Σ(病株数×该级代表值)/(总株数×最高级代表值)×100％。

调查病情指数，植株被定为0-5级：

0级，无病症；

1级，子叶萎蔫或部分子叶与真叶轻微萎蔫；

2级，1片真叶萎蔫或子叶较重萎(≤60％)；

3级，子叶及部分真叶萎蔫(＞60％)；

4级，整株萎蔫，60％以上枯死，但心叶仍成活；

5级，整株枯死。

抗性分级：高抗(HR)：DI＜10；抗病(R)：10≤DI＜30；中抗(MR)：30≤DI＜50；感病(S)：50≤DI＜70；高感(HS)：DI≥70。

2)根系形态采用万深LA-S系列植物图像根系分析系统进行测定；PAL、PPO活性采用分光光度计法测定；叶绿素含量采用95％乙醇浸提，分别在475nm、649nm、665nm波长比色；可溶性蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝G-250方法；利用Excel进行数据整理和作图，SPSS26进行单因素方差分析和显著性检验，实验结果如表1-2及图1-5所示。

表1不同接种方法及不同菌液浓度对苦瓜苗期枯萎病的影响

注：同列不同小写字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)。

如表1所示，不同接种方法和菌液浓度对苦瓜枯萎病发病情况的影响不同。实施例1灌根法接种的苦瓜幼苗病情指数随着菌液浓度的增加而显著增加，且菌液浓度为1×10

如图1所示，实施例1灌根法接种后25d时，菌液浓度为1×10

如图2所示，实施例1灌根法接种后20d及25d各菌液浓度处理间PPO活性无显著差异。对比例1胚根法接种后20d菌液浓度为1×10

如图3所示，实施例1灌根法接种后20d，菌液浓度为1×10

如图4所示，实施例1灌根法25d时接菌浓度为1×10

表2不同接种方法及不同枯萎病菌菌液浓度接种25d的苦瓜根系形态分析

注：同列不同小写字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)。

如表2所示，实施例1灌根法接种枯萎病菌的苦瓜根系长度随菌液浓度增加呈下降趋势，表面积和体积无显著差异，菌液浓度为1×10

本发明经比较分析，认为适用于鉴定苦瓜枯萎病的接种方法依次为：灌根法、胚根法、伤根法。在三种不同接种方法中，灌根法接种枯萎病菌的优点是发病整齐且有规律性，易于鉴定植株枯萎病抗性等级；胚根法接种枯萎病菌可能由于在菌液浸种时胚根吸收的菌液不足以引起苦瓜植株发病，导致发病率低，且不同接菌浓度间病情指数无显著差别，不利于对苦瓜植株抗性进行分级；伤根法可能由于在接种菌液过程中进行了伤根处理导致根系损伤，使苦瓜植株受枯萎病菌的影响发病程度较重，从而导致病情指数过高且死苗过多，难以进行抗性分级，不利于筛选精准的鉴定评价体系。因此，本发明认为灌根法是最适用于接种苦瓜枯萎病菌进行抗病性鉴定的接种方法

综上所述，在苦瓜两叶一心时采用灌根法接种浓度为1×10

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。