一种重组大肠杆菌高效表达漆酶的方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种重组大肠杆菌高效表达漆酶的方法。

背景技术

复合多酚类物质是植物性饲料资源中广泛存在的一类抗营养因子，可通过与蛋白质、微量元素等形成络合物，降低养分的消化吸收；也可通过其有毒降解产物影响动物健康和种畜禽繁殖性能，降低畜产品品质等，导致其在工业饲料中的用量受限。漆酶(laccase)可以通过降解多酚类物质，改善植物性饲料资源的饲喂价值，提高植物性饲料资源在工业饲料中的用量，从而达到充分利用非常规饲料资源，降低饲料生产成本的目的。漆酶广泛存在于植物、动物、真菌和细菌中，能够催化氧化包括多酚类、芳胺类、羧酸类在内的250多种有机物发生氧化、聚合等反应，目前主要应用于染料脱色解毒、纸浆、纺织品漂白等领域。

本发明人在研究大肠杆菌的过程中，筛选出了一株野生大肠杆菌SDB2(保藏编号为CCTCC M 20221114)，经研究证实，该野生大肠杆菌SDB2能高效分泌漆酶，但因其安全性不明确、专一性差等缺陷，不利于漆酶的工业化生产，因此，对该细菌的漆酶基因进行安全高效的异源表达成为了当务之急。

近年来，在漆酶异源表达的研究中，相对于热稳定性差、需翻译修饰、生产周期长的真菌漆酶，高稳定性、无需糖基化修饰、生产周期短的细菌漆酶引起研究者的广泛关注。根据大肠杆菌SDB2漆酶基因，构建漆酶异源表达的基因工程菌株是实现漆酶工业化生产的有效途径。大肠杆菌BL21是最早开发的适用于原核蛋白表达的菌株，其表达的外源蛋白具有很高的稳定性，能维持目的蛋白原本的天然结构。本发明人筛选的菌株SDB2与BL21同属于大肠杆菌，因此SDB2漆酶基因选用BL21为宿主菌株能精准化实现SDB2漆酶蛋白的异源表达。但是，常规异源表达方式仍然面临产率低、产品质量不稳定等问题，想要实现高效、稳定表达，还需要对其它表达方式进行深入研究。

中国专利CN114032189A公开了一种降解木质素的融合子菌株R3，该发明是利用PEG诱导方法对亲本菌株X1、X19进行融合获得融合子菌株R3，R3通过分泌过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶等多种酶类来降解木质素，但该发明就单一个体酶对木质素的降解程度没有进行比较，漆酶的作用价值及高效表达没有进行深入研究。

中国专利CN101736026B公开了一种在大肠杆菌中高效表达可溶性细菌漆酶的方法，该方法在重组大肠杆菌中实现的是麦芽糖结合蛋白-细菌漆酶融合蛋白的高效表达，最终获得的是麦芽糖结合蛋白-细菌漆酶，而非细菌漆酶单体。

中国专利CN103320453A公开了一种短小芽孢杆菌漆酶基因及其表达与应用，该漆酶基因来源于短小芽孢杆菌，采用的表达载体为pColdII，构建出的重组大肠杆菌表达漆酶的诱导培养基组成为IPTG(诱导试剂)、胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠，获得的重组漆酶应用于偶氮类和蒽醌类染料脱色，该专利没有对漆酶的高效表达进行深入研究。

中国专利CN104593312A公开了一株表达枯草芽孢杆菌漆酶的重组大肠杆菌及实现该菌株分泌表达漆酶的诱导方法，该发明创制的诱导培养基组成为IPTG、CuSO

发明内容

本发明的发明目的在于：针对现有技术存在的问题，提供一种重组大肠杆菌高效表达漆酶的方法，本发明通过经发明人筛选得到的野生大肠杆菌SDB2来获得重组漆酶基因，结合独创的诱导培养方法，能够使该漆酶基因在重组菌中精准化、高效表达，克服了现有技术所存在的不足。

本发明采用的技术方案如下：一种重组大肠杆菌高效表达漆酶的方法，包括以下步骤：

S1、按照现有方法提取大肠杆菌SDB2基因组，设计PCR引物，以大肠杆菌SDB2基因组为模板进行PCR扩增，得到目标PCR产物；其中，大肠杆菌SDB2的保藏编号为CCTCC M20221114；

S2、回收纯化目标PCR产物，将目标PCR产物与原核表达载体pET28a连接构建出重组质粒pET28a-Lac；

S3、将重组质粒pET28a-Lac转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中培养，筛选出PCR鉴定为阳性的重组菌株BL21/pET28a-Lac；

S4、将重组菌株BL21/pET28a-Lac接种到液体培养基中进行培养，得到的菌液再接种至诱导培养基中诱导漆酶基因表达；

S5、诱导培养结束后离心收集菌体，菌体经悬浮、破碎、离心后得到漆酶蛋白。

在发明中，所述诱导培养基的组成为：0.2～1mM/L的IPTG、1～10mM/L的CuCl

作为优选，所述诱导培养基的组成为：1mM/L的IPTG、6mM/L的CuCl

进一步，所述PCR引物包括YfiH-F引物和YfiH-R引物，YfiH-F引物和YfiH-R引物的序列如下：

YfiH-F：CACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGAGCAAACTGATTGTTCCGCAGTGGCCGCT；

YfiH-R：AGCCGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTAAATCAGCCAAATAAAGCTGGCCATGC。

进一步，所述目标PCR产物为741bp的漆酶基因，漆酶基因的核苷酸序列为SEQ IDNO.1，编码蛋白质氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

进一步，所述液体培养基为含有30±5μg/ml卡拉霉素的液体培养基。

进一步，在步骤S1中，以大肠杆菌SDB2基因组为模板进行两轮PCR扩增反应，扩增产物经0.8w％琼脂糖凝胶电泳处理，得到目标PCR产物。

进一步，在步骤S2中，将纯化后的目标PCR产物经Nde l和Xho l双酶切后，与同样经Nde l和Xho l双酶切的表达载体pET-28a(+)用DNA连接酶进行连接，构建出重组质粒pET28a-Lac。

进一步，在步骤S5中，向收集到的菌体中加入Tris-NaCl buffer悬浮，超声破碎，离心收集上清制样，即得到漆酶蛋白。

本发明还包括一种重组菌株，所述重组菌株为上述方法制备得到的重组菌株BL21/pET28a-Lac，该重组菌株用于降解植物中的多酚类物质。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

1、本发明人筛选出的大肠杆菌SDB2可利用自身分泌的漆酶降解多酚，为选择性获得该功能漆酶，本发明在大肠杆菌BL21中引入SDB2漆酶基因，构造出专属表达该漆酶蛋白的重组基因工程菌株BL21/pET28a-Lac，该重组菌株能够高效降解多酚类植物性饲料中的多酚类物质，有效提高植物性饲料资源的应用价值，填补了饲料领域的相关技术空白；

2、本发明为重组菌株BL21/pET28a-Lac设计了一种专属的诱导培养基，该诱导培养基采用多金属离子协同富含多酚类物质的营养源，共同诱导重组菌株高效分泌表达SDB2漆酶，为应用于饲料领域的功能重组漆酶商业化生产奠定了基础。

附图说明

图1为本发明重组质粒pET28a-Lac酶切验证图；

图2为不同诱导温度对漆酶表达结果的SDS-PAGE图；

图3为不同IPTG浓度对漆酶表达结果的SDS-PAGE图；

图4为不同金属离子浓度对漆酶表达结果的SDS-PAGE图；

图5为菜粕汁、白芥子汁、棉籽粕汁对漆酶表达结果的SDS-PAGE图；

图6为不同诱导培养基对漆酶表达结果的SDS-PAGE图；

图7为重组菌株在不同培养时间对多酚类物质相对浓度的影响示意图。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明作详细的说明。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

一、重组大肠杆菌的制备

1、大肠杆菌SDB2漆酶基因克隆

提取大肠杆菌SDB2基因组作为模板，设计引物YfiH-F和YfiH-R，上、下游引物分别引入限制性酶切位点Nde l和Xho l。

所述PCR引物YfiH-F：CACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGAGCAAACTGATTGTTCCGCAGTGGCCGCT；

YfiH-R：AGCCGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTAAATCAGCCAAATAAAGCTGGCCATGC。

扩增模板为大肠杆菌SDB2基因组DNA，其两轮扩增的反应条件如表1和表2所示：

表1第一轮PCR扩增反应条件

表2第一轮PCR扩增反应条件

PCR扩增产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳，得到741bp的条带(即漆酶基因)，经测序证实为SDB2漆酶基因，见SEQ ID NO.1。

2、采用DNA凝胶回收试剂盒回收目标PCR产物，并进行纯化。

3、将回收纯化的SDB2漆酶基因PCR产物经Nde l和Xho l双酶切后，与同样经Nde l和Xho l双酶切的表达载体pET-28a(+)用DNA连接酶进行连接，构建出重组质粒pET28a-Lac。

4、将重组质粒pET28a-Lac转化至大肠杆菌BL21感受态细胞，42℃热激后涂布在含有30μg/mL卡那霉素的平板上，37℃培养12h。挑选出阳性转化子，提取转化子质粒，并进行单、双酶切验证，确定构建出的菌株为目标重组菌株BL21/pET28a-Lac。如图1所示，在图1中，重组质粒经Nde l和Xho l酶切后，获得的条带大小约5163bp(质粒pET-28a(+)经酶切后的基因)和741bp(漆酶基因)，说明成功获得了含漆酶基因的重组质粒pET28a-Lac。

二、重组大肠杆菌高效表达漆酶的制备方法

在本发明中，由于温度、诱导培养基的组成配方均会影响漆酶基因表达结果，因此采用不同实验设计方法来一一验证各因素的影响程度，从而确立最佳诱导条件，创建一套重组大肠杆菌高效表达漆酶的方法。

诱导温度选择15℃、25℃、37℃三个不同水平来验证对漆酶基因表达的影响。

诱导培养基中的IPTG浓度选择0.2mM/L、0.5mM/L、1.0mM/L三个不同水平来验证对漆酶基因表达的影响。

诱导培养基中的金属离子Cu

表3正交试验一因素水平表

诱导培养基中菜粕汁、白芥子汁、棉籽粕汁添加浓度采用三因素二水平正交设计(见下表4)来验证对漆酶基因表达的影响。

表4正交试验二因素水平表

试验一：诱导温度对漆酶表达的影响

实施例1

S1、将重组菌株BL21/pET28a-Lac接种到含有30μg/mL卡拉霉素的液体培养基中，35℃过夜培养16h；

S2、将S1中获得菌液接种至诱导培养基中于15℃诱导SDB2漆酶基因高效表达；

S3、诱导培养结束后，4000rpm离心10min，收集菌体；

S4、在收集到的菌体中加入Tris-NaCl buffer悬浮，超声破碎，离心收集上清制样；

S5、采用SDS-PAGE验证重组漆酶蛋白。

实施例2

实施例2与实施例1相同，其不同之处在于，实施例2中诱导温度为25℃。

实施例3

实施例3与实施例1相同，其不同之处在于，实施例3中诱导温度为37℃。

试验结果表明最佳诱导温度为37℃(实施例3)，如图2所示，在图2中，只有37℃诱导条件下出现一条约28KD蛋白分子量的特异条带(漆酶)，15℃(实施例1)和25℃(实施例2)均无特异条带出现。

试验二：IPTG浓度对漆酶表达的影响

实施例4

S1、将重组菌株BL21/pET28a-Lac接种到含有30μg/mL卡拉霉素的液体培养基中，35℃过夜培养16h；

S2、将S1中获得菌液接种至诱导培养基中于37℃诱导SDB2漆酶基因高效表达；

S3、诱导培养结束后，4000rpm离心10min，收集菌体；

S4、在收集到的菌体中加入Tris-NaCl buffer悬浮，超声破碎，离心收集上清制样；

S5、采用SDS-PAGE验证重组漆酶蛋白。

在诱导培养基中，IPTG的浓度为0.2mM/L。

实施例5

实施例5与实施例4相同，其不同之处在于，实施例5中特制诱导培养基中IPTG浓度为0.5mM/L。

实施例6

实施例6与实施例4相同，其不同之处在于，实施例6中特制诱导培养基中IPTG浓度为1.0mM/L。

试验结果表明最佳IPTG浓度为1.0mM/L(实施例6)，如图3所示，在图3中，IPTG浓度0.2mM/L(实施例4)、0.5mM/L(实施例5)、1.0mM/L(实施例6)均出现一条约28KD蛋白分子量的特异条带(漆酶)，其中实施例6漆酶表达量明显高于实施例4、实施例5以及实施例3。

试验三：不同金属离子浓度对漆酶表达的影响

实施例7

S1、将重组菌株BL21/pET28a-Lac接种到含有30μg/mL卡拉霉素的液体培养基中，35℃过夜培养16h；

S2、将S1中获得菌液接种至特制诱导培养基中于37℃诱导SDB2漆酶基因高效表达；

S3、诱导培养结束后，4000rpm离心10min，收集菌体；

S4、在收集到的菌体中加入Tris-NaCl buffer悬浮，超声破碎，离心收集上清制样；

S5、采用SDS-PAGE验证重组漆酶蛋白。

在S2中，诱导培养基中IPTG的浓度为1.0mM/L，Cu

实施例8

实施例8与实施例7相同，其不同之处在于，实施例8的诱导培养基中IPTG的浓度为1.0mM/L，Cu

实施例9

实施例9与实施例7相同，其不同之处在于，实施例9中诱导培养基中IPTG的浓度为1.0mM/L，Cu

试验结果表明：最佳金属离子组合Cu

试验四：菜粕汁、白芥子汁、棉籽粕汁对漆酶表达的影响

实施例10

S1、将重组菌株BL21/pET28a-Lac接种到含有30μg/mL卡拉霉素的液体培养基中，35℃过夜培养16h；

S2、将S1中获得菌液接种至特制诱导培养基中于37℃诱导SDB2漆酶基因高效表达；

S3、诱导培养结束后，4000rpm离心10min，收集菌体；

S4、在收集到的菌体中加入Tris-NaCl buffer悬浮，超声破碎，离心收集上清制样；

S5、采用SDS-PAGE验证重组漆酶蛋白；

在S2中，诱导培养基内的IPTG的浓度为1.0mM/L，Cu

实施例11

实施例11与实施例10相同，其不同之处在于，实施例11的诱导培养基中菜粕汁浓度为0.5g/L，白芥子汁浓度为1g/L，棉籽粕汁浓度为1g/L。

实施例12

实施例12与实施例10相同，其不同之处在于，实施例12的诱导培养基中菜粕汁浓度为1g/L，白芥子汁浓度为0.5g/L，棉籽粕汁浓度为1g/L。

实施例13

实施例13与实施例10相同，其不同之处在于，实施例13的诱导培养基中菜粕汁浓度为1g/L，白芥子汁浓度为1g/L，棉籽粕汁浓度为0.5g/L。

试验结果表明：最佳组合浓度为菜粕汁1g/L，白芥子汁1g/L，棉籽粕汁0.5g/L(实施例13)，如图4所示，在图4中，实施例10、实施例11、实施例12、实施例13均出现一条约28KD蛋白分子量的特异条带(漆酶)，其中实施例13漆酶表达量高于实施例10、实施例11、实施例12以及实施例9。

试验五：不同诱导培养基对漆酶表达的影响

实施例14

S1、将重组菌株BL21/pET28a-Lac接种到含有30μg/mL卡拉霉素的液体培养基中，35℃过夜培养16h；

S2、将S1中获得菌液接种至特制诱导培养基中于37℃诱导SDB2漆酶基因高效表达；

S3、诱导培养结束后，4000rpm离心10min，收集菌体；

S4、在收集到的菌体中加入Tris-NaCl buffer悬浮，超声破碎，离心收集上清制样；

S5、采用SDS-PAGE验证重组漆酶蛋白；

在S2中，诱导培养基内的IPTG的浓度为1.0mM/L，Cu

实施例15

实施例15与实施例14相同，其不同之处在于，实施例15的诱导培养基中不含有菜粕汁、白芥子汁以及棉籽粕汁，而是含有浓度为2.5g/L的蛋白胨(即菜粕汁、白芥子汁以及棉籽粕汁的总浓度)。

实施例16

实施例16与实施例14相同，其不同之处在于，在实施例16的诱导培养基中，金属盐只含有CuCl

实施例17

实施例17与实施例14相同，其不同之处在于，实施例17的诱导培养基为改良LB培养基，其组成为：浓度为1.0mM/L的IPTG，浓度为18mM/L的CuCl

试验结果如图6所示：

(1)将菜粕汁、白芥子汁以及棉籽粕汁替换为蛋白胨时(实施例15)，漆酶表达量明显低于实施例14。

(2)当金属盐只有CuCl

(3)当诱导培养基为改良的LB培养基时(实施例17)，漆酶表达量明显低于实施例14。

三、重组菌株BL21/pET28a-Lac降解多酚的应用效果

对照组：未转化的空白菌株(大肠杆菌BL21)；

试验组：重组菌株BL21/pET28a-Lac；

分别将对照组和试验组两株菌接种于实施例14制备的诱导培养基中，空气摇床37℃培养48h。两组多酚起始浓度相同，记为100％，测定培养后第8h、16h、24h、32h、40h、48h两组培养液中多酚的含量，折算为相对浓度，分析重组菌株在不同培养时间对多酚的降解效果，见图6。

由图6可知，本发明获得的高产漆酶重组菌株BL21/pET28a-Lac仅培养48h可将多酚相对浓度降低到38％，说明具有良好酶源特性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。