一种短小芽孢杆菌及其培养基、高密度培养方法、应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种短小芽孢杆菌及其培养基、高密度培养方法、应用。

背景技术

葡萄是世界上最重要的水果之一，因其具有丰富的营养价值和良好的保健功能，被誉为人类十大健康食品之一。葡萄具有广泛的用途，除鲜食外，还可以用来酿酒、制干、制醋等。葡萄霜霉病、灰霉病、白粉病等葡萄病害对葡萄产业造成了严重的威胁，其中，灰霉病不仅是葡萄生产田中的常见病害，更是产后贮藏期的毁灭性病害，严重影响葡萄的产量和质量，对葡萄产业造成严重的经济损失。该病传统防治主要依据化学农药，然而化学农药导致病原菌频繁产生抗药性，加速提高了化学农药的用量，由此带来农田污染和果实污染越为严重。

目前，化学药剂是防治灰霉病主要方法，但是长期大量使用化学药剂会增加病菌的抗药性，药效会随时间及施药次数逐渐降低，存在着许多弊端。因此，在生产上寻找能够有效控制病害发生的绿色生物农药和新技术、新手段已成为植保领域关注的热点。随着植物病害生物防治研究日趋深入，拮抗微生物及其代谢产物被筛选和发掘，大力推广无公害微生物农药具有实际应用价值，且生防菌因其抗逆性较强、无毒无害等优点日渐得到人们的认可和接受。因此在农业生产中，生防菌逐渐成为新的热点。

有鉴于此，本发明提出一种生防菌——短小芽孢杆菌，应用芽孢杆菌菌剂代替化学农药既能抑制植物病害的发生，又能在一定程度上维持生态系统的稳定，降低化学农药对人类健康和环境的不良作用。

发明内容

本发明的第一个发明目的在于提供一种短小芽孢杆菌，该短小芽孢杆菌为芽孢杆菌。

为了实现上述目的，所采用的技术方案为：

一种短小芽孢杆菌，菌株编号：6-2-13，已于2023年7月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号：CGMCC 28012。

进一步的，所述的短小芽孢杆菌的16S rDNA核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

本发明的第二个发明目的在于提供上述短小芽孢杆菌的培养基，该培养基适合上述短小芽孢杆菌的生长。

为了实现上述目的，所采用的技术方案为：

上述的短小芽孢杆菌的培养基，为LB培养基，括：碳源、氮源、无机盐、琼脂；

所述的碳源为葡萄糖、或糖蜜、或蔗糖、或酵母粉；

所述的氮源为硫酸铵、或尿素、或牛肉膏、或胰蛋白胨；

所述的无机盐为KCl、或CaCl

所述的琼脂的浓度为18g/L。

进一步的，所述的培养基包括：糖蜜、牛肉膏、NaCl。

再进一步的，所述的培养基包括：糖蜜4-6g/L、牛肉膏8-12g/L、NaCl8-12g/L。

再进一步的，所述的培养基包括：糖蜜5g/L、牛肉膏10g/L、NaCl10g/L。

本发明的第三个发明目的在于提供上述短小芽孢杆菌的高密度培养方法，该培养方法适合上述短小芽孢杆菌的生长，可以生产出具有高浓度的6-2-13生防菌剂。

为了实现上述目的，所采用的技术方案为：

上述的短小芽孢杆菌的培养方法，为：将上述的短小芽孢杆菌活化后，接种入上述的培养基内，接种量为1-5％，pH为5.0-10.0，在31-40℃下发酵培养24-96h。

进一步的，所述的接种量为1％，pH为7.0，在37℃下发酵培养72h。

本发明的第四个发明目的在于提供上述短小芽孢杆菌在植物病害生物防治中的应用。

进一步的，所述的病害为灰葡萄孢菌(灰霉病)、立枯丝核菌(立枯病)、尖孢镰刀菌(枯萎病)。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

芽孢杆菌(Bacillus spp.)在植物病害防治和环境保护等方面的巨大应用潜力。本发明通过筛选，得到了一株生防细菌短小芽孢杆菌6-2-13，该菌株既对灰葡萄孢菌(灰霉病)、立枯丝核菌(立枯病)、尖孢镰刀菌(枯萎病)具有显著的防治效果，还具有良好的溶磷性能。

本发明优化了短小芽孢杆菌6-2-13的培养基和培养条件，发酵菌体浓度提高了22.01倍，达到5.37×10

附图说明

图1为短小芽孢杆菌6-2-13的菌落形态。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明一种短小芽孢杆菌及其培养基、高密度培养方法、应用，达到预期发明目的，以下结合较佳实施例，对依据本发明提出的一种短小芽孢杆菌及其培养基、高密度培养方法、应用，其具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如后。在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。此外，一或多个实施例中的特定特征、结构或特点可由任何合适形式组合。

下面将结合具体的实施例，对本发明一种短小芽孢杆菌及其培养基、高密度培养方法、应用做进一步的详细介绍：

本发明的技术方案为：

一种短小芽孢杆菌，菌株编号：6-2-13，已于2023年7月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，简称CGMCC，保藏号：CGMCC 28012。

优选的，所述的短小芽孢杆菌的16S rDNA核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

上述的技术方案中，本发明中从新疆维吾尔自治区本土分离提取，获得对灰霉病具有较好防效的生防菌。从沙湾市142团农田土壤中分离得到，根据其形态学、生理生化特性和分子生物特征,将其命名为短小芽孢杆菌6-2-13(Bacillus pumilus 6-2-13)，已于2023年7月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，简称CGMCC，保藏号：CGMCC 28012。16S rDNA序列长度为1430bp。

上述的短小芽孢杆菌的培养基，为LB培养基，括：碳源、氮源、无机盐、琼脂；

所述的碳源为葡萄糖、或糖蜜、或蔗糖、或酵母粉；

所述的氮源为硫酸铵、或尿素、或牛肉膏、或胰蛋白胨；

所述的无机盐为KCl、或CaCl

优选的，所述的培养基包括：糖蜜、牛肉膏、NaCl。

进一步优选的，所述的培养基包括：糖蜜4-6g/L、牛肉膏8-12g/L、NaCl8-12g/L。

进一步优选的，所述的培养基包括：糖蜜5g/L、牛肉膏10g/L、NaCl10g/L。

上述的短小芽孢杆菌的高密度培养方法，为：将上述的短小芽孢杆菌活化后，接种入上述的培养基内，接种量为1-5％，pH为5.0-10.0，在31-40℃下发酵培养24-96h。

优选的，所述的接种量为1％，pH为7.0，在37℃下发酵培养72h。

上述短小芽孢杆菌在植物病害生物防治中的应用。

优选的，所述的病害为灰葡萄孢菌(灰霉病)、立枯丝核菌(立枯病)、尖孢镰刀菌(枯萎病)。

实施例1：菌株筛选与鉴定

(1)样品采集：

采集农田10cm深的作物根际土样，放置于无菌袋中低温保存并带回实验室4℃保存。

(2)样品处理：

称取5g样品，加入内装50ml无菌水的三角瓶中，静置20min后放入摇床37℃、200r/min富集30min。

(3)菌株筛选：

取1ml富集后的土壤加入9ml无菌水中，再依次稀释10

(4)筛选具有抑制灰葡萄孢菌等病原真菌的菌株：

采用对峙培养法检测分离菌株的生防效果，首先将灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)在PDA平板上活化，用7mm打孔器制作病原菌菌饼，接种于PDA平板中央，将分离出的菌株分别接种于距离菌饼2.5cm处，25℃培养7天，分别测量对照直径和抑制直径，计算抑制率。结果见表1。

由表1可知，菌株6-2-13对灰葡萄孢菌的抑制率高达74.2％。

表1菌株6-2-13对灰葡萄孢菌的抑制率

采用相同方法对立枯丝核菌与尖孢镰刀菌进行抑菌性能测试，并计算抑制率，结果见表2-3。

由表2-3可知，菌株6-2-13对立枯丝核菌和尖孢镰刀菌的抑制率分别达67.2％(表2)和64.7％(表3)，说明菌株6-2-13具有很好的光谱抑菌活性。

表2菌株6-2-13对立枯丝核菌的抑制率

表3菌株6-2-13对尖孢镰刀菌的抑制率

(5)综合菌株6-2-13的生理生化特性、分子生物学检测结果，将其鉴定为短小芽孢杆菌6-2-13(Bacilluspumilus 6-2-13)。具体如下：

①菌落形态特征：

菌株6-2-13在LB培养基平板上37℃培养24h后，形态学特征是：菌落呈圆形，淡黄色或白色，中间凸起，边缘整齐，产芽孢(图1)。

②菌株生理生化特征：

菌株6-2-13测试时需氧生长，V-P反应呈阳性，可利用葡萄糖、甘露醇、果糖、木糖产酸，可水解酪蛋白、明胶，不可水解淀粉，可利用柠檬酸盐，可在含100克/升NaCl的培养基中生长，可在20-45℃条件下生长。

③菌株16S rDNA测序分析：

提取菌株6-2-13基因组DNA为模板进行PCR，扩增16S rDNA的序列：

引物：27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。

反应程序如下：①94℃预变性3min；②94℃变性1min；③46℃退火50s；④72℃延伸1.5min；⑤重复步骤②-④30次；⑥72℃延伸10min；⑦4℃终止反应。结束后，用1XTAE缓冲液制1％琼脂糖凝胶检测PCR产物；用诺唯赞公司的DNA回收试剂盒回收PCR的产物并纯化扩增作片段，然后将纯化的DNA片段直接由安升达基因测序完成。短小芽孢杆菌的16S rDNA核苷酸序列为SEQ ID NO.1(即序列<210>1)。

申请人对筛选出的短小芽孢杆菌进行了生物保藏，具体为：

短小芽孢杆菌，菌株编号：6-2-13，分类学名短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，已于2023年7月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，简称CGMCC，保藏号为：CGMCC 28012。

实施例2：菌株6-2-13溶磷性能鉴定

将菌株6-2-13在LB培养基上活化。将活化后的菌株接种到磷酸三钙无机磷培养基(Ca

进一步利用钼锑抗比色法测定菌株6-2-13发酵上清液中的有效磷含量。将菌株6-2-13在LB液体培养基上活化后，接种到液体的溶磷培养基上，28℃、150rpm摇培7天，将菌液以12000rpm，4℃离心5min，用钼锑抗比色法测定上清液中可溶性磷含量。结果显示，菌株6-2-13溶磷的能力达到284.11土1.72mg/L。上述两种方法说明菌株6-2-13具有良好的溶磷能力。

实施例3：菌株6-2-13高密度发酵优化

由于短小芽孢杆菌不同菌株对发酵培养基和发酵条件的要求不尽相同，发酵效率之间也存在较大差异，所以对短小芽孢杆菌6-2-13进行了高密度发酵优化，得到了菌株6-2-13的最适发酵条件。具体操作步骤如下：

(1)种子液的制备：首先挑取短小芽孢杆菌6-2-13接种到100ml的LB液体培养基中活化，于37℃下震荡培养，培养至菌液OD

(2)培养基优化

①碳源：

以原始发酵培养基作为对照，用等量(5.0g·L

②氮源：

以上一步优化发酵培养基作为对照，用等量(10.0g·L

③无机盐：

以上一步发酵培养基作为对照，用等量(10.0g·L

(3)培养条件优化

①接种量：

按1％、2％、3％、5％、的接种量接种至250ml装有100ml培养基的三角瓶中，37℃、200rpm摇床培养72h，然后测量OD

②温度：

在上一步实验的基础上，以最适接种量接种进行混菌发酵，设置31℃、34℃、37℃、40℃四个不同温度梯度，200rpm摇床培养72h，然后测量OD

③时间：

在上一步实验的最适接种量、发酵温度基础上。设置24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h共7个不同发酵时间梯度。进行200rpm摇床培养，测量OD

④pH值：

在上一步实验基础上，设置pH分别为5、6、7、8、9、10的优化培养基，在种子液接种量总量为5％、发酵温度为28℃的条件下转速200r/min条件下培养72h，测定发酵液OD

综合实验结果可知，经过液体发酵培养基和培养条件优化后，菌株短小芽孢杆菌6-2-13最佳培养为：在培养基为糖蜜5g、牛肉膏10g、NaCl10g，发酵条件为接种量1％、发酵温度37℃、发酵时间72h，初始发酵pH7.0。培养后按照生物量与菌体浓度关系，计算所得菌体浓度为5.37×10

以上所述，仅是本发明实施例的较佳实施例而已，并非对本发明实施例作任何形式上的限制，依据本发明实施例的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明实施例技术方案的范围内。