一种基于链置换反应的生物传感器及其在围绝经期惊恐障碍早期诊断中的应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，特别涉及一种基于链置换反应的生物传感器及其在围绝经期惊恐障碍早期诊断中的应用。

背景技术

随着基因组学和分子病理学的发展,核酸被证实可作为一类有效的生物标志物应用于疾病的分子诊断。传统的核酸检测方法主要有Southern杂交、Northern杂交、基因芯片技术、实时荧光定量PCR(QT-qPCR)和高通量测序等。然而Northern杂交技术耗时长、操作繁琐、样品需要量大且灵敏度低；基因芯片和高通量技术虽然有高通量的优势,但是样本需要预处理、灵敏度低且成本高；qPCR技术具有较高的灵敏度和实用性,但对引物的设计要求高且需要特殊的检测仪器。因此，开发一种用于核酸检测的灵敏度高、简单快速、检测限低的生物传感器，且能通过可视化观察获得与疾病发生发展相关的遗传信息，成为临床医学分子诊断的迫切需要。

DNA分子具有高特异性和可预测的Watson-Crick碱基配，可通过恒温自组装动力学被用于构建不同的DNA纳米结构与纳米器件。这种DNA恒温自组装的基础是Toehold介导的DNA链替换反应(toehold-mediated stand displacement reaction,TMSDR)，即通过一条单链DNA置换出部分复合物中原绑定链的反应过程，Toehold在反应中的作用是为DNA链分支迁移反应提供立足点从而促进反应顺利进行。利用Toehold驱动的链置换反应在恒温条件下构建DNA分子机器和复杂DNA反应网络,从而实现特定的DNA纳米器件的构建。

发明内容

本发明提供了一种基于链置换反应的生物传感器及其在围绝经期惊恐障碍早期诊断中的应用。本发明基于DNA恒温自组装的特性，构建了一种基于Toehold介导DNA链置换反应的核酸检测技术，在恒温条件下可实现检测样品中核酸的检测，可以用于检测围绝经期不同生理病理状态患者所采集的血液样品中的特定micRNA分子，而且方法简便、条件宽松以及检测结果灵敏度高、速度快，对于疾病的早期诊断及临床干预机制研究具有重要的意义。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种基于链置换反应的生物传感器，所述生物传感器包括发夹H1、发夹H2和单链RNA报告分子；

所述发夹H1和发夹H2均具有茎环结构，发夹H1具有图2所示的结构特征，发夹H2具有的结构特征如图3所示。所述发夹H1包被着10-23DNAzyme，所述发夹H1的DNA序列如SEQID NO.1所示，为5’-ATCGTCGTGCATTTATAACCTACGGTGGGTAGGTTATAGCAACATCGATCGGAAATGC-3’；

所述发夹H2的DNA序列如SEQ ID NO.2所示，为5’-CCAATATTTACGTGCTTAGCAGCACGTAAATATTGGATGCCACCCA-3’；

所述单链RNA报告分子是一种DNA与RNA组合的基因探针。

本发明中所涉及的DNAzyme是一种人工合成的功能核酸分子，具有核酸酶活性、过氧化物酶活性等多种催化功能及高效性和高特异性。其中具有10-23基序的DNAzyme是一种高效且广泛催化RNA切割反应的单链DNA分子，由15个高度保守的脱氧核糖核苷酸构成催化活性中心，两侧分别有由6-8个脱氧核糖核苷酸构成底物结合臂，可通过特异性结合并切割荧光探针RNA底物产生荧光信号。

在以上技术方案中，所述单链RNA报告分子的5’端标记荧光报告集团FAM，3’端标记荧光淬灭集团BHQ1，所述单链RNA报告分子的序列为5’FAM-CCAATArGrUTTACG-3’BHQ1，其中，rG为鸟嘌呤核苷酸，rU为尿嘧啶核苷酸。单链RNA报告分子作用在于结合10-23DNAzyme并被切割断裂释放荧光信号。

在以上技术方案中，所述单链RNA报告分子的5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记生物素Biotin，所述单链RNA报告分子的序列为5’FAM-CCAATArGrUTTACG-3’Biotin，其中，rG为鸟嘌呤核苷酸，rU为尿嘧啶核苷酸。单链RNA报告分子作用在于结合10-23DNAzyme并被切割断裂释放可用于试纸条层析显色的放大信号。

在以上技术方案中，所述发夹H1和H2的制备方法为：所述发夹H1和H2由化学合成并HPLC纯化后，溶解于退火缓冲液制备成溶液，并置于95℃水浴箱中变性5分钟，然后以每秒下降0.1℃的速度将温度逐步降至25℃，形成稳定的催化型发夹结构。

在以上技术方案中，所述生物传感器还包括缓冲液，所述缓冲液为1×TAE/Mg

在以上技术方案中，所述退火缓冲液为10mM Tris-Hcl,50mM NaCl,1mM EDTA,pH＝7.5。

上述生物传感器在围绝经期惊恐障碍早期诊断中的应用，所述生物传感器用于检测围绝经期不同生理病理状态患者所采集的血液样品中的特定micRNA分子，所述micRNA分子的序列如SEQ ID NO.3所示，为5’-UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG-3’。

本发明检测反应体系中产物是一段含有DNAzyme序列杂交链，在恒温条件下特异性结合并单链RNA报告分子产生可检测的放大信号。本发明通过检测样品中待测核酸分子以确定样品中是否存在目标微生物或疾病诱发因子。

在以上技术方案中，所述生物传感器检测micRNA分子的具体检测过程为：在缓冲液中加入所述发夹H1、发夹H2和单链RNA报告分子，然后加入所述血液样品，补充去离子水至一定体积形成反应体系，将所述反应体系置于恒温条件下反应一段时间，反应产物采用荧光仪采集荧光信号，荧光仪激发波长为490nm，发射波长为518nm，根据荧光信号的强弱判断所述血液样品中含有的所述micRNA分子的浓度。

在以上技术方案中，所述生物传感器检测micRNA分子的具体检测过程为：在缓冲液中加入所述发夹H1、发夹H2和单链RNA报告分子，然后加入所述血液样品，补充去离子水至一定体积形成反应体系，将所述反应体系置于恒温条件下反应一段时间，反应产物加入样本稀释液，于室温下试纸条层析显色一段时间，根据是否显色的结果判断所述血液样品中是否含有所述micRNA分子。

在以上技术方案中，所述恒温条件为25-30℃，可选择为30℃；反应时间为15-60min，可选择为30min；在所述缓冲液中加入的所述发夹H1、发夹H2和单链RNA报告分子的浓度均为0.25-1.0μM，加入所述血液样品后补充去离子水至50ul。

采用本发明生物传感器进行核酸检测时，在无目标链存在的情况下，DNA发夹H1与DNA发夹H2均以茎环结构稳定存在。

当目标链存在时，以DNA发夹H1粘性末端的单链作为支点链(toehold)可与DNA发夹H1杂交，打开H1的茎环结构，形成一条新的粘性端杂交链HB1，并暴露出包被的DNAzyme序列；暴露出的DNAzyme序列能够结合单链RNA报告分子并产生荧光信号；随后DNA发夹H2部分粘性末端的单链成为支点链，在自由能的驱动下，发夹H2的茎环结构逐步打开，与杂交链HB1杂交，形成一条稳定的杂交链HB2，并将目标链从杂交链HB1中置换下来，置换出的目标链继续引发下一轮杂交反应，使检测信号得到循环放大。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明利用Toehold介导的链置换反应与10-23DNAzyme结合，构建了一种在恒温条件下的无核酸扩增检测技术，不仅实现了用于检测围绝经期不同生理病理状态患者所采集的血液样品中的特定micRNA分子，而且方法简便、条件宽松、实验操作无需特殊加热设备，常温条件下可发生反应，无需专业技术人员，并且检测结果灵敏度高、速度快，对于疾病的早期诊断及临床干预机制研究具有重要的意义。

(2)本发明发夹结构自组装反应无需酶催化，利用位形熵的增加自发进行链置换-杂交循环反应，实现检测信号放大的杂交反应。

附图说明

图1本发明提供的基于链置换反应生物传感器的一种原理工作示意图；

图2发夹结构H1示意图；

图3发夹结构H2示意图；

图4不同浓度靶标核酸的检测荧光值图；

图5不同浓度靶标核酸的试纸条层析显色检测结果图。

具体实施方式

为了更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明做进一步描述。本发明可以以许多不同的形式实施，而不应该被理解为限于在此阐述的实施例。相反，提供这些实施例，使得本公开将是彻底和完整的，并且将把本发明的构思充分传达给本领域技术人员，本发明将仅由权利要求来限定。

实施例1

一种基于链置换反应的生物传感器，其为一种新型可用于核酸检测的信号放大型荧光生物传感器，包括发夹H1、发夹H2以及FAM/BHQ1标记的单链RNA报告分子。

本发明以围绝经期惊恐障碍患者血浆中的miR-16为例描述该方法的操作步骤：

1、本实施例中设计一段可选用的围绝经期惊恐障碍患者血浆中的miR-16特异寡核苷酸序列，其序列特征如SEQ ID NO.3：5’-UAGCAGCACGUAAAUAUGGCG-3’

2、本实施例中依据催化发夹反应原理设计可选用的发夹H1与发夹H2；发夹H1含有一段碱基对互补形成茎部结构，该结构包被着DNAzyme序列，使得其核酸酶活性、过氧化物酶活性等多种催化功能被抑制。

发夹H2含有一段碱基对互补形成茎部结构，其中一条带有悬挂支点链的序列与发夹H1环结构序列形成碱基互补配对，发夹H2的环结构序列中包含了目标链，其作用在于在杂交反应过程中能够将与发夹H1杂交结合的目标置换出来；

发夹H1具有序列特征如SEQ ID NO1：

5’-ATCGTCGTGCATTTATAACCTACGGTGGGTAGGTTATAGCAACATCG ATCGGAAATGC-3’

所发夹H2具有序列特征如SEQ ID NO2：SEQ ID NO2:

5’-CCAATATTTACGTGCTTAGCAGCACGTAAATATTGGATGCCACCCA-3’。

3、单链RNA报告分子两端分别由荧光基团FAM与淬灭基团BHQ1修饰，具有序列特征为：5’FAM-CCAATArGrUTTACG-3’BHQ1，其中，rG为鸟嘌呤核苷酸，rU为尿嘧啶核苷酸；单链RNA报告分子作用在于结合10-23DNAzyme并被切割断裂释放荧光信号。

4、发夹H1的制备：发夹H序列由化学合成并HPLC纯化后，溶解于退火缓冲液(10mMTris-Hcl,50mM NaCl,1mM EDTA,pH＝7.5)制备成10μM的溶液，并置于95℃水浴箱中变性5分钟，然后以每秒下降0.1℃的速度将温度逐步降至25℃，形成稳定的催化型发夹结构，如图2所示。

5、发夹H2的制备：发夹H2序列由化学合成并HPLC纯化后，溶解于退火缓冲液(10mMTris-Hcl,50mM NaCl,1mM EDTA,pH＝7.5)制备成10μM的溶液，并置于95℃水浴箱中变性5分钟，然后以每秒下降0.1℃的速度将温度逐步降至25℃，形成稳定的催化型发夹结构，如图3所示。

6、靶标核酸分子的检测反应：1×TAE/Mg

实施例2

一种基于链置换反应的生物传感器，其为一种新型可用于核酸检测的试纸条层析显色生物传感器，包括发夹H1、发夹H2以及FAM/Biotin标记的单链RNA报告分子。

本发明以围绝经期惊恐障碍患者血浆中的miR-16为例描述该方法的操作步骤：

1、本实施例中设计一段可选用的围绝经期惊恐障碍患者血浆中的miR-16，其序列特征如SEQ ID NO3：5’-UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG-3’

2、本实施例中依据催化发夹反应原理设计可选用的发夹H1与发夹H2；发夹H1含有一段碱基对互补形成茎部结构，该结构可固定DNAzyme序列，使得其核酸酶活性、过氧化物酶活性等多种催化功能被抑制；

发夹H2含有一段碱基对互补形成茎部结构，其中一条带有悬挂支点链的序列与发夹H1环结构序列形成碱基互补配对，发夹H2的环结构序列中包含了目标链，其作用在于在杂交反应过程中能够将与发夹H1杂交结合的目标置换出来；

发夹H1具有序列特征如SEQ ID NO1：

5’-ATCGTCGTGCATTTATAACCTACGGTGGGTAGGTTATAGCAACATCG ATCGGAAATGC-3’

发夹H2具有序列特征如SEQ ID NO2：

5’-CCAATATTTACGTGCTTAGCAGCACGTAAATATTGGATGCCACCCA-3’。

3、单链RNA报告分子两端分别由荧光基团FAM与生物素Biotin修饰，具有序列特征为：5’FAM-CCAATArGrUTTACG-3’Biotin，其中，rG为鸟嘌呤核苷酸，rU为尿嘧啶核苷酸；所述单链RNA报告分子作用在于结合10-23DNAzyme并被切割断裂释放可用于试纸条层析显色的放大信号。

4、发夹H1的制备：发夹H1序列由化学合成并HPLC纯化后，溶解于退火缓冲液(10mMTris-Hcl,50mM NaCl,1mM EDTA,pH＝7.5)制备成10μM的溶液，并置于95℃水浴箱中变性5分钟，然后以每秒下降0.1℃的速度将温度逐步降至25℃，形成稳定的催化发夹结构，如图2所示。

5、发夹H2的制备：发夹H2序列由化学合成并HPLC纯化后，溶解于退火缓冲液(10mMTris-Hcl,50mM NaCl,1mM EDTA,pH＝7.5)制备成10μM的溶液，并置于95℃水浴箱中变性5分钟，然后以每秒下降0.1℃的速度将温度逐步降至25℃，形成稳定的催化发夹结构，如图3所示。

6、靶标核酸分子的检测反应：1×TAE/Mg

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。