白酒发酵过程高品温大曲总DNA的提取方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种白酒发酵过程高品温大曲总DNA的提取方法及其应用。

背景技术

大曲是白酒酿造的发酵剂，为白酒酿造过程提供了糖化力与液化力，同时对白酒中风味的形成至关重要，因此大曲的品质直接决定了白酒的产量与质量。大曲中的微生物主要包括细菌、霉菌与酵母菌，其中细菌是产香的主要动力，霉菌主要起糖化作用，酵母菌具有酒化以及产酯能力。可见大曲中的功能微生物在白酒酿造中起着重要作用。

然而环境中仅有1％的微生物在实验条件下可培养，该局限性导致只能获得环境中极少数微生物的信息，因此不能充分反映微生物在酒酪环境中的生态分布情况，随着免培养技术(DNA序列同源分析、PCR-DGGE，克隆文库，二代测序等)的广泛应用，对成品白酒大曲微生物群落多样性和结构的认识已经相对清晰。目前对发酵过程大曲微生物的研究主要集中在扩增子测序的方法，未见大曲发酵过程高品温大曲宏基因组分析的报道，而宏基因组测序技术能够深入了解基因功能，能更准确反映白酒大曲中真正具有贡献的活性微生物。

研究发现，现有报道大曲DNA提取方法不能满足发酵过程高品温大曲宏基因组测序需求，如专利CN113215146A能够提取成品大曲总DNA用于宏基因组分析，然而此方法不能提取发酵过程高品温大曲总DNA；论文“芝麻香型白酒高品温大曲微生物总DNA提取的改良方法[J].酿酒,2012,39(04):33-37”提取的DNA能够用于扩增子测序，且是提取的发酵完成的高温芝麻香型大曲，但是按照其方法提取发酵过程高品温大曲的DNA不能满足宏基因组测序条件。

因此，急需一种高效提取发酵过程大曲总DNA的方法，将其用于发酵过程高品温大曲微生物的宏基因组解析，对于发酵过程白酒高品温大曲重要风味物质的产生机理的研究及提高大曲品质具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是现有白酒大曲DNA的提取方法不能满足发酵过程高品温大曲宏基因组测序需求的问题。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：白酒发酵过程高品温大曲总DNA的提取方法，包括如下步骤：

a.取白酒发酵过程高品温大曲，快速粉碎，于-80℃冷冻保藏备用；

b.将50-100g步骤a备用的大曲与含无菌PBS缓冲液混合均匀后装入无菌离心管中离心，取上清液；

c.将步骤b得到的上清液装入无菌离心管中离心，除去上清液，得到菌体；

d.将1mL PBS缓冲液与菌体混匀并装入无菌离心管中，再加入10μL的溶壁酶、溶菌酶和蛋白酶K，最后加入玻璃珠进行研磨；

e.采用FastDNA Spin Kit for Soil试剂盒去除研磨后菌体的蛋白，洗涤，得到白酒发酵过程高品温大曲总DNA。

上述步骤a中，粉碎大曲粗细为过20目筛。

上述步骤b中，无菌PBS缓冲液与步骤a备用的大曲质量比为1:8-10。

上述步骤b中，离心的转速为1500-1800rpm，离心时间为5min。

上述步骤c中，离心的转速为12000rpm，离心时间为5min。

上述步骤d中，溶壁酶的加入量为20g/L，溶菌酶的加入量为50g/L，蛋白酶K的加入量为10g/L。

上述步骤d中，玻璃珠为直径0.2-1mm的无菌玻璃珠，加入量为0.2-0.5g。

上述步骤d中，研磨的方法为将无菌离心管在研磨仪研磨10s后于-20℃冷藏2min，然后继续研磨10s。

本发明的有益效果是：本发明研究了一种发酵过程高品温大曲总DNA高效提取方法，通过创新的DNA前处理提取法结合低温预冷研磨法，最后经过沉淀洗涤收集，即得发酵过程高品温大曲微生物的总DNA。本发明的提取方法操作方便、快速、高效；提取过程简单、易操作，克服了现有DNA提取方法不能提取发酵过程高品温大曲总DNA的缺点；且操作快速，可在2h内完成大曲总DNA的提取；提取的白酒大曲浓度高达到30-100ng/L，且纯度高，A260/A280值为1.8-2.0。

本发明提供的总DNA的高效提取方法可应用于发酵过程高品温大曲样品，解决了发酵过程高品温大曲微生物浓度低，总DNA难提取的问题。本发明从发酵过程高品温大曲中首次分离得到浓度高、纯度高的总DNA，可直接用于宏基因组分析。本发明可为发酵过程高品温大曲中微生物的宏基因组信息分析提供技术支撑，对于大曲发酵过程重要风味物质产生机理的研究及提高大曲品质具有重要意义。

附图说明

图1为本发明实施例1-2与对比例1-2提取的总DNA浓度柱状图。

具体实施方式

本发明的技术方案，具体可以按照以下方式实施。

所述白酒发酵过程高品温大曲总DNA的提取方法，具体步骤如下：

(1)取白酒发酵过程高品温大曲样品，快速粉碎，-80℃冷冻保藏备用；

(2)称取粉碎的大曲，加入到含无菌PBS缓冲液三角瓶中，勤摇匀30min；

(3)将溶液转移至50mL无菌离心管，1500-1800rpm离心5min；

(4)将上清液转移至新的无菌离心管中，12000rpm离心5min，弃上清，直至收集完所有PBS大曲溶液，得到菌体；

(5)加入1mL PBS缓冲液至菌体中，溶解菌体并转移至2mL无菌管中，再加入加入10μl的溶壁酶(20g/L)、溶菌酶(50g/L)和蛋白酶K(10g/L)，并加入玻璃珠0.2g；

(6)将2mL离心管在研磨仪研磨10s，-20℃冷藏2min，继续研磨10s，重复研磨一次；

(7)后续结合FastDNA Spin Kit for Soil试剂盒去蛋白，洗涤，即得总DNA。

其中，上述步骤(1)粉碎大曲粗细为过20目筛；

其中，上述步骤(2)称取大曲质量为50-100g；

其中，上述步骤(2)加入PBS缓冲液搅拌，PBS缓冲液与大曲质量比为1:8-10；

其中，上述步骤(5)溶解菌体需要用无菌吸头充分吹打混匀，加入的玻璃珠为无菌且直径为0.2-1mm；

其中，上述步骤(6)研磨时间为10s，防止DNA在长时间振荡而产生高温；

其中，上述步骤(6)研磨一次后需在-20℃条件下冷藏2min，以降低离心管温度，防止继续振荡产生高温使得DNA被断裂为小片段；

其中，上述所有操作步骤，均使用无菌材料；

本发明还提供了上述白酒发酵过程高品温大曲总DNA快速提取的方法在发酵过程高品温大曲总DNA提取中的用途。

下面通过实际的例子对本发明的技术方案和效果做进一步的说明。

实施例

实施例1发酵10天、温度为60℃的五粮液包包曲的总DNA提取

1、取样

从发酵10天的3个五粮液包包曲曲房中，每个曲房随机抽取1块温度为60℃左右的五粮液包包曲样品，装入无菌袋中，用粉碎机粉碎至过20目筛大小，装在无菌袋中，迅速放置于-80℃冰箱中保存备用。

2、总RNA的提取

提取步骤为：

(1)称取50g粉碎的发酵过程高品温大曲，加入到含无菌PBS缓冲液三角瓶中，勤摇匀30min；

(2)将上述溶液转移至50mL无菌离心管，1800rpm离心5min；

(3)将上清液转移至新的无菌离心管中，12000rpm离心5min，弃上清，得到菌体；

(4)重复上述步骤(2)和(3)共计6次，收集完所有菌体；

(5)加入1mLPBS缓冲液至上述菌体中，用无菌吸头吹打使得菌体充分溶于缓冲液中，并转移至2mL无菌管中，再加入10μL溶壁酶、溶菌酶和蛋白酶K，并加入直径为0.2-1mm的玻璃珠；

(6)将2mL离心管在研磨仪研磨10s，-20℃冷藏2min，继续研磨10s，重复研磨一次；

(7)后续结合FastDNA Spin Kit for Soil试剂盒去蛋白，加60μL洗脱液进行洗涤，即得总DNA。

3、总DNA的检测

吸取1μL提取得到的总DNA，使用Thermo scitific公司的Nanodrop one测量其纯度和浓度，结果见表1和图1，可知，发酵10天温度为60℃的五粮液包包曲总DNA浓度为30-100ng/μL，A260/A280值为1.8-2.0，表明DNA纯度和浓度均高。

实施例2发酵15天、温度为59℃的五粮液包包曲的总DNA提取

1、取样

从发酵15天的3个五粮液包包曲曲房中，每个曲房随机抽取1块温度为59℃左右的五粮液包包曲样品，装入无菌袋中，用粉碎机粉碎至过20目筛大小，装在无菌袋中，迅速放置于-80℃冰箱中保存备用。

2、总DNA的提取，具体操作同实施例1。

3、总DNA的检测

吸取1μL提取得到的总DNA，使用Thermo scitific公司的Nanodrop one测量其纯度和浓度，结果见表1和图1，可知，发酵15天温度为59℃的五粮液包包曲总DNA浓度为30-100ng/μL，A260/A280值为1.8-2.0，表明DNA纯度和浓度均高。

对比例1

1、取样，同实施例1。

2、总DNA的提取，提取步骤按照专利CN113215146A所述大曲DNA提取步骤进行DNA提取。

3、总DNA的检测

吸取1μL提取得到的总DNA，使用Thermo scitific公司的Nanodrop one测量其纯度和浓度，结果见表1和图1，可知，按照此方法提取的发酵10天温度为60℃的五粮液包包曲总DNA浓度小于10ng/μL，A260/A280值为不在1.8-2.0之间，表明DNA浓度低且纯度不高，不能满足宏基因组测序要求。

对比例2

1、取样，取样同实施例2。

2、总DNA的提取，提取步骤按照专利CN113215146A所述大曲DNA提取步骤进行前处理，结合FastDNA Spin Kit for Soil试剂盒进行DNA提取。

3、总DNA的检测

吸取1μL提取得到的总DNA，使用Thermo scitific公司的Nanodrop one测量其纯度和浓度，结果见表1和图1，可知，按照此方法提取的发酵15天温度为59℃的五粮液包包曲总DNA浓度小于10ng/μL，A260/A280值为不在1.8-2.0之间，表明DNA浓度低且纯度不高，不能满足宏基因组测序要求。

表1实施例和对比例包包曲总DNA浓度和纯度检测结果

本发明的发酵过程高品温大曲总DNA提取方法不仅适用于浓香型五粮液包包曲，也适用于各类发酵过程和成品白酒大曲中高品温总DNA提取，发明的方法提取快速，提取的微生物总DNA浓度高、纯度高，能有效提取样品中的微生物。