植物促根基因LTP2、其启动子、表达产物、表达载体及应用

技术领域

本申请涉及生物工程技术领域，具体涉及一种植物促根基因

背景技术

植物根系对于植株固定、水分和营养吸收、根际微生物富集等具有重要作用。此外，烟碱作为烟草特有的次生代谢产物，不仅对烟叶品质具有重要意义，同时在植物源农药和医药开发中具有广阔前景。研究发现，烟碱在烟草根系特异合成，通过木质部运输到叶片等其他组织。因此，促进烟草根系发育对增强烟株抗性，提高烟叶品质具有重要意义。目前，烟叶生产中主要是利用栽培措施促进烟株根系发育；此类传统的促根方式需要投入大量的财力、物力和人力，且效果不稳定，结合生物技术手段改良烟草品种是促进根系发育的有效手段。目前，未见烟草内源基因促进根系发育的报道。

大量的研究表明，植物脂质转移蛋白(lipid transfer protein, LTPs)广泛参与植物的代谢和生长发育过程，包括磷脂运输、角质和蜡质的形成、和生殖过程等。此外，植物LTPs对病原菌表现出广谱抗性，当病原体入侵植物的同时，LTPs被大量诱导，进而诱导植物的免疫反应。近年来，许多研究表明植物LTPs还能广泛参与非生物胁迫应答。例如，烟草LTPs可以参与介质层的合成，减少表皮水分的散失；小麦

公开于该背景技术部分的信息仅用于加深对本申请的背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成本领域技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本申请的目的在于提供一种能促进植物根系发育的基因，并利用其表达载体转化植物，以期从分子生物学方面解决利用栽培措施改良植物根系发育效果有效且不稳定的技术问题，同时还提供了一种植物根部特异表达的启动子，为研究根系发育的调控机制奠定基础。

根据本公开的一个方面，基于对烟草根部优势表达基因的长期分析研究，鉴定出一个能够调控烟草根系发育的基因

根据本公开的另一个方面，克隆并分析烟草

在本公开的一些实施例中，在植物根部优势表达基因

在具体研究过程中，以上述载体通过农杆菌介导法转化烟草栽培品种云烟87，获得了

对上述所得

本申请实施例中提供的一个或多个技术方案，至少具有如下任一技术效果或优点：

1. 筛选鉴定出了烟草

2. 所得根部优势表达启动子能够克服组成型启动子非特异、持续、高效表达所造成的浪费，减少目的基因对植物其它组织正常生长的影响，可以用于驱动目的基因在根部特异表达。

3. 所鉴定得到的烟草

附图说明

图1为本申请一实施例中LTP2的保守域和三级结构预测分析图。

图2为本申请一实施例中烟草

图3为本申请一实施例中烟草

图4为本申请一实施例中

图5为本申请一实施例中对照和35S:

图6为本申请一实施例中对照和35S:

以上图4、图5中，CK为未转化烟苗云烟87，L4、L6和L7为35S:

具体实施方式

在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂原料如无特别说明，均为市售常规产品；所涉及的检测及试验方法，如无特别说明，均为常规方法。

植物LTPs广泛地参与植物的代谢和生长发育过程，包括磷脂运输、角质和蜡质的形成、和生殖过程等。发明人对普通烟草(

实施例一：根系优势表达基因

1. 烟草

（1）用TRIZOL提取普通烟草云烟87的总RNA。

（2）反转录cDNA：使用PrimerScript RT reagent Kit（TaKaRa，Japan）将RNA反转录为cDNA。

（3）基因的克隆：基于本申请发明人的前期实验结果，使用高保真Pfu酶进行 PCR扩增。反应条件为：95℃ 5 min；95℃ 45s，55℃ 45s，72℃ 45s，35 次循环；72℃ 10 min。PCR 产物回收、纯化后进行加A反应，然后连入接到 pMD19-T克隆载体，筛选阳性克隆提取质粒，送华大生物公司进行序列测定。扩增引物为：

F：5'-CACTTCTCTTTTCTCTCTTCTCAA-3'，

R：5'-AAGATTCTAACAGCTGGGAGTG-3'。

2. 序列保守域的预测

通过CD Search（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）对蛋白的保守域进行分析预测。利用SWISS-MODEL（http:// https://swissmodel.expasy.org/）进行蛋白三级结构的分析预测。

结果如图1所示，烟草LTP2编码区全长 294 bp，编码97个氨基酸(如SEQ ID NO.3所示)。预测其分子量为10.11 kDa，等电点为8.67，其N端信号肽包含25个氨基酸（MKKGGNSFAAIILVVTLVLFLGEFL），第26位的缬氨酸(valine, V)为信号肽切割位点。保守域分析显示其具有一个疏水腔(hydrophobic cavity)，同时具有nsLTP2和 AAI-LTSS超家族的保守域。三级结构预测发现，其具有LTP蛋白的典型结构，包括4个α-螺旋和1个脂质分子的疏水腔。

3. 组织表达特性分析

大田现蕾期时分别收集烟草的根、茎、中部叶、腋芽和花蕾，按照Trizol 法提取各组织总RNA，并反转录为cDNA。

使用 Premier Prime 5.0 软件设计

PCR反应条件：95℃ 5min；95℃ 50s，60℃ 50s，72 ℃ 30s，28个循环；72℃10min。

结果如图2所示，烟草

实施例二：烟草

1. 烟草

（1）提取普通烟草云烟87的根、茎、叶片DNA，等比混合后作为PCR模板。

（2）根据本发明人的前期实验结果，使用高保真

F：5'-AAAACCGTCTCAATCATGTAAGT-3'，

R：5'-ACCAGTCAGTGTCAGAAGGAGA-3'。

序列分析结果显示成功克隆烟草

2.

以测序正确的质粒为模板，在烟草

3.

（1）将7 μl质粒（约 500ng）与EHA105农杆菌感受态细胞在冰上静置30 min后，转入液氮中冻8 min，再转入37℃水浴锅中热激5 min；

（2）热激结束后迅速将装感受态细胞置于冰上5 min后，在28℃摇床中160 rmp/min活化2 h；

（3）菌液涂布在含有Kan抗性的YEB平板上培养2天，筛选阳性菌斑。

4. 烟草

通过农杆菌侵染法将对

样品置于 GUS 染色液中（含有 1mmol/L EDTA，0.1%Triton X-100，2 mmol/L 铁氰化钾，2 mmol/L 亚铁氰化钾，100 μg/mL 氯霉素的 50 mmol/L 磷酸缓冲液 pH=7.0），中加入 100 mg/mL X-Gluc 母液（N,N-二甲基甲酰胺溶解，终浓度为 1mg/mL）， 37℃下染色过夜，70%乙醇脱色至植株失绿，观察各组织的染色情况。结果如图3所示，空白组野生型没有出现蓝色。

试验组

实施例三：烟草

1. 过表达载体的构建

将烟草

（1）在

PCR反应体系为：2 μl cDNA（50 ng/μl）；1 μl DNA聚合酶；2 μl 引物1（10 μM）；2μl 引物2（10 μM）；10 μl 5× PCR反应 Buffer；4 μl dNTPs（2.5 mM）；29 μl 水；总体积为50μl。

PCR反应程序为：95℃预变性 5 min；95℃ 40s，60℃ 40s，72℃ 1 min，35个循环；72℃延伸 10 min；16℃下保温。

（2）电泳检测：凝胶电泳检测结果显示约在300 bp的位置出现目标条带。

（3）切胶回收条带：电泳结束后，从凝胶中切下目标条带，进行DNA片段回收。

（4）酶切和灭活：用

酶切反应体系为：10 ul DNA（100 ng/μl）；1 ul内切酶1（15 U/μl）；1 ul内切酶2（15 U/μl）；5 ul酶切反应液10× Buffer；总体积为50 μl；37℃酶切反应5 h后，65℃灭活5min。

（5）切胶回收DNA：凝胶电泳回收

（6）载体连接：将回收后的

连接反应体系：7μl

（7）筛选：热激转化大肠杆菌菌株，利用Kan抗性的LB平板进行筛选，提取重组质粒，命名为

2. 转基因植株的获得

利用热击法将重组载体导入农杆菌EHA105中，通过农杆菌侵染法对烟草云烟87的叶片进行遗传转化，转化后的叶片放置在含有30 mg/L Kan的分化培养基上进行筛选。提取烟草叶片DNA，在35S启动子序列设计正向引物（5'-TTCATTTGGAGAGAACACGG-3'），克隆

转基因株系基因表达量比较：培养对照和转基因株系至五叶期，提取叶片总RNA。利用qPCR技术分析

结果如图4所示，通过Kan抗性筛选和PCR 技术检测获得8个阳性转基因纯系。通过qPCR技术比较未转化植株（CK）和8个转基因纯系（L1~8）中

实施例四：

以普通栽培烟草品种云烟87为对照，以实施例三所构建重组的

1.无菌苗形态观察

取对照和各转基因株系种子各20粒于1.5 mL离心管中，加入1 mL 10% 次氯酸钠溶液消毒8 min，然后用无菌蒸馏水清洗5次，完成种子消毒。每个株系取3粒种子，用牙签均匀点播在含1.0%琼脂的MS固体培养基上，垂直放置于光照培养箱中培养，设置三皿重复，期间跟踪观察种子的萌发和幼苗的生长过程，三周后统计幼苗的根长和侧根数。实验重复三次。

结果如图4所示，三个

2.根系参数分析

取对照和各转基因株系种子点播于漂浮盘中，进行水培培养，每周浇灌一次Hoagland营养液。培养至五叶期时对地上部分和根系进行称重。将根系放于根系扫描仪根盘中，加入少量蒸馏水浸泡，使根系在水中分布均匀，进行根系图像扫描，应用WinRHIZO(Pro 2009a, Regent Instruments)软件分析根系的总长、总表面积、总体积和平均直径。

结果如图5、图6和表1所示，三个

表1对照和转基因株系的地上部分和根系参数比较

注：小写字母代表不同株系之间存在显著差异（

以上结果证明，

尽管已描述了本发明的一些优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本申请权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。