一种与大豆维生素E含量显著相关的分子标记、KASP引物组合及应用

技术领域

本发明涉及分子遗传育种领域，特别是涉及一种与大豆维生素E含量显著相关的分子标记、KASP引物组合及应用。

背景技术

维生素E(VE)又名生育酚，主要由α、β、γ和δ型生育酚及其相应的三烯生育酚8种同系物组成。在常温下，生物活性为α>β>γ>δ，其中α-生育酚的生理活性最强，而γ-生育酚的抗氧化能力最强，β-生育酚含量非常少，在VE含量研究中一般忽略不计。维生素E具有提高机体免疫力、抗衰老、抗不育、抗癌及预防心血管疾病等作用。天然维生素E的来源主要是经济油料作物，包括大豆、向日葵籽和油菜籽等。其中，大豆维生素E含量位居前列，为0.09％～0.28％。它是大豆油中的一种天然抗氧化剂，可用来保护油脂的风味及延长油脂的储藏时间，而影响种子寿命，保证种子长期储藏后的种子活力。因此，研究快速、有效的大豆维生素E性状分子育种技术，对于分子辅助大豆维生素E质性状的遗传改良具有十分重要的生产意义。

传统维生素E大豆育种是根据育种后代维生素E组分含量进行的单株选择，这种方式不仅费时耗力而且易受环境干扰准确性不高。利用目标基因存在的碱基差异，开发特异性分子标记进行辅助选择是提高维生素E含量高的大豆选择效率的最佳方法。分子标记在作物育种中具有早期选择、不受环境影响以及准确、快速和高效的优势，已成为一种准确、高效的工具。其中竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Allele-Specific PCR，KASP)分子标记是建立在等位基因特异性扩增(Amplification Refractory Mutation System，ARMS)和高灵敏度的荧光检测基础之上的一种新型SNP分型方法，其原理是针对等位基因SNP位点设计两个正向引物和一个通用反向引物，每条正向引物都有特异性序列，可与不同荧光标记结合。带有与不同荧光结合序列的正向引物与通用反向引物PCR扩增样品的DNA，其等位变异就可以通过不同的荧光信号得以反映。

研究表明大豆维生素E含量受多个基因调控并且容易受到环境的影响，为复杂的数量性状。目前，现有研究报道已经定位了多个控制大豆维生素E含量的QTL位点。单核苷酸多态性(SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。全基因组关联(GWAS)作为一种有效的基因定位工具，可以快速、准确地挖掘与大豆维生素E显著关联的SNP。基于鉴定的与大豆维生素E显著关联的SNP，开发与大豆维生素E含量紧密连锁的KASP标记，用于育种早期(低世代)选择，对于减少育种工作量、加速育种进度具有显著的作用，同时经济效益明显。因此，基于挖掘与大豆维生素E显著关联的SNP，开发出用于辅助育种的KASP分子标记，实现目标性状的早期分子辅助选择，以提高育种效率显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种与大豆维生素E含量显著相关的分子标记、KASP引物组合及应用，以解决上述现有技术存在的问题。本发明开发的KASP引物组合能直接对SNP突变位点的A或T碱基进行特异的区分和检测，具有良好的应用价值，可实现对大豆维生素E含量性状的预先选择和分子辅助育种，对于加快维生素E含量育种的遗传改良进程，提高育种选择效率具有重要的理论和实践指导意义。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种与大豆维生素E含量显著相关的分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，在第21位碱基处存在A/T突变。

本发明还提供一种检测所述分子标记的KASP引物组，包括核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示的上游引物F1、核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的上游引物F2和核苷酸序列如SEQID NO.4所示的下游引物R。

本发明还提供一种所述分子标记的检测试剂盒，包含所述的KASP引物组。

本发明还提供一种所述的KASP引物组或所述的检测试剂盒在鉴定大豆维生素E含量中的应用。

本发明还提供一种鉴定大豆维生素E含量高低的方法，包括如下步骤：

以待测大豆样品的基因组DNA作为模板，利用所述的KASP引物组或所述的检测试剂盒对模板进行荧光定量PCR扩增，PCR扩增完成后读取荧光信号，解析转换荧光信号，鉴定基因型，根据基因型判断大豆维生素E含量的高低；

若鉴定的基因型为TT，则判断待测大豆样品的维生素E含量高；若鉴定的基因型为AA，则判断待测大豆样品的维生素E含量低。

进一步地，所述荧光定量PCR扩增的程序为：94℃激活15min；94℃变性20sec，61～55℃退火60sec，每一个循环降低0.6℃，10个循环；94℃变性20sec，55℃退火60sec，26个循环。

进一步地，所述荧光定量PCR扩增的体系为：25ng/μL的DNA模板2μL；2×KASPMaster mix 5μL；KASP混合引物0.14μL，其中上游引物F1、上游引物F2和下游引物R的体积比为2:2:5；水2.86μL。

本发明还提供一种所述的KASP引物组或所述的检测试剂盒在筛选维生素E含量高的大豆品种或品系中的应用。

本发明还提供一种所述的KASP引物组或所述的检测试剂盒在对大豆维生素E含量高低的性状进行分子标记辅助选育中的应用。

进一步地，利用权利所述的KASP引物组或所述的检测试剂盒对不同大豆分离世代进行维生素E含量高低的鉴定，选择维生素E含量高的单株或株系进行培育。

本发明公开了以下技术效果：

本发明提供的与大豆维生素E显著关联的SNP，是由264份具有代表性的大豆种质资源(包含52份地方种和212份栽培种)，根据大豆维生素E组分表型数据进行全基因组关联分析后筛选获得，该SNP位点表型变异解释率达到9.6％，位于大豆基因组v2.0的12号染色体980,498bp位置，为大豆维生素E含量性状的分子标记辅助育种提供技术支持。

本发明开发的KASP引物组合能直接对SNP突变位点的A或T碱基进行特异的区分和检测，利用该KASP引物组合对大豆维生素E含量高低进行鉴定时，能够清楚地将两种基因型分开，其中靠近Y轴的圆点为携带T等位变异位点，基因型为TT，该基因型大豆维生素E的含量相对较高；靠近X轴的圆点为携带A等位变异位点，基因型为AA，该基因型大豆维生素E的含量相对较低。本发明开发的KASP引物组合具有良好的应用价值，可实现对大豆维生素E含量性状的预先选择和分子辅助育种，对于加快维生素E含量育种的遗传改良进程，提高育种选择效率具有重要的理论和实践指导意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为大豆维生素E的GWAS结果曼哈顿及QQ-plot图，其中，A为γ-生育酚的GWAS结果曼哈顿及QQ-plot图，B为δ-生育酚的GWAS结果曼哈顿及QQ-plot图，C为TVe的GWAS结果曼哈顿及QQ-plot图，QQ-plot图中红色实线代表显著阈值，-log(p-value)≥5.0；

图2为KASP标记专用引物对不同大豆品种基因分型结果，靠近Y轴的蓝色圆点和靠近X轴的红色圆点分别代表携带T等位变异位点的大豆品种和携A等位变异位点的大豆品种。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1大豆维生素E含量显著关联的核苷酸突变位点(SNP)获得

1.DNA提取及高通量测序

从1084份大豆种质资源中选出具有代表性的264份(表1)，包含52份地方种和212份栽培种，组成了微核心种质资源。采用CTAB法提取264份大豆幼嫩叶片的基因组DNA，进行10×全基因组重测序。

表1用于重测序及全基因组关联分析的大豆自然群体名称及编号

注：以上264份大豆材料以表1中对应的编号形式均出现在公开发表的文献中(Zhang,W.,Xu,W.,Zhang,H.et al.Comparative selective signature analysisandhigh-resolution GWAS reveal a new candidate gene controlling seedweight insoybean.TheorApplGenet(2021).https://doi.org/10.1007/s00122-021-03774-6)。

2.维生素E含量的测定

从每个家系选取10.00～15.00g籽粒饱满大小一致的大豆籽粒，经样品研磨(FOSS,Knifetec1095)60s粉碎，称取0.2g粉碎后的豆粉样品，加入维生素C(Vc)0.05g和4mL80％乙醇溶液混匀，低温水浴超声30min；然后，加入8mL正己烷溶液；最后，低温水浴超声30min，离心，取上清，过0.22μm有机相滤膜。利用高效液相色谱技术(HPLC)，采用外标法对维生素E生育酚各异构体进行定量分析。色谱柱为DIKMA公司产品，色谱柱填料为symmetry，钻石C18，5μm，柱规格为250.0mm×4.6mm；荧光检测器激发波长290nm，发射波长300nm；流动相为甲醇，流速1.0mL/min；柱温35℃；进样量20μL；检测时间10min。以γ-生育酚、δ-生育酚峰面积代入回归方程进行定量分析。TVe为α-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚值之和。

3.全基因组关联分析(GWAS)

利用R语言软件中的GAPIT算法包，计算模型为混合线性模型(MLM)进行全基因组关联分析(GWAS)，经过剔除过滤后检测到与大豆维生素E含量显著关联的SNP位点199个(图1)，其中与大豆维生素E显著关联的SNP位点S12_980498，表型变异解释率达到9.6％，位于大豆基因组v2.0的12号染色体980,498bp位置。

包含该SNP位点的基因序列如SEQ ID NO.1所示：

AAACTTTATATTATTTTATT[A/T]ATGTTATTCACTATTCATCCAGCAATGTAATGTACATGGTAAAAAATTGTTCAGTAACTCAATTATGTTTGTGGTGTGTTATTTTTTTTGTTGTCATATATTTTAGTGTGTATGAAATGGACCCTTAAAAGAATAATGACGAGATCCTAAACTAACACCATTTCATATTCATACTAATGAAAAGAAGGAGAAGAGGAAACACGTGGTGTCATAGTTTGGGTCAATTTGGAATGGGCTGAAATGACAGGGCCAGAAGGAATTGGGCCCTTGGAGAAGTAGGCTTGGGGCCCATTGGTTGGAGGAACAAATAAAGGAAGGGAAGGGAAGAGTGAAAGCGAGACGTTAGCTGGGCAAAGCAACCGGACACACCCCAACCTGACTT(注：SEQ ID NO.1所示序列第21bp处为SNP位点，该位点存在A/T突变)。

实施例2KASP标记特异引物的开发

利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的Primer-BLAST功能，依据SEQ IDNO.1序列设计三个引物，上游引物F1(SEQ ID NO.2)、上游引物F2(SEQ ID NO.3)和下游引物R(SEQ ID NO.4)，其中F1和F2分别包含FAM和HEX荧光接头序列(下划线)，序列如下：

上游引物F1(SEQ ID NO.2)：

5’-

上游引物F2(SEQ ID NO.3)：

5’-

下游引物R(SEQ ID NO.4)：5’-AAGTCAGGTTGGGGTGTGTC-3’。

实施例3检测不同品种大豆SNP位点的基因型及其应用

随机选择28份大豆材料，分别提取大豆样品的基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用实施例2开发的KASP标记专用引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR扩增是在ABI7500实时荧光定量PCR仪中进行，PCR结束后该仪器根据荧光信号可进行基因分型。所述的扩增体系均为10μL反应体系：25ng/μL的大豆样品DNA模板2μL；2×KASP Master mix 5μL；KASP混合引物0.14μL，其中F1:F2:R＝2:2:5(V/V/V)；水2.86μL。反应条件包括94℃激活15min；94℃变性20sec，61～55℃退火60sec，每一个循环降低0.6℃，10个循环；94℃变性20sec，55℃退火60sec，26个循环。

反应完成后，ABI7500实时荧光定量PCR仪直接对PCR反应产物进行荧光数据读取，结果如图2。

靠近Y轴的圆点为携带T等位变异位点，基因型为TT，有17份，其平均γ-生育酚、δ-生育酚和TVe含量分别为215.37μg/g，24.36μg/g，和256.43μg/g；进行扩增反应时，该检测样品会与特定的FAM检测引物结合并释放出蓝色荧光基团，随着PCR反应循环数的增加，蓝色荧光信号增强。

靠近X轴的圆点为携带A等位变异位点，基因型为AA，有11份，其平均γ-生育酚、δ-生育酚和TVe含量分别为160.35μg/g，17.69μg/g，和190.25μg/g；进行扩增反应时，该检测样品会与特定的HEX检测引物结合并释放出红色荧光基团，随着PCR反应循环数的增加，红色荧光信号增强。

根据实施例1发现，在包含264份大豆材料的关联分析群体中(有13份材料在SNPS12_980498基因型为缺失)，基因型是AA型的129份大豆材料的平均γ-生育酚、δ-生育酚和TVe含量分别为160.88μg/g，19.24μg/g和192.69μg/g；基因型是TT型的122份大豆材料的平均γ-生育酚、δ-生育酚和TVe含量分别为214.52μg/g，25.35μg/g和256.65μg/g。

因此，在采用实施例2开发的KASP标记专用引物对大豆进行测定时，若结果出现蓝色荧光信号，则判断其为大豆维生素E含量高的基因型；若结果出现红色荧光信号，则判断其为大豆维生素E含量低的基因型。检测结果与实施例1相吻合。

上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。