一种植物乳杆菌的分离鉴定及其在棉籽蛋白发酵中的应用

技术领域

本发明属于生物发酵技术领域，涉及一种植物乳杆菌的分离鉴定及其在棉籽蛋白发酵中的应用。

背景技术

青贮饲料是乳酸菌发酵饲料，自然青贮是利用自然界植物上存在的乳酸菌进行发酵，由于自然界植物上的乳酸菌含量少，仅占细菌总数的0.01％-1％。所以在发酵过程中，乳酸菌很难迅速的形成优势菌群，不能在短时间内降低pH值。其结果：一是各种细菌都在生长繁殖使温度迅速上升，造成预备发酵期延长。二是预备发酵过程中，青贮料因发热造成大量的营养成分和能量的损失，还造成气味刺鼻、适口性差的状况。三是在发酵过程中霉菌和腐败菌的大量繁殖，造成青贮料局部发霉和腐烂，特别是顶部、底部和边沿霉变、腐烂情况严重。四是由于有大量的杂菌存在，在青贮料开窖时，很容易形成二次发酵，在取食截面上新发生霉斑或者成片发霉，情况不好时会造成彻底霉变。青贮饲料是利用青贮发酵技术制备的动物饲料。

青贮发酵技术原理是指在密闭厌氧的条件下，乳酸菌等微生物利用收获后植物中的水溶性碳水化合物和其它成分后大量生长繁殖，同时发酵产生乳酸，使整体pH值降至4左右。在此pH条件下，腐败细菌和霉菌的生长被抑制，使其逐渐死亡，而且乳酸菌自身的生长也被产生的乳酸所抑制形成稳定状态，从而使植物营养成分能够长期保存，并且饲料的消化利用率得到提高。因此产酸效率高、耐酸性好的植物乳杆菌是关键所在。

棉籽蛋白主要用于饲料工业中，其富含赖氨酸、不饱和脂肪酸、纤维素等，且氨基酸组成均匀，添加于饲料中可起到提高奶牛产奶量、加强畜禽消化吸收功能、加快畜禽生长发育等作用。

现有技术主要采用“液-液-固”三相萃取法、膨化法、化学法获得含有较低棉酚的棉籽蛋白粉以能够应用于动物饲料中。萃取法的制取过程一直保持低温，最大限度地避免了氨基酸与游离棉酚结合形成结合棉酚以及蛋白质的热变性，保证了产品的营养效价及蛋白质、氨基酸的利用率，但萃取法溶剂配制繁杂，分离和回收困难、加工成本高且萃取出的毛棉油因含有大量的棉酚和色素而影响感官和质量，无法实现工业化生产。膨化法的脱酚效果好，生产连续性好，但膨化设备投资大，加工运营成本高，投资回报率低。化学法操作简单，

投资低，脱酚效果也较好，但游离棉酚与化学试剂反应形成的络合物仍存留在棉籽蛋白中，造成棉籽蛋白的适口性较差，影响口感。

因此亟需开发一种产酸效率高、耐酸性好的植物乳杆菌，提高棉籽蛋白的感官品质，延长其保存时间。

发明内容

基于现有技术中存在的问题和不足，本发明旨在提供一种植物乳杆菌的分离鉴定及其在棉籽蛋白发酵中的应用。本发明的植物乳杆菌R6-1

(Lactobacillus plantarum R6-1)，已于2023年08月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.28111。植物乳杆菌R6-1产酸速率高、耐酸性好。该植物乳杆菌结合酸性蛋白酶，菌酶协同发酵棉籽蛋白，发酵后的棉籽蛋白具有特殊的芳香气味、质地得到改善、产酸性能显著提高，益生菌的定植与有机酸的调节可抑制有害菌的生长，延长饲料保存时间，改善了棉籽蛋白的饲料品质。

本发明的技术方案如下：

一方面，本发明提供了一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌R6-1，已于2023年08月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.28111。

具体地，所述植物乳杆菌R6-1的16s rRNA序列为SEQ ID NO：3。

具体地，所述植物乳杆菌R6-1利用七叶苷、纤维二糖、麦芽糖、甘露醇、水杨苷、山梨醇、蔗糖、棉子糖、菊糖、乳糖，而不利用马尿酸钠。

具体地，所述植物乳杆菌R6-1在2h后进入对数生长期，直到6h后开始进入稳定期。

具体地，所述植物乳杆菌R6-1培养2-10h产酸速率较快，10-24h产酸效率减小；其发酵过程中pH值可降至4.0左右。

具体地，所述植物乳杆菌R6-1在40℃、pH4-11条件下生长好。

另一方面，本发明提供了一种植物乳杆菌制剂，所述植物乳杆菌制剂包括上述植物乳杆菌R6-1的菌体、发酵液、发酵上清液、发酵液沉淀、冻干粉中的一种或多种。

又一方面，本发明提供了上述植物乳杆菌的培养方法，其特征在于，所述培养方法为将植物乳杆菌接种于培养基进行培养。

具体地，所述培养方法包括以下步骤：

(1)制备青贮饲料灭菌液；

(2)从所述发酵液中提取植物乳杆菌进行培养；

(3)筛选植物乳杆菌，经过鉴定，得到植物乳杆菌R6-1。

具体地，步骤(1)中所述的青贮饲料灭菌液的制备方法为将青贮饲料用无菌剪刀剪碎后放入经过灭菌的蒸馏水锥形瓶中。

进一步具体地，所述青贮饲料与蒸馏水的质量比为5：95。

优选地，所述青贮饲料为5g；所述蒸馏水为95mL。

具体地，步骤(2)中所述的培养方法包括将植物乳杆菌接种于培养基，所述培养基为MRS平板琼脂培养基。

优选地，所述培养基为含有1％ CaCO

优选地，所述培养条件为37℃，培养24h。

具体地，步骤(3)中所述的筛选植物乳杆菌为通过革兰氏染色进行筛选。

又一方面，本发明提供了上述植物乳杆菌和/或的植物乳杆菌制剂在棉籽蛋白发酵中的应用。

具体地，所述应用为在提高棉籽蛋白产酸量中的应用。

具体地，所述应用为在青贮中的应用。

又一方面，本发明提供了一种棉籽蛋白的生产方法，所述生产方法包括上述植物乳杆菌和/或植物乳杆菌制剂。

具体地，所述生产方法包括以下步骤：

S1：植物乳杆菌R6-1接种于培养基中静置培养得到菌液发酵液；

S2：菌液发酵液、酸性蛋白酶溶于水后接种于棉籽蛋白进行生料发酵。

进一步具体地，步骤S1所述的植物乳杆菌R6-1的接种量为1％-3％。

优选地，步骤S1所述的植物乳杆菌R6-1的接种量为2％。

优选地，步骤S1所述的培养基为MRS肉汤培养基。

进一步具体地，步骤S1所述的培养时间为4-8h。

优选地，步骤S1所述的培养时间为6h。

进一步具体地，步骤S2所述的菌液发酵液与酸性蛋白酶的接种质量比为1-12：1。

优选地，步骤S2所述的菌液发酵液与酸性蛋白酶的接种质量比为6：1。

进一步具体地，步骤S2所述的菌液发酵液的接种量为1％-12％。

优选地，步骤S2所述的菌液发酵液的接种量为6％。

进一步具体地，步骤S2所述的酸性蛋白酶的接种量为0.5％-2％。

优选地，步骤S2所述的酸性蛋白酶的接种量为1％。

进一步具体地，步骤S2所述的发酵温度为20-40℃。

优选地，步骤S2所述的发酵温度为37℃。

进一步具体地，步骤S2所述的发酵时间为24-72h。

优选地，步骤S2所述的发酵时间为48h。

进一步具体地，步骤S2所述的酸性蛋白酶pH为3-5。

优选地，步骤S2所述的酸性蛋白酶pH为2-4。

又一方面，本发明提供了上述生产方法在生产棉籽蛋白中的应用。

本发明的有益效果为：

(1)本发明提供了一种植物乳杆菌R6-1，已于2023年08月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.28111。

(2)本发明提供的植物乳杆菌R6-1产酸率高、耐酸性好。

(3)本发明提供的植物乳杆菌R6-1结合酸性蛋白酶，菌酶协同发酵棉籽蛋白，发酵后的棉籽蛋白具有特殊的芳香气味、质地得到改善、产酸性能显著提高，益生菌的定植与有机酸的调节可抑制有害菌的生长，延长饲料保存时间，改善了棉籽蛋白的饲料品质。

保藏说明

保藏菌株：植物乳杆菌R6-1；

分类命名：植物乳杆菌Lactobacillus plantarum；

保藏编号：CGMCC No.28111；

保藏时间：2023年08月04日；

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

附图说明

图1为菌株菌落形态。

图2为革兰染色结果图。

图3为凝胶电泳结果图。

图4为系统进化树图。

图5为植物乳杆菌R6-1的生长曲线。

图6为植物乳杆菌R6-1的产酸速率曲线。

图7为OD

图8为棉籽蛋白发酵图片。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明进行说明，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明，以使本发明技术方案更易于理解掌握。下属实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明均可从商业途径获得。

本发明所用材料如下：

1、棉籽蛋白原料，购买自新疆泰昆有限责任公司，货号：棉籽蛋白。

2、酸性蛋白酶，购买自江苏奕农生物股份有限公司，货号：AP5

本发明所用培养基如下：

1、MRS肉汤培养基：购买自海博生物，货号HB0384-1。

2、MRS平板琼脂培养基：将MRS肉汤培养基在118℃条件下，灭菌15min，50℃条件下进行凝固。

本发明所用仪器如下：

1、分光光度计：723PC可见分光光度计，购于上海菁华科技仪器有限公司。

2、pH计：PHS-3CpH计，购于上海越平科学仪器有限公司。

3、显微镜：Eclipse Ci-POL，购于尼康仪器有限公司。

基础实验例1乳酸菌分离纯化与初步鉴定

(1)乳酸菌分离纯化

在超净工作台中，将5g青贮饲料(来自富蕴县奶牛场青贮饲料)样本用无菌剪刀剪碎后放入含有95mL经过灭菌的蒸馏水锥形瓶中，在无菌条件下，将菌液稀释10

(2)初步鉴定

将分离纯化后的菌株R6培养24h后挑取单菌落进行革兰氏染色，所述染色过程为：涂片→干燥→固定→初染→媒染→脱色→复染→镜检；

1)涂片

用镊子取一张载玻片，用滤纸将其擦干净，在载玻片中央滴一滴生理盐水；将接种环于酒精灯火焰上灭菌，在酒精灯附近，左手斜握装有菌液的试管，用右手小拇指拔开菌液管的塞子，右手将灭菌后的接种环插入试管中沾取菌液，试管管口通过火焰，用塞子塞好管口，将试管放入指定位置；将接种环上的菌液加入载玻片上滴有生理盐水的中央，用接种环涂匀，之后将接种环灭菌。

2)干燥

用镊子夹紧载玻片的一端，使其置于酒精灯火焰附近，使其迅速干燥。

3)固定

待其干燥后，将涂片再于火焰上方缓慢通过三次，使乳酸菌固定于载玻片上，目的是在染色和水冲洗时乳酸菌不会脱落。

4)初染

载玻片上滴加一滴草酸铵结晶紫染液覆盖整个标本，染色约1min，用蒸馏水将结晶紫染液冲洗净。

5)媒染

滴加卢哥氏碘液覆盖整个标本，染色约1min，再用蒸馏水冲洗干净。

6)脱色加95％的酒精于载玻片上，脱色约30s，倾去酒精，再用蒸馏水冲掉酒精。

7)复染

加复红染色液复染约1min，水洗冲掉复红染液，使其自然干燥或用吸水纸轻轻吸干。

将涂片放于显微镜Eclipse Ci-POL下进行观察。先用低倍镜再用高倍镜最后用油镜观察，并记录细菌的染色情况以及细胞的形态。对分离得到的菌株进行初步鉴定，结果见图2。革兰氏染色后呈现蓝紫色杆状菌，无芽孢。

实施例1细菌分子生物学鉴定

取分离纯化后菌株R6，用基因组提取试剂盒(购自天根生物有限公司，货号：DP302-02)提取基因组DNA，根据基因组DNA设计引物，并由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物如下：

27F：SEQ ID NO：1；

1492R：SEQ ID NO：2；

以基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系见表2，PCR反应参数为：95℃变性5min；然后94℃变性30sec；55℃退火30sec；72℃延伸30sec，30个循环后72℃保温2min，得到PCR扩增产物。

表2 PCR反应体系

将PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳。PCR扩增产物送至上海生工生物工程股份有限公司，通过测试16s rRNA测序做菌株的鉴定，测序序列结果与NCBI数据库中进行BLAST同源序列比对，以确定菌株的种属，同源性超过99％即可鉴定至种。

PCR扩增产物凝胶电泳结果见图3，结果显示，PCR扩增产物在1500bp处条带明亮清晰，表明条带完整性好、降解率低，样品的质量符合测序要求。PCR扩增产物的16s rRNA测序结果如SEQ ID NO：3所示，分析结果表明，该PCR扩增产物与标准菌株植物乳杆菌MK311266.1(Lactobacillus plantarum)相似性最高，同源性超过99％(见图4)。可以确定该PCR扩增产物为Lactobacillus plantarum，并正式命名为植物乳杆菌R6-1，该菌已于2023年08月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.28111。

实施例2植物乳杆菌R6-1生化鉴定

选用乳酸菌生化鉴定管(购自杭州天和微生物试剂有限公司，货号：J2210)，检测植物乳杆菌R6-1对七叶苷、纤维二塘、麦芽糖、甘露醇、水杨苷、山梨醇、蔗糖、棉子糖、菊糖、乳糖和马尿酸钠的利用，结果见表1：

表1乳酸菌生化鉴定

注：表中+表示阳性菌(positive)；-表示阴性菌(negative)

菌株R6-1可利用七叶苷、纤维二糖、麦芽糖、甘露醇、水杨苷、山梨醇、蔗糖、棉子糖、菊糖、乳糖，而不利用马尿酸钠。

实施例3植物乳杆菌R6-1生长曲线测定和产酸曲线

(1)生长曲线的测定

在无菌的MRS液体培养基中接种2％植物乳杆菌R6-1菌悬液，37℃静置恒温培养24h，每隔2h取样1次。以未接种菌液MRS培养基为空白对照，采用酶标仪在波长600nm处测定OD值，重复3次。以时间为横坐标，OD值为纵坐标绘制菌株的生长曲线，见图5。

数据表明，植物乳杆菌R6-1在2h内缓慢生长，在2h后进入对数生长期，直到6h后开始进入稳定期，细菌生长缓慢。细菌整体生长曲线呈现“S”型。

(2)产酸曲线的测定

在初始pH为5.9的无菌MRS液体培养基中接种2％植物乳杆菌R6-1菌悬液，37℃静置恒温培养24h，每隔2h取样1次。用pH计测定各时间点pH，重复3次，将最终结果以时间为横坐标，以pH为纵坐标绘制出菌株产酸曲线，见图6。

数据表明，植物乳杆菌R6-1培养2-10h产酸速率较快，10-24h产酸效率减小；其发酵过程中pH值可降至4.0左右，显示出极佳的青贮潜力。

实施例4植物乳杆菌R6-1耐酸耐温评价

本实施例中，根据OD

表2 OD值大小判定菌株生长情况标准

(1)温度耐受试验特性

取培养6h后的植物乳杆菌R6-1，按照接种量为2％接种在100mL无菌MRS的液体培养基之中，分别放置于40℃、45℃、50℃培养箱中培养24h，使用分光光度计测定OD

表3植物乳杆菌R6-1耐温特性

注：“-”表示不生长；“w”表示弱生长；“+”表示生长；“++”表示生长好。

由表3可知，植物乳杆菌R6-1在40℃条件下生长好。

(2)酸碱耐受特性

取培养6h后的植物乳杆菌R6-1，按照接种量为2％接种分别在pH为3、3.5、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13的100mL无菌MRS液体培养基之中，培养24h后，使用分光光度计测定OD

表4植物乳杆菌R6-1耐酸碱性试验结果

注：“-”表示不生长；“w”表示弱生长；“+”表示生长；“++”表示生长好。

由表4可知，植物乳杆菌R6-1在pH3、pH3.5、pH13条件下不生长，在pH12条件下弱生长，在pH4-11条件下生长好。

实施例5植物乳杆菌R6-1发酵棉籽蛋白

发酵材料：棉籽蛋白，黄色固体、粉末状。

发酵方式：固体生料发酵

发酵液制备：植物乳杆菌R6-1以2％的接种量接种于含有200mL MRS肉汤培养基中静置培养6h作为菌液发酵液用于棉籽蛋白生料发酵。

发酵方法：对照组接种6％的水进行生料发酵、试验Ⅰ组接种6％水+1％酸性蛋白酶进行生料发酵、试验Ⅱ组6％菌液发酵液进行生料发酵、试验Ⅲ组6％菌液发酵液+1％酸性蛋白酶进行生料发酵。

发酵条件：发酵料样含水量55％，37℃发酵48h，发酵时每组9个重复，发酵分组见表5，发酵结果见表6，发酵图片见图8。

表5发酵组别

表6发酵棉籽蛋白外观及pH

注：同行数据标注无字母及相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

如表6所示，发酵后四组样品均呈现出松散的质地，对照组中存在部分结块；对照组气味呈现棉籽蛋白味夹杂微腐味，试验I组呈现棉籽蛋白味，试验II组呈现微酸味，试验III组呈现浓郁酸味；对照组和试验I组色泽均呈现黄色，试验II组呈现亮黄色，试验III组呈现黄棕色。四组样品pH值组间均呈现出显著差异(P<0.05)，其中试验III组的产酸性能较好(pH＝4.684)；发酵后乳酸含量对照组与试验组均呈现差异极显著(P<0.01)，其中试验组I与试验组II呈现差异极显著(P<0.01)，试验组III与试验组I、试验组II呈现差异极显著(P<0.01)，试验组与对照组相比乳酸的含量呈现明显提高，其中试验组III的乳酸含量最高。

上述试验组发酵后的棉籽蛋白，饲料感官品质均具有一定改善，其中以混合发酵效果最佳，结合了植物乳杆菌和酸性蛋白酶优势，菌酶协同发酵，产物具有特殊的芳香气味、质地得到改善、产酸性能也优于试验I组和试验II组，益生菌的定植与有机酸的调节可抑制有害菌的生长，延长饲料保存时间，改善了棉籽蛋白的饲料品质。

对比例1与现有技术中的植物乳杆菌对比

注：表中NA代表未记载。

由此可见本发明所提供的植物乳杆菌R6-1相比于现有技术中的植物乳杆菌能够快速进入对数生长期，可缩短发酵周期。本发明所提供的植物乳杆菌R6-1在pH为4-12时能够生长，酸碱耐受性强，pH谱较广。本发明所提供的植物乳杆菌R6-1产酸能力较强。

上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围。应当指出的是，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附要求为准。