一种嗜盐嗜碱菌Bachu 49菌株及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域；具体涉及一种嗜盐嗜碱菌Bachu 49菌株及其在盐碱地改良、植物抗盐碱促生方面的应用。

背景技术

目前，盐碱地治理最常用的方法为物理改良法，化学改良法和生物改良法。物理改良有灌水洗盐、明沟排水，暗管排盐等，化学方法则主要是在土壤中施加一些化学改良剂，例如石膏、酸性物质和泥炭等一些有机物质（朱生堡等，2023）。物理改良法和化学改良法虽然有作用且见效快，但存在成本高、对环境造成二次污染等弊端。相比之下，生物改良法主要是施用有机肥料，种植耐盐作物等；并且生物改良法的成本低、不破坏环境且持续性好，因此生物改良法自然而然就成为了当前盐碱地治理的研究热点。接种根际促生菌（PGPR）就是生物改良盐碱地的方法之一，PGPR能够通过分泌一些植物激素来促进植物的生长发育，有些PGPR还会促进植物对氮磷钾的吸收与利用，甚至有些还能够产生铁载体帮助植物吸收铁元素。因此，将这种具有耐盐碱促生作用的菌制成微生物菌剂使用在盐碱土壤上可以极大地改善土壤的盐碱化，不仅对改良盐碱地有重要意义，同时也将极大地促进我国农业的发展。国内外对于微生物促进植物在盐碱地中生长的研究仍处于不断完善的阶段，目前开发的耐盐碱促生菌株种类较少、盐碱地适应性差，而且分离自新疆盐碱地、能够耐盐碱、降碱、解磷、产IAA、固氮、促进植物生长的嗜盐嗜碱菌尚未有报道。因此筛选获得一株能抵抗盐碱胁迫，促进植物生长的嗜盐嗜碱菌，对盐碱地的可持续农业开发和盐碱土改良和利用具有重要意义。

发明内容

为解决目前开发的耐盐碱促生菌株种类较少、盐碱地适应性差技术问题，本发明提供一种嗜盐嗜碱菌

本发明的目的是以下述方式实现的：一种嗜盐嗜碱菌（

所述嗜盐嗜碱菌（

所述嗜盐嗜碱菌（

所述的嗜盐嗜碱菌（

所述的嗜盐嗜碱菌（

所述的嗜盐嗜碱菌（

所述的嗜盐嗜碱菌（

所述的嗜盐嗜碱菌（

所述液体菌剂的有效活菌数≧2.0亿/mL，霉菌杂菌数≦2.0×10

所述粉剂菌剂的有效活菌数≧2.0亿/mL，霉菌杂菌数≦1.5×10

所述颗粒菌剂的有效活菌数≧1.0亿/mL，霉菌杂菌数≦1.2×10

所述菌剂包括助剂（包括甘油、海藻糖、氨基酸、蛋白质、多糖、氯化钠、γ-聚谷氨酸、十二烷基苯磺酸钠、酵母膏、醇、腐殖酸钾、甲壳素中的一种或多种）和固体载体，固体载体为泥炭、褐煤、蒙脱土、硅石、蛭石、高岭土、硅藻土、麦饭石、藻酸盐中的至少一种。

所述菌剂包括至少一种微生物菌剂和无机肥。

相对于现有技术，本发明的技术效果是：本发明提供一种嗜盐嗜碱菌（

附图说明

图1是Bachu 49菌株的系统发育树；

图2是Bachu 49菌株的菌落形态图；

图3是Bachu 49菌株的革兰氏染色图；

图4是Bachu 49菌株48小时内的生长曲线；

图5是Bachu 49菌株的固氮实验结果图；

图6是 Bachu 49菌株的解磷实验结果图；

图7是IAA标准曲线图；

图8是 Bachu 49菌株的产IAA实验结果图；

图9A是Bachu 49菌株于加入中性红指示剂的培养基上培养48h结果图；

图9B是接种Bachu 49菌株的中性红培养基敞口放置24h结果图；

图9C是接种Bachu 49菌株的中性红培养基未敞口放置24h结果图；

图10是Bachu 49菌株对玉米幼苗的促生效果图；

图11是Bachu 49菌株对拟南芥幼苗的促生效果柱状图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

本发明提供一种嗜盐嗜碱菌（

实施例1 Bachu 49菌株的分离、纯化与鉴定

一、供试材料及分离用培养基

土壤样本来源于新疆维吾尔自治区喀什地区，将土壤装入准备好的干净的密封袋中，低温带回实验室进行菌株分离。分离用的高盐高碱LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 75g，琼脂粉15g，去离子水1L，pH值=9，高压灭菌（121℃、20min）。

二、Bachu 49菌株的分离与纯化

a）取5g供试土壤样品加入到装有45 ml灭菌去离子水的离心管中，涡旋振荡直到土壤与水充分混匀，静置2~10min后形成土壤悬液；

b）在无菌超净工作台内吸取1ml土壤悬液于离心管中，再加入9ml灭菌去离子水，得到10

c）分别取不同梯度的土壤悬液100μL滴于LB固体培养基，用无菌涂布棒将土壤悬液均匀涂布于LB固体培养基上，每个梯度三个生物学重复；

d）将培养皿涂布好的平板放入30℃恒温培养箱中倒置培养7d；

e）待有菌落形成后转接3次，纯化得到纯培养物。吸取纯培养物菌液500μL加入50%甘油中，于-80℃保藏。

三、Bachu 49 菌株的鉴定

采用细菌通用上游引物27F和细菌通用下游引物1492R分别扩增该菌株的16SrDNA序列，酶选用诺唯赞生物公司的2×phanta Max Mix（p515）。PCR扩增的体系为25μL体系：引物27F1μL、引物1492R 1μL、2×phanta Max Mix 12.5μL、DNA模板0.5μL、ddH

将分离纯化得到的Bachu 49菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO.26951。

实施例2 Bachu 49菌株的生理生化特征

一、Bachu 49菌株的菌落形态

对Bachu 49菌株的菌落进行形态观察，该菌株在LB（pH=9，NaCl 7.5%）固体培养基上的菌落形态如图2所示，所述Bachu49菌株的菌落呈圆形、白色透明且边缘较为整齐。经革兰氏染色，Bachu 49菌株为革兰氏阴性菌，结果如图3。将Bachu 49菌株接种于海博生物技术有限公司的微量发酵管，获得该菌株的部分生理生化指标如表1所示。Bachu 49菌株可以选择性利用多种碳源，为该菌株的生产及应用提供了理论数据。

表1 Bachu 49菌株的部分生理生化指标

注：“+”表示阳性；“-”表示阴性

二、Bachu 49菌株的生长曲线测定

挑取Bachu 49菌株单菌落接种于装有液体LB培养基（pH=9，NaCl 7.5%）的灭菌试管中，恒温震荡摇床30℃，180r/min 培养，用紫外分光光度计测量菌液在 600 nm 处的吸光值，至菌液的OD

三、Bachu 49菌株的耐盐能力

吸取OD

表2 Bachu 49菌株的耐盐能力测定

注：“-”表示不生长；“＋”表示生长

四、Bachu 49菌株的耐碱能力

吸取OD

表3 Bachu 49菌株的耐碱能力测定

注：“-”表示不生长；“＋”表示生长

五、Bachu 49菌株生长的温度范围

将所述菌株Bachu 49接种至固体LB培养基（pH=9，NaCl 7.5%），培养的温度范围为10℃-50℃（以5℃为一个条件的递增量）。培养7d后，观察是否有菌落生成。结果表明，所述菌株Bachu 49可以在10℃-45℃的温度范围内生长，宽泛的生长温度范围为该菌株进一步的生产和应用提供了基础。

实施例3 Bachu 49菌株的促生功能鉴定

一、 Bachu 49菌株的降碱能力

将OD

η

式中：η

pH

pH

Bachu 49菌株降碱实验结果如表4所示。说明Bachu49菌株具有优异的降碱能力，能有效改善盐碱地的土壤性质，从而降低碱对植物造成的胁迫，帮助植物适应盐碱地环境。

表4 Bachu 49菌株的降碱实验结果

二、Bachu 49菌株的降盐能力

本部分利用AgNO

记录AgNO

计算公式：C2 =（C1×V1）/ V2

式中：C1为AgNO

V1为滴定时消耗AgNO

V2为滴定时菌液的体积，mL；

根据Cl

计算公式: η盐= (C2最高－C2最低)/C2 最高×100%

式中：η盐为菌株降盐能力

C2最高为培养基中Cl

C2最低为培养基中Cl

Alkalibacterium

表5 Bachu 49菌株降盐率结果平均值

综合一、二的结果，所述菌株Bachu 49可以有效改善盐碱地土壤性质，从而降低盐碱条件对植物的胁迫，帮助植物适应盐碱地环境。

三、Bachu 49菌株的固氮能力

本部分利用的功能鉴定培养基为阿须贝无氮培养基（gL）：磷酸二氢钾0.2g，葡萄糖10g，七水合硫酸镁0.2g，硫酸钙0.1g，氯化钠75g，碳酸钙5.0g，琼脂粉16g，去离子水1L，pH值7.0-7.2。

配置阿须贝无氮培养基，高压蒸汽灭菌 115℃ 30 min ，用移液器吸取5μL Bachu49菌液，将Bachu 49 菌株接种于上述阿须贝无氮培养基平板上，放入30℃恒温培养箱倒置培养8-9天，观察菌株的生长情况，其结果如图5所示，Bachu49 菌株可以在培养基上生长，证明Bachu 49菌株具有固氮能力，通过固氮作用可以提高土壤的肥力，从而促进植物的生长。

四、Bachu 49菌株的解磷功能

配置蒙金娜培养基，高压蒸汽灭菌121℃ 20 min，后使用移液器吸取5μLBachu 49菌液，将Bachu 49接种在上述培养基平板上，放入 30℃恒温培养箱中倒置培养8-9天，观察发现Bachu 49菌落周围能够产生透明圈，如图6所示，其解磷圈直径D为20.26mm，菌落直径d为9.59mm，D/d为2.1，证明Bachu49具有较强的解有机磷能力。Bachu 49菌株的解磷功能可以将土壤中植物不能利用的磷元素转变成可利用的磷元素，从而给植物提供充足的磷元素，最终帮助植物生长。

五、Bachu 49菌株的产IAA能力

在测定Bachu 49菌株的产IAA能力之前，需要绘制IAA的标准曲线：首先准确称取10mg IAA标准品，先使用少量无水乙醇使其溶解，接着用蒸馏水定容至100mL，制成100μg/mL的IAA母液，然后按照比例依次稀释成10、20、30、40、50 μg/mL的标准液。分别取上述标准液2mL按顺序加入到6只试管中，再分别加入2 mL Salkowski显色液，放置在避光处反应30min。再用分光光度计测量记录530nm处的吸光度，即A

将纯化的 Bachu 49菌株接种于含有L-色氨酸的LB液体培养基中，置于30℃恒温摇床180r/min震荡培养；然后吸取菌株Bachu 49菌株的菌悬液放入离心管，14000 rcf离心10 min，再取上清液加入等体积的Salkowski显色液，放置在避光处反应30 min，等待红色的显色反应。对菌株Bachu 49菌株进行三次平行实验，测定波长在530nm处的吸光值，通过标准曲线的回归方程推算出产IAA的浓度，结果如表6以及图8所示。定量分析结果表明，在第7d，Bachu49发酵液中IAA含量达到最高值，每毫升Bachu 49菌株发酵液中含有8.141485μg IAA，Bachu 49菌株具有分泌IAA的能力，产生的IAA可以促进植物的生长。

表6 Bachu 49菌株产IAA的实验结果

六、Bachu 49菌株的产过氧化氢酶能力

本部分实验是利用一种过氧化氢酶试剂盒开展的，所述试剂盒购自海博生物技术有限公司的。将Bachu 49菌株接种于液体LB培养基中，至菌液OD

七、Bachu 49菌株的产挥发性酸性物质能力

中性红指示剂在碱性条件下呈橘色，酸性呈红色。向隔离培养皿两侧加入含有中性红指示剂的LB固体培养基，一侧接种菌株Bachu 49，一侧不接菌。30℃倒置培养48h后，接种了Bachu 49的培养皿变红（图9A），说明菌株Bachu 49产生了挥发性酸性物质。再将培养基敞口放置24h，培养基变回橘色（图9B），而未敞口放置的培养基仍为红色（图9C），进一步说明菌株Bachu 49可以产生挥发性酸性物质。Bachu 49菌株产生的这些挥发性酸性物质可以调节局部的土壤pH值，缓解高碱对植物造成的胁迫，促进植物生长。

实施例 4 非盐碱胁迫条件下Bachu 49菌株对玉米的促生作用

（1）菌悬液的配置：将Bachu 49菌株接种于液体LB培养基中，置于恒温震荡摇床20~30℃，150~200 r/min 培养，待菌液浓度为50~200CFU/mL时将菌液用水稀释10倍制成菌悬液。

（2）玉米苗的培养：将营养土和蛭石1:1混合均匀，置于高压蒸汽灭菌121 ℃，20min条件灭菌，处理组和对照组灭菌土壤均加入自来水搅拌均匀，然后将土壤分装到花盆中。在每个花盆中均匀播种5粒饱满、大小一致的玉米种子，播种深度约1cm，每个处理设10个重复。

（3）后期适时适量浇灭菌去离子水，务必保持每个花盆浇水量一致。每隔一周对实验组施加 5 mL 制备好的菌悬液，对照组施加 5 mL 灭菌去离子；

培养14d后，将玉米根系用水清洗干净，测量并记录地上鲜重与地下鲜重等指标，具体实验结果如表7所示：

表7 Bachu 49菌株对玉米的促生结果

由表7可知，接种了Bachu 49菌悬液后，玉米的地上鲜重和地下鲜重均明显高于对照组，地上鲜重相较于对照组增加了54.21%，地下鲜重相较于对照组增加了55.61%，说明Bachu 49菌株在非盐碱胁迫条件下对玉米具有显著的促生作用。

实施例 5 盐碱胁迫条件下Bachu 49菌株对玉米的促生作用

（1）玉米的盐碱耐受程度确定：

为了确定盆栽试验时选定的盐浓度，观察在不同盐浓度胁迫情况下玉米植株的生长情况。

实验设置 11 种盐浓度的处理，分别为 0 g/kg、5g/kg、10 g/kg、15 g/kg、20 g/kg、25g/kg、30 g/kg、35 g/kg、40 g/kg。试验结果显示，当盐浓度达到15 g/kg和30 g/kg时，对玉米种子的萌发和幼苗生长产生明显变化，最后确定15 g/k和30 g/kg作为后续试验中的盐胁迫浓度。

（2）菌悬液的配置：将 Bachu 49菌株接种于LB液体培养基中，置于恒温震荡摇床20~30℃，150~200 r/min 培养，待菌液浓度为50~200CFU/mL时将菌液用水稀释10倍制成菌悬液。

（3）玉米苗的培养：将营养土和蛭石1:1混合均匀，置于高压蒸汽灭菌121 ℃，20min条件灭菌，处理组灭菌土壤分别加入15g/kg和30g/kg盐碱混合液搅拌均匀，对照组灭菌土壤则加入自来水搅拌均匀，然后将土壤分装到花盆中。在每个花盆中均匀播种5粒饱满、大小一致的玉米种子，播种深度约1cm，每个处理设10个重复。

（4）接种方法：在步骤（2）的基础上，待玉米长出两片叶子时，对处理组施加5mL制备好的 Bachu 49菌悬液，对照组则施加5mL灭菌去离子水。

（5）后期适时适量浇灭菌去离子水，务必保持每个花盆浇水量一致。每隔一周对实验组施加 5 mL 制备好的 Bachu 49菌悬液，对照组施加 5 mL 灭菌去离子；

培养14d后，将玉米根系用水清洗干净，测量并记录地上鲜重与地下鲜重等指标，具体实验结果如表8所示：

表8 盐碱胁迫下Bachu 49菌株的促生实验结果

由表8可知，接种了Bachu 49菌株后，玉米的地上鲜重和地下鲜重均明显高于对照组。其中，在盐碱混合液15g/kg的条件下，地上鲜重相较于对照组增加了30.28%，地下鲜重相较于对照组增加了2.03%；在盐碱混合液30g/kg的条件下，地上鲜重相较于对照组增加了43.4%，地下鲜重相较于对照组增加了26.3%。图10是Bachu49菌株对玉米盆栽苗的促生结果图，其中A为不加土壤盐碱混合液、B为土壤盐碱混合液15g/kg、C为土壤盐碱混合液30g/kg，图中明显可见接种菌液的玉米长势优于对照组。综上，在盐碱胁迫下，所述菌株Bachu 49可以显著促进玉米幼苗的生长。

实施例 6 在盐碱胁迫下 Bachu 49菌株对拟南芥的促生作用

（1）制备盐碱培养基：本部分共设置5种盐碱胁迫条件，分别为pH 5.8、pH 8.0、pH8.0+100 mM NaCl、pH 8.0+2 mM NaHCO

（2）培养5d后，测量并记录拟南芥的鲜重、根长等生理指标。结果显示，在pH=8.0+2mM NaHCO

实施例 7 包含嗜盐嗜碱菌Bachu 49的菌剂

利用上述实施例1提供的嗜盐嗜碱菌Bachu 49的液体培养物。所述的Bachu 49的液体菌剂中的助剂包括甘油、海藻糖、氨基酸、蛋白质、多糖、氯化钠、γ-聚谷氨酸、十二烷基苯磺酸钠、酵母膏、醇、腐殖酸钾、甲壳素的一种或多种。所述固体载体包括泥炭、褐煤、蒙脱土、硅石、蛭石、高岭土、硅藻土、麦饭石、藻酸盐中的一种或多种。

利用上述提供的Bachu 49的液体菌剂，还包含无机肥、微生物菌剂中一种或多种。

本发明提供的嗜盐嗜碱菌（

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。