一株耐盐栓孔菌CGM001及其提高植物耐盐性中的应用

技术领域

本发明涉及微生物菌剂及其应用的技术领域，具体涉及一株耐盐栓孔菌CGM001及其提高植物耐盐性中的应用。

背景技术

土地盐碱化是当前最严重的农业问题之一，我国各类盐碱地总面积已达9913万公顷，并不断增长。盐碱土壤的渗透力和水力传导能力较低，极易形成板结现象，并阻碍幼苗的生根和出苗。在植物的生长季，盐碱土水分流失会降低植物吸水能力，引起植物体内生理干旱，产生离子毒害作用，阻碍植物对养分元素的吸收，造成植物营养失调、代谢紊乱，导致植物生长性能降低和草地生产力下降。

紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是一种多年生豆科草本。因其营养丰富、品质良好，紫花苜蓿常作为饲料与牧草，被全球各地广泛引种栽培，是重要的经济作物。土壤盐碱化危害着紫花苜蓿生长，影响紫花苜蓿对于水分和营养物质的吸收，导致其产量大幅降低。

现如今的盐碱地改良技术，主要以生物技术方法为主，如微生物改良、植物修复和植物-微生物联合改良。生物技术方法可持续性和环境友好性，越来越多地应用于盐碱地土壤改良。作为植物和土壤的枢纽，微生物一方面通过分泌有机物影响土壤性质和植物生长，另一方面土壤理化性质和植物生长又对微生物的生长起到调控作用。

栓孔菌为真菌的一种，具有独特的菌丝和细胞壁结构，对环境干扰具有高度抗性，在实际生产中更占优势。因此，利用耐盐栓孔菌在盐碱地改良和促进植物生长方面具有巨大的应用潜力。

发明内容

本发明的首要目的在于提供一株耐盐栓孔菌(Trametes sp.)CGM001，所述栓孔菌CGM001于2023年5月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号CGMCC NO.40585。

本发明的第二目的是提供一种微生物菌剂，其特征在于，采用所述的耐盐栓孔菌CGM001制备。

本发明的第三目的是提供所述的耐盐栓孔菌CGM001或所述的微生物菌剂促进植物在盐碱胁迫下生长中的应用。

优选的，所述的植物为紫花苜蓿。

本发明的第四目的是提供所述的耐盐栓孔菌CGM001或所述的微生物菌剂在盐碱土地改良中的应用。

本发明的第五目的是提供一种植物耐盐碱的促生剂，所述的促生剂以所述的耐盐栓孔菌CGM001为活性成分。

本发明的第六目的是提供一种在盐碱环境下促进植物生长的方法，将所述的微生物菌剂或所述的促生剂施加至土壤中。

本发明的有益效果是：本发明提供了一株耐盐栓孔菌CGM001，所述栓孔菌CGM001于2023年5月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号CGMCCNO.40585。。在盐碱胁迫下，所述的耐盐栓孔菌CGM001可显著促进紫花苜蓿的种子萌发和幼苗生长。对于促进盐碱胁迫下植物生长具有显著的效果，也可用于盐碱土地的改良，降低盐碱胁迫对植物的毒害作用，具有较高的应用价值。

附图说明

图1为本发明的耐盐栓孔菌CGM001的耐盐能力

图2在盐碱条件下，不同添加浓度的耐盐栓孔菌CGM001对紫花苜蓿种子发芽和幼苗生长的影响

图3为本发明的耐盐栓孔菌CGM001添加至盐碱土壤后紫花苜蓿的生长实况。

图4为本发明中耐盐栓孔菌CGM001添加至盐碱土壤后紫花苜蓿的生长指标。

具体实施方法

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

以下实施例中，察氏一号培养基的配方为：硝酸钠3g/L、硝酸氢二钾1g/L、硫酸镁0.5g/L硫酸亚铁0.01g/L、蔗糖30g/L、琼脂15g/L、蒸馏水。

实施例1、菌株的分离及鉴定

称取天津滨海盐碱土8.00g置于150ml三角瓶中，加入80ml无菌生理盐水(质量比1：10)，室温下涡旋振荡30min，振荡后静置20min。然后用无菌生理盐水依次稀释10，100倍，制成3个浓度的样品悬浮液。

将察氏一号培养基配制灭菌后，适量(15mL)倒入培养皿，待其凝固，每个梯度取50μL菌悬液涂布在固体培养基上，设3个平行，28℃培养5d后。对平板上的代表性菌种进行纯化，将其划线接种在相同的培养基平板上，分离纯化。直至获得单个的纯菌落。

菌株鉴定：用引物ITS1-F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)/ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)扩增CGM001菌株ITS区域，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。PCR产物送至科美诊断技术股份有限公司进行基因测序。菌株的ITS序列如SEQ IDNO.1所示。

将得到的基因序列在NCBI数据库中用BLAST工具进行同源序列(rRNA/ITS数据库)比对，结果如图1所示。在数据库中序列同源性最高的菌株为Trametes versicolorCFMRFP-135156-sp，其同源性为92.90％。

根据比对结果，筛选得到的菌株为新的栓菌属栓孔菌，拉丁名为：Trametes sp.，命名为栓孔菌(Trametes sp.)CGM001，并将其于2023年5月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号CGMCC NO.40585。保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，电话为：010-64807355，传真：010-64807288；电子邮件：cgmcc@im.ac.cn。

以下实施例中，将栓孔菌(Trametes sp.)CGM001简称为栓孔菌CGM001。

实施例2、栓孔菌CGM001的耐盐能力研究

在察氏一号培养基中添加不同质量的NaCl，设定NaCl的初始浓度梯度分别为0.3％、0.6％、1％、2％和3％(质量分数)。

菌株活化：在活化培养基(硫酸镁0.75g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖5g/L，蔗糖10g/L，麸皮10g/L)中接栓孔菌CGM00115％，28℃，180r/min摇床培养3d。

将活化后的菌液以3％的接种量接种到不同NaCl浓度梯度的培养基中，每个盐梯度设置3个重复培养。在28℃，避光条件下培养72h。72h后观察培养基表面菌株生长状况，代表菌株在不同含盐量条件下的生长情况。

测定结果：菌株在不同含盐量条件下的生长情况如图2所示。在28℃的条件下，在不同NaCl含量的察氏一号培养基中，耐盐栓孔菌CGM001的生长情况即培养皿表面生长面积随着NaCl含量增加呈增加趋势，表现出较好的耐盐性。

实施例3、栓孔菌CGM001促进紫花苜蓿耐盐碱的发芽试验

紫花苜蓿品种中兰1号种子购自甘肃创绿草工业科技有限公司。实验前用75％乙醇和5％次氯酸钠溶液对种子进行表面消毒。在含有30mmol/LNaCl和30mmol/LNaHCO

结果如图3所示，随着菌液浓度的增加，苜蓿的种子发芽率、鲜重和功能性状均呈上升趋势，除种子发芽率外，在5％浓度下趋于稳定。高浓度(7.5％和10％)下，发芽率略有下降。发芽率、芽长和鲜重在5％浓度下达到最大值，发芽率比对照提高34％，鲜重提高25％，根长提高133％，芽长提高61％，茎粗提高8％，单株叶片数提高32％。实验结果表明，在盐碱胁迫下，添加菌液可显著促进紫花苜蓿的种子萌发和幼苗生长。

实施例4、栓孔菌CGM001促进紫花苜蓿在盐碱土壤生长的应用

以紫花苜蓿“中兰1号”为植物材料，将种子消毒后置于蒸馏水中待其吸胀，24h后将种子转移至含有1kg盐碱土壤(含盐量为1.2％)的花盆中。

液体菌剂为耐盐栓孔菌CGM001以接种量为15％接种到活化培养基(硫酸镁0.75g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖5g/L，蔗糖10g/L，麸皮10g/L。)，28℃培养7d后，由600目筛绢过滤得到。每个处理6个花盆，每个花盆种植20粒吸胀的种子，并从底部托盘浇水至土壤完全湿润，待种子发芽。种子发芽后，添加活性菌剂的处理，每15d浇一次活性菌剂，浇至花盆托盘；添加灭活菌剂的处理，每15d浇一次经121℃，20min高压蒸汽灭菌的灭活菌剂；保持添加菌剂量相同。除此之外，每2d浇一次水，浇至花盆托盘，保持浇水量相同，在第60d，收集植物样品进行测量和分析。

紫花苜蓿植物指标测定，盆栽结束后，从每个花盆中取出所有株植物，将所有株植物进行高度、根长、茎粗和分枝数的测定。测定后将所有植株分为地上地下两部分，分别测量植物单株地上生物量和地下生物量。

结果如图4和图5所示，除分枝数外，活性菌剂的处理对紫花苜蓿的地上生物量、地下生物量、高度、根长、茎粗均显著增加，这与活性菌剂的处理对茎粗和高度的影响一致。添加活性菌剂的处理，单株平均地上生物量为0.428g，相比对照增加了119％，相比灭活菌剂增加了45％。地下生物量比对照提高82％，高度提高82％，根长提高30％，茎粗提高116％。实验结果表明，在盐碱胁迫下，添加活性菌剂可显著促进紫花苜蓿的生长和产量。

综上所述，本发明提供了一株耐盐栓孔菌CGM001，所述栓孔菌CGM001于2023年5月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号CGMCCNO.40585。。在盐碱胁迫下，所述的耐盐栓孔菌CGM001可显著促进紫花苜蓿的种子萌发和幼苗生长。对于促进盐碱胁迫下植物生长具有显著的效果，也可用于盐碱土地的改良，降低盐碱胁迫对植物的毒害作用，具有较高的应用价值。