扩增T细胞群的方法

相关申请的交叉引用

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背景技术

通过遗传修饰产生肿瘤特异性T淋巴细胞以表达嵌合抗原受体(CAR)，这作为能够产生强大的抗肿瘤作用的合成生物学的一种形式越来越受到关注(Jena等人，2010，Blood[血液].116：1035-1044；Bonini等人，2011，Biol Blood Marrow Transplant[血液和骨髓移植生物学]17(1增刊)：S15-20；Restifo等人，2012，Nat Rev Immunol[自然免疫学评论]12：269-281；Kohn等人，2011，Mol Ther[分子治疗]19：432-438；Savoldo等人，2011，J ClinInvest[临床研究杂志]121：1822-1825；Ertl等人，2011，Cancer Res[癌症研究]71：3175-3181)。由于特异性是由抗体片段赋予的，因此CAR-T细胞不受MHC限制，因此比基于需要MHC匹配的T细胞受体的方法更实用。

因此，CAR-T细胞疗法代表了个性化癌症治疗的重大进步。在该策略中，患者自身的T细胞经过遗传工程改造以表达结合肿瘤抗原的合成受体。然后，CAR-T细胞被扩增用于临床，并回输到患者体内，以攻击和消灭化疗耐药的癌症。在B细胞恶性肿瘤的CAR-T细胞疗法中观察到显著的临床反应和高完全缓解率。这导致FDA最近批准了两项针对CD19蛋白的CAR-T细胞用于治疗急性淋巴母细胞性白血病和弥漫性大B细胞淋巴瘤。因此，CAR-T细胞可以说是合成生物学和个性化细胞癌症疗法率先商业化的成功示例之一。

尽管CAR-T细胞疗法最近取得了成功，但本领域仍然需要更好地改进T细胞扩增方法。

发明内容

本披露涉及一种扩增T细胞群的方法，该方法包括：(a)从样品中分离CD3+T细胞；(b)在包含人白细胞介素21(IL-21)的培养基中培养这些CD3+T细胞；(c)激活这些CD3+T细胞；(d)用包含编码嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的核酸的载体转导这些CD3+T细胞以产生CAR-T细胞或T细胞受体(TCR)细胞；(e)在培养基中培养这些CAR-T细胞；以及(f)收获这些CAR-T细胞或T细胞受体(TCR)细胞。本披露还涉及一种制造T细胞治疗剂的方法，该方法包括：(a)获得包含CD3+T细胞群的样品；(b)在包含人白细胞介素21(IL-21)的培养基中培养这些CD3+T细胞；(c)激活这些CD3+T细胞；(d)用包含编码嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的核酸的载体转导这些CD3+T细胞以产生CAR-T细胞或T细胞受体(TCR)细胞；(e)在培养基中培养这些CAR-T细胞或T细胞受体(TCR)细胞；以及(f)收获这些CAR-T细胞或T细胞受体(TCR)细胞。本披露还涉及一种扩增T细胞群的方法，该方法包括：(a)从样品中分离CD4+和CD8+T细胞以形成CD3+T细胞群；(b)在含有人白细胞介素21(IL-21)的培养基中培养这些CD3+T细胞；(c)激活这些CD3+T细胞；(d)用包含编码嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的核酸的载体转导这些CD3+T细胞以产生CAR-T细胞或T细胞受体(TCR)细胞；(e)在培养基中培养这些CAR-T细胞或T细胞受体(TCR)细胞；以及(f)收获这些CAR-T细胞或T细胞受体(TCR)细胞。在一些方面，培养基进一步包含人白细胞介素2(IL-2)。

在一些方面，部分(d)包括用包含编码CAR的核酸的载体转导CD3+T细胞以产生CAR-T细胞。在一些方面，部分(d)包括用包含编码TCR的核酸的载体转导CD3+T细胞以产生TCR细胞。在一些方面，在步骤(b)中在培养基中培养约1x10

在一些方面，通过阳性选择分离CD4+和CD8+T细胞。在一些方面，载体是病毒、慢病毒、腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒(AAV)、转座子、DNA载体、mRNA、脂质纳米颗粒(LNP)或CRISPR-Cas系统。在一些方面，载体是慢病毒。在一些方面，慢病毒以约0.25至约20的感染复数(MOI)添加。在一些方面，慢病毒以约1至约4的MOI添加。在一些方面，慢病毒以约2或约4的MOI添加。在一些方面，在步骤(d)之后细胞培养基的体积增加。在一些方面，细胞培养基的体积增加至少6倍。

在一些方面，步骤(e)中的培养基每天至少更换一次。在一些方面，步骤(e)中的培养基每12小时更换。在一些方面，CAR-T细胞或TCR细胞在步骤(e)期间扩增至少约1倍至约5倍。在一些方面，CAR-T细胞或TCR细胞在步骤(e)期间扩增至少约1倍至约3倍。在一些方面，CAR-T细胞或TCR细胞在步骤(e)期间扩增约2倍。在一些方面，CAR-T细胞或TCR细胞在步骤(e)期间扩增约3倍。在一些方面，CAR结合STEAP2或磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)。在一些方面，CAR编码结合STEAP2的抗原结合结构域，并且其中该抗原结合结构域包含：

(a)包含SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列的VL-CDR1，包含SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的VL-CDR2，包含SEQ ID NO：3中所示氨基酸序列的VL-CDR3，包含SEQ ID NO：4中所示氨基酸序列的VH-CDR1，包含SEQ ID NO：5中所示氨基酸序列的VH-CDR2，包含SEQ ID NO：6中所示氨基酸序列的VH-CDR3；

(b)包含SEQ ID NO：11中所示氨基酸序列的VL-CDR1，包含SEQ ID NO：12中所示氨基酸序列的VL-CDR2，包含SEQ ID NO：13中所示氨基酸序列的VL-CDR3，包含SEQ ID NO：14中所示氨基酸序列的VH-CDR1，包含SEQ ID NO：15中所示氨基酸序列的VH-CDR2，包含SEQID NO：16中所示氨基酸序列的VH-CDR3；

(c)包含SEQ ID NO：21中所示氨基酸序列的VL-CDR1，包含SEQ ID NO：22中所示氨基酸序列的VL-CDR2，包含SEQ ID NO：23中所示氨基酸序列的VL-CDR3，包含SEQ ID NO：24中所示氨基酸序列的VH-CDR1，包含SEQ ID NO：25中所示氨基酸序列的VH-CDR2，包含SEQID NO：26中所示氨基酸序列的VH-CDR3；

(d)包含SEQ ID NO：31中所示氨基酸序列的VL-CDR1，包含SEQ ID NO：32中所示氨基酸序列的VL-CDR2，包含SEQ ID NO：33中所示氨基酸序列的VL-CDR3，包含SEQ ID NO：34中所示氨基酸序列的VH-CDR1，包含SEQ ID NO：35中所示氨基酸序列的VH-CDR2，包含SEQID NO：36中所示氨基酸序列的VH-CDR3；或

(e)包含SEQ ID NO：41中所示氨基酸序列的VL-CDR1，包含SEQ ID NO：42中所示氨基酸序列的VL-CDR2，包含SEQ ID NO：43中所示氨基酸序列的VL-CDR3，包含SEQ ID NO：44中所示氨基酸序列的VH-CDR1，包含SEQ ID NO：45中所示氨基酸序列的VH-CDR2，包含SEQID NO：46中所示氨基酸序列的VH-CDR3。在一些方面，CAR包含与SEQ ID NO：9中所示氨基酸序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，CAR编码结合GPC3的抗原结合结构域，并且其中该抗原结合结构域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中该VH包含含有SEQ ID NO：112的氨基酸序列的CDR1、含有SEQID NO：113的氨基酸序列的CDR2、以及含有SEQ ID NO：114的氨基酸序列的CDR3，并且其中该VL包含含有SEQ ID NO：115或SEQ ID NO：118的氨基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO：116或SEQ ID NO：119的氨基酸序列的CDR2、以及含有SEQ ID NO：117或SEQ ID NO：120的氨基酸序列的CDR3。在一些方面，该VH包含SEQ ID NO：108或SEQ ID NO：110的氨基酸序列，并且该VL包含SEQ ID NO：109或SEQ ID NO：111的氨基酸序列。在一些方面，核酸还编码装甲分子。

在一些方面，装甲分子包含显性负性2型TGFβ受体(TGFβRIIDN)。在一些方面，装甲分子包含与SEQ ID NO：105中所示氨基酸序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，装甲分子包含SEQ ID NO：105中所示的氨基酸序列。在一些方面，CAR-T细胞或TCR细胞配制在等渗溶液中。在一些方面，等渗溶液包含含有人血清白蛋白的醋酸钠林格氏液(plasmalyte)。在一些方面，等渗溶液含有约1x10

在一些方面，CAR-T细胞或TCR细胞具有高于100pmol/min的耗氧速率(OCR)。在一些方面，CAR-T细胞或TCR细胞具有约50pmol/min至约200pmol/min的OCR。在一些方面，CAR-T细胞或TCR细胞具有高于30mpH/min的胞外酸化速率(ECAR)。在一些方面，CAR-T细胞或TCR细胞具有约30mpH/min至约60mpH/min的ECAR。

附图说明

图1A-1D显示在单独IL-10或IL-21中扩增的GPC3 CAR-T细胞的激活程度低于IL-2。图1C-1D显示在单独IL-21存在的情况下，细胞富集CAR

图2A-2F。图2A-2B显示GPC3 CAR-T细胞在仅补充IL-2、或仅补充IL-21、或补充IL-2和IL-21的组合的细胞培养基中扩增8天的细胞生长(群倍增时间)和细胞活力相似。图2C和2D显示在仅补充IL-21或补充IL-2和IL-21的组合的细胞培养基中扩增的CD4和CD8GPC3CAR-T细胞的分化程度低于仅补充IL-2。图2E和2F显示，当在仅补充IL-2或补充IL-2和IL-21的组合的培养基中培养时，GPC3 CAR-T细胞能够在第8天至第13天后进一步稳健扩增。

图3A-3F。图3A-3B显示对于在仅补充IL-2、或仅补充IL-21、或补充浓度范围为2-10ng/mL的IL-21和浓度范围为25至100IU/mL的IL-2的组合的细胞培养基中扩增8天的GPC3CAR-T细胞，细胞生长(群倍增时间)和细胞活力相似。图3C显示不同IL-2和IL-21浓度之间CD4和CD8 T细胞中GPC3 CAR+细胞的百分比相似。图3D和3F显示高IL-2浓度(>＝50IU/mL)将掩盖IL-21对GPC3 CAR-T细胞的作用。图3F显示低IL-2浓度(25IU/mL)与IL-21一起可以在GPC3 CAR-T细胞扩增期间富集CD8 T细胞。

图4A-4B显示使用表达STEAP2和GPC3的CAR-T细胞的1x10

图5A-5B显示使用表达STEAP2和GPC3的CAR-T细胞的1x10

图6A-6B显示4天的SMART生物生产过程一致地产生30％CAR+细胞的最小目标。

图7A-7B显示4天SMART生物生产过程能够一致地产生400x10

图8A-8B显示4天SMART过程生产高纯度的CD3+T细胞，表达STEP2和GPC3的CAR-T细胞的纯度均大于98％。

图9A-9C显示STEAP2 CAR表达百分比和TGFβRII装甲表达。图9A-9B显示第4天处理的细胞中高水平的CAR表达和TGFβRII。第4天的细胞显示出CAR和TGFβRII表达之间的线性相关性。图9C显示第4天处理的细胞中的GPC3 CAR表达百分比。

图10显示活CAR+T细胞的分化谱，并显示中央记忆(T

图11A-11B显示活CAR+T细胞的激活和耗竭谱。CAR+T细胞显示增加的晚期激活(CD25+)，与第4天收获的细胞相比，第6天收获的细胞的晚期激活减少(图11A)。表达耗竭标志物的细胞百分比对于PD1/LAG3/Tim3双阳性小于4％，三阳性小于1％(图11B)。

图12A-12B显示STEAP2(图12A)和GPC3(图12B)CAR

图13A-13B显示通过将STEAP2(图13A)或GPC3(图13B)CAR-T细胞与表达靶标的细胞以E∶T比率1∶2共培养而靶标激活后的IFN-γ、TNF-α和IL-2细胞因子释放。在第4天或第6天收获的细胞之间释放的细胞因子显示于图13A中。

图14A-14E显示SMART GPC3-CAR+T细胞表现出更高的干性标志物表达和效应子功能。此外，SMART细胞显示较低的T细胞耗竭标志物。

图15A-15D显示OCR随时间变化的示意图。基础呼吸是细胞在基线条件下的能量需求；最大呼吸：呼吸链以最大能力运行→细胞可以达到的最大呼吸速率；和备用呼吸能力(SRC)：细胞响应能量需求或应激的能力→细胞适应度指标ΔOCR＝OCR

图16A-16D显示ECAR的示意图。糖酵解是静息状态下葡萄糖消耗的速率；糖酵解能力是氧化磷酸化关闭后的最大胞外酸化(ECAR)速率→细胞使用糖酵解至其最大能力；并且糖酵解储备是细胞响应能量需求或应激的糖酵解能力。图16A-16D显示4天的SMART CAR-T细胞比12天的TNT CAR-T细胞具有更高的糖酵解储备，表明进行糖酵解以响应能量需求的能力增加。

图17A-17B显示SMART STEAP2-CAR+T细胞在第4天表现出更大程度的CAR表达。

图18A-18E显示在连续杀伤测定中SMART GPC3-CAR+T细胞增加了效应细胞因子(图18A)IFN-γ；(图18B)IL-2；和(图18C)的IL-21的抗原特异性分泌。图18D-18E显示，与传统(TNT)过程相比，SMART GPC3 CAR在两个不同供体中在连续杀伤测定中显示出增强的肿瘤控制和增加的扩增水平。

图19A-19E显示GPC-3SMART CAR

图20A-20B显示与健康供体(A)相比，前列腺癌(B)在细胞扩增期间保留了CD4/CD8比率。

图21A-21B显示前列腺癌STEAP2 CAR-T细胞分化程度较低，如CD62L/CD45RO表达所示。

图22显示施用SMART CAR-T对NSG小鼠模型中肿瘤体积的体内功效。

图23显示与传统12天过程CAR-T相比，施用SMART CAR-T对NSG MHC 1/2类敲除小鼠模型中肿瘤体积的体内功效，以最小化GvHD。

图24A-24D显示4天的SMART CAR-T比11天的TNT CAR-T具有更高的SRC。

图25A-25D显示与11天的TNT CAR-T细胞相比，较高浓度的羰基氰-4(，三氟甲氧基)苯基腙(FCCP)导致4天的SMART CAR-T细胞中OCR能力的更大增加。

图26A-26D显示与第11天的TNT CAR-T细胞相比，4天的SMART CAR-T细胞具有增加的糖酵解、糖酵解能力和糖酵解储备。

具体实施方式

本披露涉及用嵌合抗原受体(CAR)转导的T细胞的培养方法，其产生表现出增加的抗原非依赖性激活的持续T细胞群。

为了更容易地理解本披露，首先定义某些术语。如本说明书中所用，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下文所述的含义。另外的定义在整个说明书中阐述。

应当注意，术语“一个/种(a或an)”是指一个/种或多个/种该实体；例如，“一个补料培养基”被理解为代表一个或多个补料培养基。因此，术语“一个/种(a或an)”、“一个/种或多个/种”和“至少一个/种”在本文中可互换地使用。

术语“和/或”在本文使用时应当被看作在有或没有另一者的情况下，两个指定的特征或组分中的每一者的特定披露。因此，如在本文中在诸如“A和/或B”的短语中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)、以及“B”(单独)。同样，如在短语诸如“A、B和/或C”中所用的术语“和/或”旨在涵盖以下每个方面：A、B、和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。

应当理解，无论在什么情况下在本文中用语言“包含”描述方面时，还提供了关于“由......组成”和/或“基本上由......组成”描述的其他类似方面。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有如本披露所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。例如，Concise Dictionary of Biomedicine andMolecular Biology[简明生物医学和分子生物学词典]，Juo，Pei-Show，第2版，2002，CRCPress[CRC出版社]；Dictionary of Cell and Molecular Biology[细胞和分子生物学词典]，第3版，1999，Academic Press[学术出版社]；以及Oxford Dictionary OfBiochemistry And Molecular Biology[生物化学和分子生物学牛津词典]，修订版，2000，Oxford University Press[牛津大学出版社]为技术人员提供在本披露中使用的术语中的许多术语的通用词典注释。

单位、前缀和符号是以它们的国际单位系统(Système International deUnites)(SI)接受的形式表示。数值范围包括限定该范围的数字。本文提供的标题不是本披露的不同方面的限制，可以通过作为一个整体参考本说明书来获得这些方面。因此，通过以其全文参考说明书，更充分地定义了紧接着在下文中定义的术语。

使用可选方案(例如，“或”)应理解为意指可选方案中的一者、两者或其任何组合。如本文所用，不定冠词“一个/种(a/an)”应理解为是指代任何所描述或列举的组分中的“一个/种或多个/种”。

术语“约”或“基本上包括”是指在如由本领域普通技术人员所确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，这将部分取决于如何测量或确定该值或组成，即，测量系统的局限性。例如，根据本领域的实践，“约”或“基本上包括”可以意指在1个或大于1个标准偏差内。可替代地，“约”或“基本上包含”可以表示高达±10％的范围。此外，特别是关于生物系统或过程，这些术语可以意指高达一个数量级或高达5倍的值。当在本申请和权利要求中提供特定值或组成时，除非另有说明，否则应当假定“约”或“基本上包括”的含义在该特定值或组成的可接受的误差范围内。

如本文所述，除非另有指示，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括所述范围内的任何整数的值，并且在适当时包括其分数(如整数的十分之一和百分之一)。

术语“T细胞”或“T淋巴细胞”是本领域公认的并且旨在包括胸腺细胞、初始T淋巴细胞、未成熟T淋巴细胞、成熟T淋巴细胞、静息T淋巴细胞或激活的T淋巴细胞。T细胞可以是T辅助(Th)细胞，例如T辅助1(Th1)或T辅助2(Th2)细胞。T细胞可以是辅助T细胞(HTL；CD4

如本文所用，术语“增殖”是指细胞分裂的增加，细胞的对称或不对称分裂。在特定方面，“增殖”是指T细胞的对称或不对称分裂。当处理的样品中的细胞数量与未处理的样品中的细胞相比增加时，就会发生“增殖增加”。

本发明方法中的术语“扩增”是指增加细胞培养物中细胞数量的过程。在扩增步骤中，在一方面根据补料方案，定期补料细胞并更换培养基。在特定补料方案中添加培养基的具体时间和量将取决于培养物中的细胞数量和代谢物水平。

如本文所用，术语“分化”是指降低细胞的效力或增殖或使细胞进入发育更受限状态的方法。在特定方面，分化的T细胞获得免疫效应细胞功能。

“免疫效应细胞”是具有一种或多种效应子功能(例如，细胞毒性细胞杀伤活性、细胞因子的分泌、ADCC和/或CDC的诱导)的免疫系统的任何细胞。本文考虑的示例性免疫效应细胞是T淋巴细胞，特别是细胞毒性T细胞(CTL；CD8

“经修饰的T细胞”是指已经通过引入编码本文考虑的工程改造的CAR的多核苷酸而经修饰的T细胞。经修饰的T细胞包括遗传修饰和非遗传修饰(例如附加型或染色体外)。

如本文所用，术语“经遗传工程改造的”或“经遗传修饰的”是指将DNA或RNA形式的额外遗传物质添加到细胞中的总遗传物质中。

术语“经遗传修饰的细胞”、“经修饰的细胞”和“经重定向的细胞”可互换使用。

本文所用的术语“基因疗法”是指将DNA或RNA形式的额外遗传物质引入细胞中的总遗传物质中，以恢复、纠正或修饰基因的表达，或用于以下目的：表达治疗性多肽，例如CAR和/或一个或多个细胞因子。在特定方面，T细胞被修饰以表达工程改造的TCR或CAR而不修饰细胞的基因组，例如通过将表达CAR的附加型载体引入细胞中。

如本文所用，“嵌合抗原受体(CAR)”是指融合蛋白，该融合蛋白包含能够结合预定抗原的胞外结构域、含有一个或多个胞质结构域(其衍生自不同于胞外结构域来源多肽的信号转导蛋白)的胞内区段和跨膜结构域。“嵌合抗原受体(CAR)”有时被称为“嵌合受体”、“T体”或“嵌合免疫受体(CIR)”。短语“能够结合预定抗原的胞外结构域”是指能够特异性结合预定抗原的任何蛋白质分子或其部分。“胞内信号传导结构域”意指已知具有传递信号的功能的任何寡肽或多肽结构域，所述信号引起细胞内生物过程的激活或抑制，例如免疫细胞如T细胞的激活。实例包括ILR链、CD28和/或CD3ζ。

本文使用的“慢病毒”是指逆转录病毒科的属。慢病毒在逆转录病毒中是独特的，其能够感染非分裂细胞；它们可以将大量的遗传信息递送到宿主细胞的DNA中，因此它们是基因传递载体的最有效方法之一。HIV、SIV和FIV都是慢病毒的实例。衍生自慢病毒的载体提供了在体内实现显著水平的基因转移的方法。

术语“离体”通常是指在生物体外部发生的活动，例如在生物体外部的人工环境中(优选地对自然条件的改变最小)的活组织内或活组织上进行的实验或测量。在特定方面，“离体”程序包括从生物体中取出活细胞或组织，并在实验室装置中培养或调节，通常在无菌条件下，通常几个小时或多达约24小时，但根据情况包括多达48或72小时。在某些方面，可以收集并冷冻此类组织或细胞，然后解冻用于离体处理。使用活细胞或组织持续超过几天的组织培养实验或程序通常被认为是“体外”，尽管在某些方面，该术语可以与离体互换使用。

术语“体内”通常指生物体内部发生的活动，例如细胞自我更新和细胞扩增。在一方面，术语“体内扩增”是指细胞群在体内数量增加的能力。

首字母缩略词“SMART”(短操纵自动复制T细胞)是指T细胞扩增过程，其中细胞在IL-2和IL-21存在下培养。

首字母缩略词“TNT”(传统培育的T细胞)是指不使用IL-21的传统T细胞扩增过程，并且通常包括细胞培养超过7天和/或通常包括使用IL-2。

术语“刺激”是指通过刺激分子(例如，TCR/CD3复合物)与其同源配体的结合诱导初级应答，从而介导信号转导事件，包括但不限于经由TCR/CD3复合物的信号转导。

“刺激分子”是指T细胞上与同源刺激配体特异性结合的分子。

如本文所用，“刺激配体”意指当存在于抗原呈递细胞(例如，aAPC、树突细胞、B细胞等)上时可以与T细胞上的同源结合配偶体(称为在本文中称为“刺激分子”)特异性结合，从而介导T细胞的初级应答，包括但不限于激活、免疫应答的起始、增殖等。刺激配体包括但不限于CD3配体，例如抗CD3抗体和CD2配体，例如抗CD2抗体，以及肽，例如CMV、HPV、EBV肽。

术语“激活”是指T细胞已被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的状态。在特定方面，激活还可以与诱导的细胞因子产生和可检测的效应子功能相关。术语“激活的T细胞”尤其是指正在增殖的T细胞。仅通过TCR产生的信号不足以完全激活T细胞，还需要一个或多个次级或共刺激信号。因此，T细胞激活包括通过TCR/CD3复合物的初级刺激信号和一个或多个次级共刺激信号。共刺激可以通过已接收初级激活信号(例如通过CD3/TCR复合物或通过CD2的刺激)的T细胞的增殖和/或细胞因子产生来证明。

“共刺激信号”是指与主要信号(例如TCR/CD3连接)组合导致T细胞增殖、细胞因子产生和/或特定分子(例如CD28)上调或下调的信号。

“共刺激配体”是指结合共刺激分子的分子。共刺激配体可以是可溶的或提供在表面上。“共刺激分子”是指T细胞上与共刺激配体(例如抗CD28抗体)特异性结合的同源结合配偶体。

如本文所用，“自体”是指来自同一受试者的细胞。

如本文所用，“同种异体”是指与比较细胞在遗传上不同的相同物种的细胞。

如本文所用，“同基因”是指与比较细胞在遗传上相同的不同受试者的细胞。

如本文所用，“异基因”是指与比较细胞不同物种的细胞。在优选的方面，本发明的细胞是同种异体的。

如本文所用，术语“个体”和“受试者”通常可互换使用，并且是指表现出可以用本文别处披露的基因治疗载体、基于细胞的治疗剂和方法治疗的癌症症状的任何动物。合适的受试者(例如，患者)包括实验动物(例如小鼠、大鼠、兔或豚鼠)、农场动物和家畜或宠物(例如猫或狗)。包括非人灵长类动物，并且优选地，人患者。典型的受试者包括患有癌症、已被诊断患有癌症、或处于癌症风险中或患有癌症的人患者。

“增强”或“促进”或“增加”或“扩增”通常是指与由媒剂或对照分子/组合物引起的应答相比，本文预期的组合物产生、引发或引起更大生理应答(即，下游效应)的能力。可测量的生理应答可包括T细胞扩增、激活、持久性的增加和/或癌细胞死亡杀伤能力的增加，以及根据本领域的理解和本文的描述显而易见的其他应答。“增加”或“增强”量通常是“统计上显著”的量，并且可以包括比由媒剂或对照组合物产生的应答增加1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30或更多倍(例如500、1000倍)(包括1之间和1以上的所有整数和小数点，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)。

“减少”或“减低”或“减轻”或“降低”或“减弱”通常是指与由媒剂或对照分子/组合物引起的应答相比，本文预期的组合物产生、引发或引起更小生理应答(即，下游效应)的能力。“减少”或“降低”量通常是“统计上显著”的量，并且可以包括比由媒剂、对照组合物产生的应答(参考应答)或特定细胞谱系中的应答减少1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30或更多倍(例如500、1000倍)(包括1之间和1以上的所有整数和小数点，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)。

“维持(maintain)”或“保留”或“维持(maintenance)”或“无变化”或“无实质性变化”或“无实质性减少”通常与由媒剂、对照分子/组合物产生的应答或特定细胞谱系中的应答相比，本文所考虑的组合物在细胞中产生、引发或引起较小生理应答(即下游效应)的能力。可比较的应答是与参考应答没有显著差异或可测量的差异的应答。

T细胞的来源

在本发明的T细胞的扩增和遗传修饰之前，从受试者获得T细胞的来源。T细胞可从多种来源获得，包括例如外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在本发明的某些方面，可以使用本领域可用的任何数量的T细胞系。在本发明的某些方面，可以从来自受试者收集的血液单位(使用本领域技术人员已知的任意数量的技术(如Ficoll

在另一个方面，通过例如通过PERCOLL

通过阴性选择富集T细胞群体可以用针对阴性选择细胞特有的表面标记物的抗体的组合来实现。一种方法是通过负磁性免疫粘附或流式细胞术进行的细胞分选和/或选择，所述流式细胞术使用针对阴性选择的细胞上存在的细胞表面标记物的单克隆抗体的混合物。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CDl6和HLA-DR的抗体。在某些方面，可能期望富集或阳性选择通常表达CD4

为了通过阳性选择或阴性选择分离所期望的细胞群，可以改变细胞和表面(例如颗粒，如珠)的浓度。在某些方面，可能期望显著减小珠和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞浓度)，以确保细胞和珠的最大接触。例如，在一方面，使用20亿个细胞/ml的浓度。在一方面，使用10亿个细胞/ml的浓度。在进一步的方面，使用大于1亿个细胞/ml。在进一步的方面，使用1千万个细胞/ml、1.5千万个细胞/ml、2千万个细胞/ml、2.5千万个细胞/ml、3千万个细胞/ml、3.5千万个细胞/ml、4千万个细胞/ml、4.5千万个细胞/ml、或5千万个细胞/ml的细胞浓度。在又一方面，使用7.5千万个细胞/ml、8千万个细胞/ml、8.5千万个细胞/ml、9千万个细胞/ml、9.5千万个细胞/ml、或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在进一步的方面，可以使用1.25或1.5亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可导致细胞产量、细胞活化和细胞扩增增加。

在相关方面，可能期望使用较低浓度的细胞。通过显著地稀释T细胞和表面(例如颗粒，如珠)的混合物，使颗粒与细胞之间的相互作用最小化。这会选择表达大量与颗粒结合的所期望抗原的细胞。例如，CD4

在其他方面，细胞可以在2℃-10℃或在室温在旋转器上以不同速度孵育不同长度的时间。

用于刺激的T细胞也可以在洗涤步骤后冷冻。在一些方面，冷冻和随后的解冻步骤可以通过去除细胞群中的粒细胞和一定程度去除单核细胞来提供更均一的产物。在去除血浆和血小板的洗涤步骤之后，可以将细胞悬浮在冷冻溶液中。虽然许多冷冻溶液和参数在本领域中是已知的并且在此类情况下是有用的，但一种方法涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS；或含有10％右旋糖酐40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白、和7.5％DMSO，或31.25％醋酸钠林格氏液-A、31.25％右旋糖5％、0.45％NaCl、10％右旋糖酐40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白、和7.5％DMSO的培养基；或含有例如Hespan和醋酸钠林格氏液A的其他合适的细胞冷冻培养基，然后将细胞以1°/分钟的速率冷冻至-80℃，并储存在液氮储罐的气相中。可以使用其他受控冷冻方法以及立即在-20℃或在液氮中的非受控冷冻。

在某些方面，在使用本发明的方法激活之前，将冷冻保存的细胞解冻并洗涤并使其在室温静置一小时。

在本发明的上下文中还考虑了在可能需要如本文所述的扩增的细胞之前的时间段从受试者收集血液样品或单采产物。因此，可以在任何必要的时间点收集待扩增的细胞的来源，并且分离的和冷冻随后在T细胞疗法中使用的所期望的细胞(例如免T细胞)用于受益于T细胞疗法(如本文所述的那些)的任意数量的疾病或病症。在一方面，血液样品或单采样品取自通常健康的受试者。在某些方面，血液样品或单采样品来自大体上健康的受试者，该受试者有发展疾病的风险但尚未患上疾病，并且目的细胞被分离并冷冻供以后使用。在某些方面，T细胞可被扩增、冷冻并在稍后使用。在某些方面，在诊断如本文所述的特定疾病之后不久但在任何治疗之前从患者收集样品。在进一步的方面，在任意数量的相关治疗方式之前，从受试者的血液样品或单采样品中分离细胞，这些治疗方式包括但不限于用药剂(如那他珠单抗、依法珠单抗、抗病毒剂)、化学疗法、辐射、免疫抑制剂(如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和FK506)、抗体或其他免疫消除剂(如CAMPATH、抗CD3抗体、细胞毒素、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228)、和辐射治疗。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调神经磷酸酶(环孢菌素和FK506)或抑制对生长因子诱导信号转导很重要的p70S6激酶(雷帕霉素)(Liu等人，Cell[细胞]66：807-815，1991；Henderson等人，Immun.[免疫学]73：316-321，1991；Bierer等人，Curr.Opin.Immun.[免疫学当前观点]5：763-773，1993)。在进一步的方面，为患者分离细胞并冷冻以供随后与以下结合使用(例如，之前、同时或之后)：骨髓或干细胞移植，使用化学治疗剂(如氟达拉滨)、外部光束辐射疗法(XRT)、环磷酰胺、或抗体(如OKT3或CAMPATH)进行的T细胞消融疗法。在另一个方面，细胞在B细胞消融疗法(例如与CD20反应的药剂，例如美罗华)之前被分离并且可以在B细胞消融疗法之后被冷冻以用于随后的治疗。

在本发明的进一步的方面，T细胞是在治疗后直接从患者获得的。在这方面，已经观察到在某些癌症治疗之后，特别是用破坏免疫系统的药物治疗后，在患者通常将从治疗中恢复期间治疗后不久，获得的T细胞的质量对于其离体扩增的能力可以是最佳的或改善的。同样地，在使用本文所述的方法进行离体操作后，这些细胞可以处于优选的状态以增强植入和体内扩增。因此，在本发明的上下文中，预期在该恢复期期间收集血细胞，包括T细胞、树突细胞或造血谱系的其他细胞。此外，在某些方面，动员(例如，用GM-CSF动员)和预处理方案可用于在受试者中产生病症，其中特别细胞类型的再增殖、再循环、再生、和/或扩增是有利的，尤其是在疗法后确定的时间窗口期间。示例性细胞类型包括T细胞、B细胞、树突细胞、和免疫系统的其他细胞。

T细胞的激活和扩增

无论是在对T细胞进行遗传修饰以表达期望的CAR之前还是之后，通常可以使用例如以下中描述的方法来激活和扩增T细胞：美国专利号6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；以及美国专利申请公开号20060121005。

通常，本发明的T细胞通过与表面接触而扩增，该表面附接有刺激CD3/TCR复合物相关的信号的药剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体。特别地，可以如本文所述刺激T细胞群，例如通过与固定在表面上的抗CD3抗体或其抗原结合片段、或抗CD2抗体接触，或者通过与缀合至钙离子载体的蛋白激酶C激活剂(例如苔藓抑素)接触。为了共刺激T细胞表面上的辅助分子，使用结合辅助分子的配体。例如，在适于刺激T细胞增殖的条件下，可以使T细胞群与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4

在某些方面，T细胞的初级刺激信号和共刺激信号可以由不同的方案提供。例如，提供每个信号的药剂可以在溶液中或偶联到表面。当偶联到表面时，药剂可以偶联到相同的表面(即，以“顺式”形成)或分开的表面(即，以“反式”形成)。可替代地，可以将一种药剂偶联到表面而另一种药剂在溶液中。在一方面，提供共刺激信号的药剂与细胞表面结合，并且提供初级激活信号的药剂在溶液中或偶联到表面。在某些方面，两种药剂都可以在溶液中。在另一个方面，这些药剂可以是可溶形式，然后交联至表面，例如表达Fc受体的细胞或将与这些药剂结合的抗体或其他结合剂。在这方面，参见例如美国专利申请公开号20040101519和20060034810的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其预期用于激活和扩增本发明中的T细胞。

在一方面，将两种药剂固定在珠上，在相同的珠上(即“顺式”)或者分开的珠上(即“反式”)。例如，提供初级激活信号的药剂是抗CD3抗体或其抗原结合片段，并且提供共刺激信号的药剂是抗CD28抗体或其抗原结合片段，并且两种药剂以相等的分子量共固定在相同的珠上。在一方面，使用与珠结合的每种抗体的1∶1比率用于CD4

在本发明的进一步的方面，将细胞(如T细胞)与药剂包被的珠组合，随后将珠和细胞分离，然后培养细胞。在可替代的方面，在培养之前，药剂包被的珠和细胞不是分开的，而是一起培养的。在进一步的方面，首先通过施加力(如磁力)浓缩珠和细胞，导致细胞表面标志物的增加的连接，从而诱导细胞刺激。

适合T细胞培养的条件包括适当的培养基(例如，最小基本培养基或RPMI培养基1640或X-vivo 15，(龙沙公司(Lonza)))，其可以含有增殖和生存所必需的因子，包括血清(例如，胎牛或人血清)，白细胞介素-2(IL-2)、IL-21、胰岛素、IFN-7、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ、和TNF-α或本领域技术人员已知的用于细胞生长的任何其他添加剂。用于细胞生长的其他添加剂包括但不限于表面活性剂、等离子体、和还原剂，如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15、和X-Vivo 20、Optimizer，添加氨基酸、丙酮酸钠和维生素，无血清或补充有适当量的血清(或血浆)或一组确定的激素、和/或足以使T细胞生长和扩增的一种或多种细胞因子的量。抗生素(例如青霉素和链霉素)仅包括在实验培养物中，而不包括在待注入受试者的细胞培养物中。将靶细胞维持在支持生长所需的条件下，例如，适当的温度(例如，37℃)和大气(例如，空气加5％CO

在一方面，T细胞在含有10至100IU/mL重组人IL-2的培养基中培养。在一方面，T细胞在含有10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100IU/mL重组人IL-2的培养基中培养。在另一个方面，T细胞在还含有0.1至0.3U/mL之间的重组IL-21的培养基中培养。在另一个方面，T细胞在含有IL-2和1、2、5、10、15、20、25、30、40、50、75或100U/mL重组人IL-21的培养基中培养。在另一个方面，T细胞在含有IL-2和0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29或0.30U/mL重组人IL-21的培养基中培养。在一方面，T细胞在含有40IU/mL重组人IL-2和0.19U/mL重组人IL-21的培养基中培养。

在本发明的一方面，细胞培养长达14天。在另一个方面，可以将混合物培养4天。T细胞在培养的任何阶段都可以被搅动。在一方面，在细胞培养期间在含有IL-2和IL-21的培养基中搅动细胞。在某些方面，与第6天收获的CAR-T细胞相比，第4天收获的T细胞表现出更高的靶标独立杀伤活性。

嵌合抗原受体(CAR)和T细胞受体(TCR)

TCR工程改造的T细胞表达具有由高质量和高亲和力的抗原特异性T细胞克隆产生的α和β链的肿瘤抗原特异性受体。另外，CAR是抗原的重组受体，它在单个分子中重新定向T淋巴细胞和其他免疫细胞的特异性和功能。它们用于癌症免疫疗法的总体前提是快速生成靶向肿瘤的T细胞，绕过主动免疫的障碍和增量动力学。一旦在T细胞中表达，CAR修饰的T细胞就会获得超生理特性，可能产生即时和长期影响。将CAR工程改造到T细胞中需要培养T细胞以进行转导和扩增。转导可以利用多种方法，但需要稳定的基因转移才能在克隆扩展且持久存在的T细胞中实现持续的CAR表达。原则上，任何细胞表面分子都可以通过CAR靶向，从而克服对自身抗原的耐受性以及生理性T细胞库中限制T细胞反应性范围的抗原识别间隙。

然而，将免疫反应性朝选定的抗原重新定向并不是智能CAR的唯一目的，智能CAR的设计目的不仅仅是靶向和启动T细胞激活。具有不同强度和信号传导质量的CAR具有调节T细胞扩增和持久性以及肿瘤微环境中T细胞激活强度(这些特征显著改变靶向肿瘤的T细胞的功效和安全性)的潜力。

根据要靶向的所期望抗原，本披露的CAR可以被工程改造以包括对所期望抗原靶标具有特异性的合适的抗原结合部分。在一方面，CAR特异性识别STEAP2或磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)。

表1.序列

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装甲分子

本文披露了多核苷酸，其包含(a)编码CAR的核苷酸序列，其中所述CAR包含抗原结合结构域，和(b)编码装甲分子的核苷酸序列。一种制备更加抵抗肿瘤相关的免疫抑制的CAR-T细胞的方法称为“装甲”。装甲是对CAR-T细胞进行分子操作，以表达一种或多种可以抵抗免疫抑制的“装甲分子”。例如，研究者报道了修饰CAR-T细胞以分泌阻断PD-1的单链可变片段(scFv)，这改善了PD-L1+血液肿瘤和实体瘤的小鼠模型中的CAR-T细胞抗肿瘤活性(Rafiq，S.，Yeku，O.，Jackson，H.等人Targeted delivery of a PD-1-blocking scFv byCAR-T cells enhances anti-tumor efficacy in vivo.[CAR-T细胞对阻断PD-1的scFv的靶向递送增强了体内抗肿瘤功效]Nat Biotechnol[自然生物技术]36，847-856(2018))。其他研究表明了用显性负性2型TGFβ受体(TGFβRIIDN)装甲分子来装甲T细胞以中和TGFβ对T细胞的抑制作用的有效性(Bollard等人，Tumor-Specific T-Cells Engineered toOvercome Tumor Immune Evasion Induce Clinical Responses in Patients WithRelapsed Hodgkin Lymphoma[工程化以克服肿瘤免疫逃逸的肿瘤特异性T细胞诱导复发性霍奇金淋巴瘤患者的临床响应]，J Clin Oncol[临床肿瘤学杂志]36(11)：1128-1139(2018))。当前，至少一项临床研究正在研究用TGFβRIIDN装甲分子装甲抗PSMA-CAR-T细胞对治疗去势抗性前列腺癌的有效性(NCT03089203)。

在一些方面，装甲分子包含显性负性2型TGFβ受体(TGFβRIIDN)。在一些方面，装甲分子包含与SEQ ID NO：105中所示氨基酸序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，装甲分子包含SEQ ID NO：105中所示的氨基酸序列。

CAR-T细胞或TCR细胞的代谢测试

在一些方面，使用

实例

具体方面的以上描述将充分地揭示本发明的总体性质，使得在不脱离本发明的一般概念的情况下，其他人可以无需过多的实验通过应用本领域的技术内的知识，容易地针对此类具体方面的各种应用修改和/或改编。因此，基于在此提出的传授和指导，此类改编和修改旨在处于所披露的含义和等效范围内。应理解，本文的措辞或术语是出于描述而非限制的目的，使得本说明书的术语或措辞应由技术人员根据传授内容和指导进行解释。

在考虑了在此披露的本发明的说明书和实践之后，本领域技术人员将了解本发明的其他方面。说明书和实例旨在被视为仅是示例性的，本发明的真实范围和精神由以下权利要求书指出。

实例1：IL-2和IL-21

IL-21存在下的扩增会导致分化程度较低的细胞和较高比例的CAR+CD8+细胞。将纯化的人T细胞接种于含有5％人血清、1％青霉素-链霉素(英杰公司(Invitrogen))和1％抗生素-抗真菌剂(英杰公司)的AIM-V培养基中，浓度为0.2E6个细胞/mL+白细胞介素(IL)-2(300IU/mL)(派普泰克公司(Peprotech))。根据制造商的方案，用抗CD3/CD28 Dynabeads(英杰公司)激活T细胞。24小时后，将慢病毒加入孔中，并将板在2000g、37℃离心2小时。离心后，洗涤细胞并重悬浮于含有IL-2(300IU/mL)、IL-21(10ng/mL，R&D系统公司(R&DSystems))、IL-10(10ng/mL，R&D系统公司)和IL-15(10ng/mL，R&D系统公司)的新鲜培养基中，如所示。将板置于37℃、5％CO2培养箱中，并根据需要分开细胞，以将细胞密度维持在约1E6个细胞/mL。10天后，收获细胞并通过流式细胞术进行分析(图1A-D)。

IL-2和IL-21的组合可在第8天收获的TNT细胞中产生更好的表型和长期细胞扩增。第0天将选定的总T细胞(CD4和CD8)以1.5E6个活细胞/mL以10％工作体积接种在125mL摇瓶中的补充5％CTS血清替代品(Thermo Fisher)的X-VIVO 15培养基(Lonza)中在51rpm搅动。将ImmunoCult CD3/CD28/CD2 T细胞激活剂(干细胞技术公司(StemcellTechnologies))以25μL/mL添加到细胞培养物中，以在接种后立即激活T细胞。在37℃和5％CO

高IL-2浓度可以掩盖IL-21的作用。第0天将选定的总T细胞(CD4和CD8)以1.5E6个活细胞/mL以10％工作体积接种在125mL摇瓶中的补充5％CTS血清替代品(Thermo Fisher)的X-VIVO 15培养基(Lonza)中在51rpm搅动。将ImmunoCult CD3/CD28/CD2 T细胞激活剂(干细胞技术公司(Stemcell Technologies))以25μL/mL添加到细胞培养物中，以在接种后立即激活T细胞。在37℃和5％CO2的培养箱中培养两天后，以MOI 10将GPC3 LVV添加到细胞培养物中，并将搅动速率增加至169rpm以增强LVV转导。第3天，将0.9E6个活细胞转移并在100mL的X-VIVO 15培养基+5％(v/v)CTS血清替代品(其补充有以下：仅100IU/mL IL-2(Akron公司)，或25IU/mL IL-2和10ng/mL IL-21，或50IU/mL IL-2和10ng/mL IL-21，或100IU/mL IL-2和10ng/mL IL-21，或25IU/mL IL-2和5ng/mL IL-21，或25IU/mL IL-2和2ng/mL IL-21)中培养。在第6天，将第二剂量的IL-2以与第3天相同的浓度添加到每个孔中，而不混合。第8天，收获细胞用于细胞计数并通过流式细胞术(来自BD生物科学公司(BDBiosciences)的LSR Fortessa)分析CD3、CD4、CD8、GPC3CAR、CD45RO、CD45RA、CD62L和CCR7的表达(图3A-3F)。

实例2：SMART 4天CAR-T细胞培养过程

来自患者的单采生物起始材料(BSM)在预先定义的收集窗口内从临床中心接收，在2-8℃下运输。使用Flexcell程序在Cytiva Sefia S2000上清洗BSM，以去除大部分RBC和血小板，然后按照1：1的醋酸钠林格氏液A(Baxter)(其具有5％(w/v)人血清白蛋白(HSA))：

第0天：生产开始时，使用PlasmaTherm(Plasma Therm公司)在受控条件下解冻冷冻的一半leukopak，并使用美天旎公司

第1天：第二天，用慢病毒载体以预定的感染复数转导细胞。添加慢病毒两小时后，添加新鲜细胞培养基以使细胞培养物体积达到250mL。

第2天至第4天：细胞在第2、3、4天继续培养和扩增。每12小时将180mL细胞培养基更换为180mL含有1％(v/v)重组血清替代品(ITSE-A)、40IU/mL重组人IL-2和0.19U/mL重组人IL-21的新鲜完全培养基。

第4天：用收获缓冲液(含有5％(w/v)人血清白蛋白(HSA)的醋酸钠林格氏液A(Baxter公司))洗涤细胞，并通过体积减少来浓缩以产生药物物质(DS)。取样进行分析。

实例3：SMART CAR-T细胞培养流程(摇瓶缩小模型)

第0天：对于缩小模型研究，CD4+CD8 T淋巴细胞在Prodigy上从冷冻生物起始材料中富集，或使用GMP抗CD4和抗CD8CliniMACS微珠(美天旎公司)手动富集。分离后，将1.0x10

第1天：第二天，用慢病毒载体以预定的感染复数转导细胞。添加慢病毒两小时后，添加新鲜细胞培养基以使细胞培养物体积达到25mL。体积增加后，轨道摇床的搅动速率增加至65rpm。

第2天：将细胞培养物分成两等份(每份约12mL)，并从细胞培养物中除去5mL用过的培养基。125mL摇瓶中的每份细胞培养物均添加18mL(总共25mL)含有1％(v/v)重组血清替代品(ITSE-A)、40IU/mL重组人IL-2和0.19U/mL重组人IL-21的完全X-VIVO 15无血清培养基(龙沙公司)。

第3天：每24小时将细胞培养物更换为18mL含有1％(v/v)重组血清替代品(ITSE-A)、40IU/mL重组人IL-2和0.19U/mL重组人IL-21的新鲜完全培养基。

第4天，用收获缓冲液(含有5％(w/v)人血清白蛋白(HSA)的醋酸钠林格氏液A(Baxter公司))洗涤细胞，并通过体积减少来浓缩以产生药物物质(DS)。取样进行分析。

使用摇瓶工艺，对于STEAP2和GPC3 CAR-T细胞，接种1x10

实例4：SMART 4天过程相比于传统培养过程(TNT)的分析测试

评估了SMART过程T细胞的相对纯度。如图8A-8B所示，T细胞群是高纯度的细胞群，对于STEAP2和GPC3 CAR-T细胞而言，总体CD3阳性率至少为98％。CAR表达水平(图6A-6B)显示STEAP2(图9A-9B)和GPC3(图9B)CAR-T细胞中CAR和TGFβRII表达之间的相关性。当用衍生自前列腺癌患者的PBMC(图9A，Run4C)和健康供体PBMC(图9A，Run4H)开始时，可见类似高表达水平的STEAP2 CAR。有意义的是，对于STEAP2 CAR表达，与第4天相比，在第6天收获细胞时CAR+T细胞的百分比进一步增加(图9A)。

活CAR+T细胞的分化谱显示出显性的早期记忆表型(图10)。如图10所示，中央记忆(T

活CAR+T细胞还显示出更多的后期激活谱，其中小于1％的细胞是PD1/LAG3/TIM3三重阳性(图11A-11B)。在激活谱中，CAR+T细胞表现出更多的晚期激活(CD25+)。与第4天收获的细胞相比，第6天收获的CAR-T细胞的激活略有减少。在耗竭谱中，总体而言，表达耗竭标志物的细胞百分比非常低，对于PD1/LAG3/Tim3双阳性小于4％，三阳性小于1％。经过4天和6天处理的细胞产生的CAR-T细胞的耗竭标志物的表达存在轻微差异。

STEAP2和GPC3 CAR-T细胞的功能如图12A-12B和11A-11B所示。如图12A-12B所示，STEAP2和GPC3 CAR-T细胞在一系列E：T比率下表现出靶标依赖性杀伤活性。当细胞以1∶2的E∶T比例与表达靶的细胞系共培养时，观察到细胞因子释放，如图13A-13B针对STEAP2和GPC3 CAR-T细胞所示。

实例5：SMART CAR-T细胞的生物学特性

对GPC3和STEAP2 SMART CAR-T细胞进行了分析，以确定其相对于传统过程生产的CAR-T细胞活性增强的机制。据推测，较短的SMART扩增过程会产生具有较高干性和适应度的细胞。分析了4天和12天过程中TCF7、CD27、CCR7、FOXO1、CD28和BCL6的干性基因的表达。如图14A-14E、15A-15D和16A-16D所示，与TNT CAR-T细胞相比，4天T细胞显示出更高的干性基因表达和高代谢适应度。这转化为在体外连续杀伤测定中与传统TNT过程相比，到第4天时STEAP2 CAR的更好表达(图17A-17B)和SMART 4天GPC3CAR-T细胞的更高倍数扩增(图18D-18E)。SMART CAR-T细胞还增加了效应细胞因子的抗原特异性分泌。如图18A-18C所示，SMART CAR-T细胞在连续杀伤测定中产生更高水平的IFNγ、IL-2和IL-21。代谢适应度显示4天的SMART CAR-T细胞比11天TNT CAR-T具有更高的OCR(图24A-24D、25A-25D)和ECAR(图26A-26D)。

实例6：体内SMART CAR-T细胞的功效

为了确定TNT和SMART细胞体外表型对其体内活性的影响，将过表达人TGFβ的GPC3阳性HUH7肿瘤植入NSG小鼠。当肿瘤达到200mm

另外，使用STEAP2 CAR-T细胞进行相同的实验，其中使用植入的外源表达人TGFβ的STEAP2阳性C4-2肿瘤。当肿瘤达到175mm

还分析了经过扩增的前列腺癌T细胞的CD4/CD8比率。如图20A-20B中所示，T细胞被双重染色并通过FACS进行分析。CD62L/CD45RO表达表明，这些前列腺癌T细胞的分化程度也低于健康供体的细胞。(图21A-21B)。

将过表达外源人TGFb的STEAP2阳性C4-2细胞植入雄性NSG小鼠中。当肿瘤大小达到平均175mm

进行了类似的实验，其中将C4-2TGFb细胞植入NSG MHC 1类/2类敲除小鼠中，以减轻GvHD的潜在贡献。这项研究比较了来自同一供体的6e6剂量的TNT和SMART 40A3 CAR-T细胞。这一比较揭示了SMART CAR-T治疗组具有优异的肿瘤生长抑制作用和更全面的完全缓解者。1e6和3e6处的第二供体SMART材料在这种情况下也有效，分别导致2/5和4/5的完全缓解者。对于12天(TNT)CAR-T细胞没有观察到相同程度的肿瘤体积减小(图23)。