一株多粘类芽孢杆菌Mxdg-1、菌剂及其应用

技术领域

本发明属于生物菌剂技术领域，具体涉及一株多粘类芽孢杆菌Mxdg-1、菌剂及其应用。

背景技术

当归(Angelica sinensis(Oliv.)Diels)伞形科草本植物，通常分布于海拔1800～3000m的高寒多雨二阴山区，其根入药，具有补血活血、调经止痛、润肠通便等作用。目前商品当归均来自栽培，产地多采用育苗移栽的方式生产，正常情况下，第一年育苗，第二年成药，第三年开花留种。然而部分当归植株第二年抽薹开花，而不能形成有效的商品药材，这种现象叫当归的早期抽薹，简称“早薹”。当归早期抽薹发生后，根中次生韧皮部与次生木质部的比例减小，次生木质部的薄壁细胞木质化，生活的薄壁细胞和分泌道减少，影响次生产物的形成，导致肉质根木质化并空心，缺乏油气，失去药用价值。目前，早薹已成为影响产区当归生产的最主要的瓶颈问题，亟待解决。

当归是低温长日照植物，低温春化和光周期都影响其早期抽薹进程。当归早期抽薹的原因包括遗传因素、营养因素和生理因素：如不同种子的早薹率不同；种苗根直径0.35～0.86cm范围内，根直径越大，抽薹越早且抽薹率越高；不同的贮藏期的温湿度对当归的抽薹率也具有较大影响；海拔是影响当归植株长势和抽薹的主要生态因子，随着海拔高度升高植株早薹率显著下降；早春干旱，当归内源脱落酸含量升高，也会显著的增加抽薹率；施用氮磷化肥均会促进提前抽薹等。尽管现有技术中针对当归早臺采用了诸如-5℃贮藏种苗、施用优质腐熟农家肥的基础上合理施用迟效氮磷化肥、大田搭设遮阳网以及喷施矮壮素、烯效唑等赤霉素抑制剂来降低当归的早臺率，但对于低温，高温，干旱，倒春寒等早春极端天气造成的抽薹率升高，尚无较好的解决办法。

调查研究表明，在选择适宜种子、种苗种植的情况下，一般正常年份当归早期抽薹率为20％-30％，极端天气和干旱年份严重者可达60％-80％，甚至更高(参见文献“甘肃道地药材研究-当归研究”，李应东,蔺海明等)。再如2020年甘肃省4个市(州)30个不同种植区域的早薹率为11％～86％，平均约52％(参见文献“光周期阶段当归抽薹开花的调控机制研究”，黎洁)。因而，解决早春极端环境造成抽薹率升高的问题迫在眉睫。

现有技术中虽然也有通过施用农药和植物生长调节剂来应对早春极端环境所造成的抽薹率升高的问题，且可以有效降低当归的抽薹率，但是降低抽薹率的同时对当归的品质也具有较大影响，而且也不符合新版GAP对农资投入品的要求。

多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)具有植物促生作用以及病害生物防治作用，对细菌性、真菌性以及线虫等植物病害均有防治效果，现有技术中存在很多具备抗病功能的多粘类芽孢杆菌，如中国专利CN200810100963.3报道了一株多粘类芽孢杆菌CGMCCNo.2377，及对多种真菌病害的防治作用；中国专利CN200910153984.6报道了一株多粘类芽孢杆菌CCTCC NO：M209157，及对青枯菌的抑菌作用和青枯病的防治作用；中国专利CN201210163886.2报道了一株多粘类芽孢杆菌CGMCCNo.6021，及其拮抗太子参根际土壤尖孢镰刀菌的作用等，但是具备抑制当归早薹的多粘类芽孢杆菌尚未见相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一株多粘类芽孢杆菌Mxdg-1、菌剂及其应用，所述多粘类芽孢杆菌Mxdg-1可以有效抑制当归早期抽薹，并具有很好的抗病虫害的作用。

本发明提供了一株多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)Mxdg-1，所述多粘类芽孢杆菌Mxdg-1的保藏编号为CGMCC No.26495。

本发明还提供了一种菌剂，所述菌剂的活性成分包括上述技术方案所述的多粘类芽孢杆菌Mxdg-1和/或多粘类芽孢杆菌Mxdg-1的发酵液。

优选的，所述菌剂的活性成分包括上述技术方案所述的多粘类芽孢杆菌Mxdg-1和多粘类芽孢杆菌Mxdg-1的发酵液。

优选的，所述菌剂中多粘类芽孢杆菌Mxdg-1的浓度为1×10

本发明还提供了上述技术方案所述的多粘类芽孢杆菌Mxdg-1或上述技术方案所述的菌剂在下述Ⅰ～Ⅲ任一项或多项中的应用：

Ⅰ：抑制当归早期抽薹；

Ⅱ：防治植物真菌病害；

Ⅲ：防治植物虫害。

优选的，所述真菌病害为由镰刀菌属病原真菌引起的植物病害。

优选的，所述真菌病害包括根腐病、立枯病和麻口病中的一种或多种；所述虫害包括线虫引起的病害。

优选的，所述植物包括当归。

本发明还提供了一种抑制当归早期抽薹和/或防治植物真菌病害的方法，以上述技术方案所述菌剂对当归种苗进行浸泡后进行移栽；

以权利要求2所述的菌剂对苗期的当归植株进行叶面喷施。

优选的，所述叶面喷施的条件包括：每两周喷施一次，以所述多粘类芽孢杆菌Mxdg-1的活菌数计，每次喷施的剂量为2×10

所述浸泡的时间为30～60min。

有益效果：

本发明提供了一株多粘类芽孢杆菌Mxdg-1(Paenibacilluspolymyxa)，并已完成生物保藏。

在此基础上，本发明还提供了一种菌剂，所述菌剂的活性成分包括上述技术方案所述的多粘类芽孢杆菌Mxdg-1、多粘类芽孢杆菌Mxdg-1的代谢产物和多粘类芽孢杆菌Mxdg-1的发酵液中的一种或多种。本发明所述菌剂通过显著地提高当归植株胁迫抗性；成倍地提高抑制抽薹相关激素褪黑素含量、茉莉酸含量；成倍地降低了促进抽薹相关激素脱落酸及生物活性物质腐胺等的含量，有效改变当归的生理生化状态，起到抑制当归早薹发生的作用。

同时，本发明所述菌剂具有固氮、不解磷、硝化能力且产嗜铁素的特性，促进植物对氮素的吸收利用，以避免过量磷素对抽薹的促进作用；所述多粘类芽孢杆菌Mxdg-1所具有的产吲哚乙酸、水杨酸、不产赤霉素的特性，避免了因菌液中含有赤霉素所导致抽薹现象的发生；所述多粘类芽孢杆菌Mxdg-1所具有的木质素酶活性、纤维素酶活性、木聚糖酶活性可以降解植物细胞壁，刺激植物产生内源茉莉酸；漆酶活性、过氧化物酶活性可以清除酚胺类和腐胺等促进抽薹的物质；几丁酶活性可以降解真菌细胞壁，提高对病原菌真菌的抵抗力。

另外，本发明所述菌剂中含有种类较多的抗菌作用物质、抗病毒作用物质、农药或其中间体物质、杀虫作用物质；促生物质吲哚乙酸和群体感应信号物质，有效保证了其在施用环境中具有一定的优势，能够起到抗病杀虫的作用。

生物保藏信息

多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)Mxdg-1，于2023年01月31日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.26495。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为实施例2中多粘类芽孢杆菌Mxdg-1发酵液正离子流色谱图(ESI+)；

图2为实施例2中多粘类芽孢杆菌Mxdg-1发酵液负离子流色谱图(ESI-)。

具体实施方式

本发明提供了一株多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)Mxdg-1，所述多粘类芽孢杆菌Mxdg-1的保藏编号为CGMCC No.26495。

本发明所述多粘类芽孢杆菌Mxdg-1分离自高寒地区生长的药用植株，通过菌落特征及16S rDNA序列鉴定确认为多粘类芽孢杆菌。本发明所述多粘类芽孢杆菌Mxdg-1在LB培养基上的菌落特征为：菌落圆形，呈灰白色，边缘不规则，中间突起，不透明，质地湿润粘稠。本发明所述多粘类芽孢杆菌Mxdg-1的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：5’-CGGGGTGGCTCCTTGCGGGTTCCCCACCGACTTCGGGTGTTGTAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGACCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCAATTCCGACTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGACCGGCTTTTCTAGGATTGGCTCCACCTCGCGATTTCGCTTCCCGTTGTACCGGCCATTGTAGTACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTGCTTAGAGTGCCCAGCTTGACCTGCTGGCAACTAAGCATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCTCCTCTGTCCCGAAGGAAAGGTCTATCTCTAGACCGGTCAGAGGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATACTCCACTGCTTGTGCGGGTCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAATGCTTAATGTGTTAACTTCGGCACCAAGGGTATCGAAACCCCTAACACCTAGCATTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGCGTCAGTTACAGCCCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGCTCCCCAGTTTCCAGTGCGACCCGAAGTTGAGCCTCGGGATTAAACACCAGACTTAAAGAGCCGCCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCCCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGGGCTTTCTTCTCAGGTACCGTCACTCTTGTAGCAGTTACTCTACAAGACGTTCTTCCCTGGCAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGGCTTTCGCCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTAGGCCTTTACCCCACCAACTAGCTAATGCGCCGCAGGCCCATCCACAAGTGACAGATTGCTCCGTCTTTCCTCCTTCTCCCATGCAGGAAAAGGATGTATCGGGTATTAGCTACCGTTTCCGGTAGTTATCCCTGTCTTGTGGGCAGGTTGCCTACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAGGTTATTAGAAGCAAGCTTCTACACAACCCCGCTCGACTGCA-3’，与标准菌株Paenibacilluspolymyxa ATCC 842菌株具有98.5％以上的相似性。

本发明所述多粘类芽孢杆菌Mxdg-1不解磷、具有硝化和固氮能力且具有产嗜铁素的特性；所述多粘类芽孢杆菌Mxdg-1具有的产吲哚乙酸、水杨酸、不产赤霉素的特性；同时，具有木质素酶活性、纤维素酶活性、木聚糖酶活性、漆酶活性和几丁酶活性。

本发明还提供了一种菌剂，所述菌剂的活性成分包括上述技术方案所述的多粘类芽孢杆菌Mxdg-1和/或多粘类芽孢杆菌Mxdg-1的发酵液。

本发明所述菌剂的活性成分优选包括上述技术方案所述的多粘类芽孢杆菌Mxdg-1和多粘类芽孢杆菌Mxdg-1的发酵液。本发明所述菌剂中多粘类芽孢杆菌Mxdg-1的浓度优选为1×10

本发明所述多粘类芽孢杆菌Mxdg-1的发酵液的制备方法优选包括：将所述多粘类芽孢杆菌Mxdg-1接种至液体发酵培养基中进行发酵培养，得到所述多粘类芽孢杆菌Mxdg-1的发酵液。本发明对所述多粘类芽孢杆菌Mxdg-1的活化过程没有特殊限定，采用本领域中常规活化方式即可。本发明所述液体发酵培养基优选包括PDB培养基；所述发酵培养的温度优选为25～30℃，更优选为28℃；时间优选为1～3d，更优选为2d；震荡频率优选为150～200r/min，更优选为180r/min。

本发明所述菌剂中含有种类较多的抗菌作用物质、抗病毒作用物质、农药或其中间体物质、杀虫作用物质；促生物质吲哚乙酸和群体感应信号物质，有效保证了其在施用环境中具有一定的优势，能够起到抗病杀虫的作用。另外，本发明所述菌剂通过显著地提高当归植株胁迫抗性；成倍地提高抑制抽薹相关激素褪黑素含量、茉莉酸含量；成倍地降低了促进抽薹相关激素脱落酸及生物活性物质腐胺等的含量，有效改变当归的生理生化状态，起到抑制当归早薹发生的作用。

基于上述技术优势，本发明还提供了上述技术方案所述的多粘类芽孢杆菌Mxdg-1或上述技术方案所述的菌剂在下述Ⅰ～Ⅲ任一项或多项中的应用：Ⅰ：抑制当归早期抽薹；Ⅱ：防治植物真菌病害；Ⅲ：防治植物虫害。

本发明所述应用优选包括抑制当归早期抽薹和/或防治植物真菌病害中的应用，更优选为在抑制当归早期抽薹和防治植物真菌病害中的应用。本发明所述真菌病害优选为由镰刀菌属病原真菌引起的植物病害。本发明所述真菌病害优选包括根腐病、立枯病和麻口病中的一种或多种，更优选为根腐病、立枯病和麻口病。本发明所述植物优选包括当归。本发明所述虫害优选包括线虫引起的病害，更优选为麻口病。

本发明通过降低胁迫造成的氧化损伤、提高当归中褪黑素和茉莉酸的含量、降低当归中脱落酸的含量以及降低当归中多胺的含量可以达到抑制当归早薹的作用。

本发明还提供了一种抑制当归早期抽薹和/或防治植物真菌病害的方法，以上述技术方案所述的菌剂对当归种苗进行浸泡后进行移栽；以上述技术方案所述的菌剂对苗期的当归植株进行叶面喷施。

本发明以上述技术方案所述的菌剂对当归种苗进行浸泡后进行移栽。本发明所述浸泡的时间优选为30～60min，更优选为30min。本发明所述菌剂优选为多粘类芽孢杆菌Mxdg-1的发酵液。本发明所述多粘类芽孢杆菌Mxdg-1的发酵液的制备方法已在上述技术方案中进行叙述，不再赘述。

所述移栽后，本发明以上述技术方案所述的菌剂对苗期的当归植株进行叶面喷施。本发明所述叶面喷施的条件优选包括：每两周喷施一次，以所述多粘类芽孢杆菌Mxdg-1的活菌数计，每次喷施的剂量优选为2×10

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

供试植株为1年生当归苗(芦头部位直径为0.8-1cm)，品种为岷归1号，由课题组自繁于天祝县绿能农业科技股份有限公司中药材种植基地(海拔2600米)。试验于2021年4～10月在天祝县绿能农业科技股份有限公司中药材种植基地进行。土壤类型为粟钙土，pH值为8.5；4月底整地，施有机肥(有机质≥45％，总养分N+P

试验中用到的试剂、培养基均为化学纯。木质素酶、纤维素酶、漆酶、几丁质酶、木聚糖酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、过氧化物酶、多胺氧化酶、二胺氧化酶、多酚氧化酶活性检测试剂盒，及丙二醛、过氧化氢、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮含量检测试剂盒购自北京盒子生工科技有限公司。

以下实施例所用培养基成分：

PDB培养基：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L，自然pH。

LB培养基：胰化蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，pH值调至7.0-7.4。

改良斯蒂芬逊培养基：硫酸铵2g/L、硫酸锰0.01g/L、磷酸二氢钠0.25g/L、硫酸镁0.03g/L、碳酸钙0.5g/L、磷酸氢二钾0.75g/L，pH值调至8.2。

NBRIP固体培养基：葡萄糖10g/L、磷酸钙5g/L、氯化镁5g/L、七水硫酸镁0.25g/L、氯化钾0.2g/L、硫酸铵0.1g/L、琼脂15g/L，pH值为7.0±0.2。

实施例1

多粘类芽孢杆菌Mxdg-1的分离及鉴定，步骤如下：

由课题组成员从高寒地区生长的药用植株中分离得到一株菌株，所述菌株的菌落特征如下：

将所述菌株接种到LB固体培养基中，在30℃条件下培养2d，得到菌株的菌落形态为：菌落圆形，呈灰白色，边缘不规则，中间突起，不透明，质地湿润粘稠。

提取所述菌株的基因组DNA，测定其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：5’-CGGGGTGGCTCCTTGCGGGTTCCCCACCGACTTCGGGTGTTGTAAACTCTCGTGGTGTG ACGGGCGGTGTGTACAAGACCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCAATTCCGACTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGACCGGCTTTTCTAGGATTGGCTCCACCTCGCGATTTCGCTTCCCGTTGTACCGGCCATTGTAGTACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTGCTTAGAGTGCCCAGCTTGACCTGCTGGCAACTAAGCATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCTCCTCTGTCCCGAAGGAAAGGTCTATCTCTAGACCGGTCAGAGGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATACTCCACTGCTTGTGCGGGTCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAATGCTTAATGTGTTAACTTCGGCACCAAGGGTATCGAAACCCCTAACACCTAGCATTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGCGTCAGTTACAGCCCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGCTCCCCAGTTTCCAGTGCGACCCGAAGTTGAGCCTCGGGATTAAACACCAGACTTAAAGAGCCGCCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCCCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGGGCTTTCTTCTCAGGTACCGTCACTCTTGTAGCAGTTACTCTACAAGACGTTCTTCCCTGGCAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGGCTTTCGCCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTAGGCCTTTACCCCACCAACTAGCTAATGCGCCGCAGGCCCATCCACAAGTGACAGATTGCTCCGTCTTTCCTCCTTCTCCCATGCAGGAAAAGGATGTATCGGGTATTAGCTACCGTTTCCGGTAGTTATCCCTGTCTTGTGGGCAGGTTGCCTACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAGGTTATTAGAAGCAAGCTTCTACACAACCCCGCTCGACTGCA-3’，通过比对发现，所述菌株与标准菌株Paenibacillus polymyxa ATCC 842菌株具有98.5％以上的相似性，进而确认其为多粘类芽孢杆菌，并命名为多粘类芽孢杆菌Mxdg-1(亦名：4F2)，并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.26495。

实施例2

多粘类芽孢杆菌Mxdg-1功能检测，步骤如下：

1)菌株固氮酶活性定量检测：将多粘类芽孢杆菌Mxdg-1接种到LB培养基中，30℃，180r/min振荡培养2d，得到多粘类芽孢杆菌Mxdg-1菌液；移取上述菌液5mL转入20mL顶空瓶中，压盖封口，从瓶中抽出2mL气体，再注入等体积乙炔，继续培养24h，气相色谱仪检测生成的乙烯含量。气相色谱条件：PLOT/Q填充毛细管色谱柱(30mm×0.53mm×40mm)，载气为氮气，流速为2.0mL/min；进样口温度200℃，分流比10:1；升温恒定温度60℃，保持6min。FID检测器：温度250℃，氢气40mL/min，空气450mL/min，尾吹氦气30mL/min。

固氮酶活性按如下公式计算，计算结果除以菌液的浊度，标准化为单位浊度菌液固氮酶活性。

结果表明，多粘类芽孢杆菌Mxdg-1的固氮酶活性为2.624±0.023nmoL/mL

2)菌株解磷特性测定：取30μL步骤1)中制备的菌液接种到NBRIP固体培养基上，置于30℃恒温培养，7d内定期观察培养基上是否产生解磷圈及其大小，根据菌株解磷圈的大小确定其解磷能力的高低。结果表明，多粘类芽孢杆菌Mxdg-1不解磷。

3)硝化力测定：将多粘类芽孢杆菌Mxdg-1接种到LB培养基中，30℃，180r/min振荡培养2d，离心收集菌体，无菌水重悬至OD600为1.0，再接入灭菌的改良斯蒂芬逊培养基，30℃、180r/min振荡培养2d，测定OD600值，按亚硝酸盐氮、硝酸盐氮试剂盒所述方法检测含量，以下列公式计算硝化力，计算结果除以相应菌液的浊度，标准化为单位浊度菌液的硝化力。每个菌株重复3次，计算平均值。

结果表明：多粘类芽孢杆菌Mxdg-1的硝化力为1.11±0.03％。

4)嗜铁素相对含量测定：将多粘类芽孢杆菌Mxdg-1接种于LB培养基培养后离心，得嗜铁素发酵上清液(SCS)，将SCS和络天青S(CAS)两种溶液以1:1的比例混合，黑暗下37℃恒温水浴0.5h后测定混合物OD630，以下列计算公式得出菌株的嗜铁素相对含量。菌株的嗜铁素相对含量＝(Ar-As)/Ar×100％，其中，Ar是参比物的OD630(空白对照与CAS的混合物)；As是样品OD630(菌株SCS与CAS的混合物)。计算结果除以相应菌液的浊度，标准化为单位浊度菌液的嗜铁素相对含量。

结果表明：多粘类芽孢杆菌Mxdg-1嗜铁素相对含量为52.95±0.14％。

5)激素含量测定：将多粘类芽孢杆菌Mxdg-1接种到LB培养基中，30℃，180r/min振荡培养2d，4℃，5000r/min离心10min，0.22μm微孔滤膜过滤，收集滤液，超高效液相串联质谱法(UPLC-MS)测定菌液水杨酸、茉莉酸、脱落酸、赤霉素(3、4、7)、生长素(吲哚乙酸、吲哚丁酸、4-氯吲哚乙酸)、细胞分裂素(玉米素、激动素、异戊烯腺嘌呤)等激素含量(由第三方郑州芯之翼生物科技有限公司检测)。测定结果除以相应菌液的浊度，标准化为单位浊度菌液的激素含量。

结果表明，多粘类芽孢杆菌Mxdg-1只含有吲哚乙酸和水杨酸，含量分别为16.902±0.454ng/mL，1.345±0.072ng/mL。

6)菌株产ACC脱氨酶活性测定：将多粘类芽孢杆菌Mxdg-1在LB培养基中30℃，180r/min震荡培养1d，然后4℃，8000r/min离心10min，弃上清，菌体用无(NH

结果表明，多粘类芽孢杆菌Mxdg-1没有ACC脱氨酶活性。

7)菌株产酶活性测定：将多粘类芽孢杆菌Mxdg-1接种于灭菌的50mL LB培养基中，30℃、180r/min振荡培养2d，过滤，收集菌体，无菌水溶解至浊度OD

结果表明，多粘类芽孢杆菌Mxdg-1木质素酶、纤维素酶、漆酶、几丁质酶、木聚糖酶活性分别为：4.785±0.245、12.157±0.742、12.387±0.942、2.801±0.117、0.163±0.007U/mg。

8)将多粘类芽孢杆菌Mxdg-1的PDB培养基发酵液代谢组检测：取5mLPDB培养基发酵液于10mL离心管中，放入冻干机中冻干12h；取冻干后的样本(30.6mg)加入800μL的甲醇，涡旋30s后转移至2mL离心管中，加入内标(2.8mg/mL，二氯苯丙氨酸)，涡旋30s；4℃超声30min；于-20℃静置1h；4℃，12000rpm离心15min；移取上清于进样小瓶中待检测分析。仪器分析平台：LC-MS(Thermo,Ultimate 3000LC,QExactive)，色谱柱：C18色谱柱(HypergoldC18(100x2.1mm 1.9μm))，色谱分离条件为：柱温为40℃；流速0.3mL/min；流动相组成A：水+0.1％甲酸，B：乙腈+0.1％甲酸；进样量为4μL，自动进样器温度4℃。流动相梯度洗脱程序见表1。质谱检测参数正模式：加热器温度300℃；鞘气流速45arb；辅助气流速15arb；尾气流速1arb；电喷雾电压3.0KV；毛细管温度350℃；S-Lens RF Level30％。负模式：加热器温度300℃；鞘气流速45arb；辅助气流速15arb；尾气流速1arb；电喷雾电压：3.2KV；毛细管温度：350℃；S-Lens RF Level60％。扫描模式：一级全扫描(Full Scan，m/z 70-1050)与数据依赖性二级质谱扫描(dd-MS2，TopN＝10)；分辨率70000(一级质谱)&17500(二级质谱)。碰撞模式：高能量碰撞解离(HCD)。数据处理：

使用Compound discoverer软件(Thermo公司)对LC/MS检测数据进行提取和预处理，整理成二维数据矩阵形式，包含保留时间(RT(Retention time))、分子量(MolecularWeight)、观察量(样本名称)、峰强度等信息；结果如表2所示。

表1液相色谱流动相条件

表2多粘类芽孢杆菌Mxdg-1的PDB培养基发酵液代谢组检测结果

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结果表明：共检测出各种化合物259种(图1～2分别为正负离子流色谱图)，根据现有文献记载，将检测到的化合物的功能分类总结如下：1)具有抗菌作用的物质有：新绿原酸、印咪唑啉、十八胺、大马士革宁、氧化苦参碱、硫秋水仙苷等。2)具有抗病毒作用的物质有：2-脱氧-D-核糖、2,6-二甲氧基酚等。3具有促生作用的物质有：吲哚乙酸。4)作为农药成分或其中间体物质有：盐酸利多卡因、邻苯二甲酸二乙酯、2-氨基烟酸、4-甲基二苯甲酮、氧化苦参碱、三乙醇胺、异喹啉、磷酸三乙酯、3-吡啶甲醇、邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯、N-乙酰-L-亮氨酸、2-异丙基-6-甲基-4-吡啶醇、N,N-二异丙基乙胺等。5)抗氧化作用物质有：咖啡酸。6)具有杀虫作用的物质有：联苯肼酯、氧化苦参碱、异喹啉、磷酸三乙酯、二苯甲酮、3-吡啶甲醇、邻苯二甲酸二丁酯、2-异丙基-6-甲基-4-吡啶醇等。7)除草物质有：氯苯胺灵、N,N-二异丙基乙胺。8)氨基酸、多肽及衍生物：种类多，功能未知。如：N-乙酰-DL-缬氨酸、N-乙酰-DL-色氨酸、甘氨酰-L-亮氨酸、L-丙氨酰-L-脯氨酸、L-色氨酰甘氨酸、缬氨酰-苯丙氨酸、丙氨酰-L-酪氨酸、L-亮氨酰-L-酪氨酸等。9)群体感应信号物质：辛酰基-L-高丝氨酸内酯。由此可以推测，多粘类芽孢杆菌Mxdg-1的PDF培养基发酵液主要作用为病虫害防治。

实施例3

多粘类芽孢杆菌Mxdg-1抑薹抗病，步骤如下：

设置试验组，如下：

处理组(T)：PDB培养基28℃，180r/min培养2天的多粘类芽孢杆菌Mxdg-1发酵液，用水稀释100倍至有效活菌菌数为10

阴性对照组(CK)：PDB培养基不加菌，与处理组稀释同样倍数，每亩地喷施20升。

试验采用单因素完全随机设计，设T及CK共2个处理，每处理3次重复，小区面积30m

6月底统计出苗数，因根腐病和立枯病引起的死苗数，按如下公式计算发病率和病害抑制率，发病率＝死苗数/(出苗数+死苗数)；病害抑制率＝(对照发病率-处理发病率)/对照发病率。

8月底统计抽薹数，按如下公式计算早薹抑制率，早薹抑制率＝(对照抽薹率-处理抽薹率)/对照抽薹率。

10月底采挖时统计麻口病率，以归头、归身麻口面积超过5％定义为麻口病株，按如下公式计算麻口病抑制率，麻口病抑制率＝(对照麻口率-处理麻口率)/对照麻口率。

多粘类芽孢杆菌Mxdg-1处理当归后，早薹和病害情况见表3。大苗能更好的验证抑薹效果，因此选用芦头部位直径为0.8-1cm的大苗进行试验。当归种植中，主要受镰刀菌影起的根腐病、立枯病影响，造成死苗；受虫害(主要为线虫)和病害综合影响，造成麻口病较CK，多粘类芽孢杆菌Mxdg-1处理后，病害抑制率为64.8％。早薹抑制率为24.5％，麻口抑制率为78.9％。

表3菌剂对当归早薹和病害的影响

实施例4

多粘类芽孢杆菌Mxdg-1对当归内源生理生化状态的影响，步骤如下：

在实施例3中多粘类芽孢杆菌Mxdg-1第4次处理后7天，每小区随机选取当归10株，剪下第3～5位同样位置功能叶，混样装入样品袋中，液氮速冻，-80℃保存，待测定相关指标。

(1)酶活测定：按试剂盒所述分光光度法测定当归叶片过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、多胺氧化酶、二胺氧化酶、多酚氧化酶活性和丙二醛(MDA)、过氧化氢含量。每个样品重复3次，取平均值，结果如表4所示。

表4生理生化指标检测(x±se，n＝3)

由表4可知，较对照，检测的活性氧清除酶系，多酚、多胺氧化酶系，丙二醛和过氧化氢，除了二胺氧化酶(DAOX)外，其他指标虽然均存在显著差异，但不同指标变化幅度差异较大，变化幅度越大影响越大。FC值为相关指标中菌株Mxdg-1处理值与CK值的比，log2(FC)的绝对值大于1的指标为过氧化物酶(POD)和过氧化氢含量，其次，丙二醛-0.94也接近于1。POD稳定性强于SOD和CAT，具有明显的长效性。上述相关数据表明，多粘类芽孢杆菌Mxdg-1处理显著的改善了胁迫造成的氧化损伤。

(2)内源激素检测：

超高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS)测定当归叶片内源激素褪黑素(MT)、水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)、脱落酸(ABA)、赤霉素(3、4、7)、生长素(吲哚乙酸、吲哚丁酸、4-氯吲哚乙酸)、细胞分裂素(玉米素、激动素、异戊烯腺嘌呤)含量。每个样品重复3次，取平均值，结果如表5所示。

表5内源激素检测(x±se，n＝3)ng/g

由表5可知，较对照，不同激素含量虽然均存在显著差异，但不同指标变化幅度差异很大，变化幅度越大影响越大。FC值为相关指标中菌株Mxdg-1处理值与CK值的比，log2(FC)的绝对值大于1的指标为褪黑素(MT)，茉莉酸(JA)，脱落酸-0.91也接近1。褪黑素和茉莉酸不仅增强植物的抗胁迫性，而且具有抑制抽薹的作用，并且与光周期相关；脱落酸是响应干旱胁迫的最主要的內源激素，干旱造成內源脱落酸显著提高，抽薹率显著上升。多粘类芽孢杆菌Mxdg-1处理，成倍的提高了內源褪黑素和茉莉酸含量，成倍的降低了脱落酸含量，抑薹效果显著。

(3)内源多胺检测

超高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS)测定当归叶片腐胺(PUT)、酪胺(TYR)、苯乙胺(PEA)、色胺(TRP)、精胺(SPM)和亚精胺(SPD)含量。每个样品重复3次，取平均值，结果如表6所示。

表6多胺含量检测(ng/g，x±se，n＝3)

由表6可知，较对照，不同多胺含量虽然均存在显著差异，但不同指标变化幅度差异很大，变化幅度越大影响越大。FC值为相关指标中菌株Mxdg-1处理值与CK值的比，log2(FC)的绝对值大于1的指标为腐胺、苯乙胺、色胺。腐胺具有促进植物开花的作用，多粘类芽孢杆菌Mxdg-1处理，成倍的降低腐胺，抑薹效果显著。

由以上结果可知：本发明所述的多粘类芽孢杆菌Mxdg-1，可以调控当归的生理生化状态，起到抑制当归早薹和抑制真菌病害的作用。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。