一株里氏假单孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体为一株里氏假单孢杆菌及其应用。

背景技术

土壤盐碱化是土地退化的主要表现之一，现已成为世界灌溉农业可持续发展的制约因素。据统计，新疆盐碱化面积约占灌区耕地面积的1/3，土地利用率低，严重制约了当地农业发展，盐碱地的改良与防治已成为社会经济可持续发展的重要内容。

在盐碱地的利用上，国内外的研究者对盐碱地的治理和改良都进行了相关的研究和施行。将治理和改良方法分为物理改良、生物改良、化学改良、水利改良四大类。其中，生物改良多是植树造林，种植耐盐的树木，抗盐性强的植物，防风固沙的同时，也可以有效改善盐碱地的土壤构造、增强土壤的肥力，从而有效地防止土壤盐分在地表土中的积聚；还使用微生物菌肥，降低土壤碱性，采用菊芋、海葵新品种，建立种植带都是目前可行的措施。

而微生物中的植物根际促生菌(plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)是指自由生活在土壤或附生于植物根系的一类可促进植物生长及其对矿质营养的吸收和利用，并能抑制有害生物的有益菌类。现有报道的PGPR在改善盐土、促进植物耐盐性的研究主要集中在假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、芽胞杆菌属(Bacillus sp.)、黄杆菌属(Flavobacteria)和固氮菌属(Azotobacter)等菌株筛选上，并对它们在不同植株作物上研究较多。其中，假单胞菌属(Pseudomonas sp.)目前只针对番茄的耐盐促生长上研究较多，如现有技术中公开了一株耐盐促生菌菌株B9，能在盐胁迫下显著提高番茄的耐盐促生能力，将该菌株制成的番茄耐盐促生剂，能明显增大番茄的株型，促进番茄幼苗的干物质积累，减缓了盐害现象，从而促进番茄幼苗的生长，有助于提高番茄的耐盐性。然而所述耐盐促生的菌株B9耐盐能力较弱，而假单胞菌属(Pseudomonas sp.)在棉花、小麦盐渍土壤修复以及耐盐的根际促生菌的筛选上还少有研究，在盐碱地的利用和开发上，有必要研究出新的小麦耐盐的根际促生菌，为盐碱地的利用提供更多更高效的耐盐促生菌选择。

微生物菌肥生产中运用的菌种以细菌肥为主，细菌具有较强的自发突变性，且位于质粒上的基因不稳定，其菌株的特性在繁殖过程中很容易减弱或消失，优良基因也会消失，因此在研发和试验过程中表现好的菌肥，在推广和应用中效果往往较差。菌种效能的不稳定性和单一性使得在工厂化生产中存在菌株资源匮乏、活菌数量少、有效期短等问题。在投入生产时，对于生产环境和监管要求较高，只有极少数企业能够严格按照要求生产，这使微生物菌肥的批量化生产面临挑战。

微生物菌肥发挥效用与外部环境如空气温度、湿度、光照强度、土壤含水量、pH值等有关。我国幅员辽阔，不同农业种植区的外部环境不同，微生物菌肥所能发挥的效用也不尽相同。即使对同种作物来说，在不同外部环境中，施以相同的菌肥，其能发挥的效用仍然存在差异。微生物菌肥无法广泛应用于各种植物。我国物种资源丰富，每种植物都有其自身的生理生化特性。微生物菌肥往往只针对某种特定的植物有高效作用，而无法广泛应用于不同植物。不同微生物菌肥的作用机制和作用效果都不尽相同。目前市场上微生物菌肥产品种类繁多，但其针对性不强，无法解决专一性问题，在菌株的组合上不够科学、缺乏创新微生物菌肥作为高效能、低成本的肥料。

发明内容

解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一株里氏假单孢杆菌及其应用，为盐碱地的利用提供更多更高效的耐盐促生菌选择。

(二)技术方案

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一株里氏假单孢杆菌LS-K1-3-2菌株，所述菌株于2023年2月10日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，菌种保藏编号为CGMCC No：26538。

具体地，所述菌株的16S r DNA的核苷酸序列如SEQ、ID所示。

本发明从新疆土壤中分离得到一株里氏假单孢杆菌，制备土壤悬液后，将所得细菌培养液106稀释涂布，挑取生长良好的单菌落进行培养，在小麦“新春9号”上经过3次以上的接种实验，该耐盐菌剂能明显提高小麦的成活率和叶绿素含量，显著促进小麦的干物质积累，并对小麦的根长、表面积、根体积均有促进作用，减缓了盐害现象，从而促进小麦幼苗的生长，同时还能减少化学肥料的使用。

(三)有益效果

与现有技术相比，本发明提供了一株里氏假单孢杆菌及其应用，具备以下

有益效果：

本发明提供的一株耐盐促生的假单胞菌(Pseudomonas sp.)RL-WG26菌株及耐盐菌剂，用于盐胁迫中促进小麦生长的应用。将耐盐菌剂注入小麦幼苗根围土壤中，能明显提高植株的成活率、株高、茎粗，显著减缓离子毒害现象，并对小麦幼苗的根长、根表面积、跟体积均有促进作用，减缓了盐胁迫现象；并且在非盐胁迫下，施加耐盐促生菌RL-WG26后小麦的根长和根面积都高于对照组，表明在非盐胁迫下施加耐盐促生菌RL-WG26后也能促进小麦的生长，从而促进水稻幼苗的生长，有助于提高小麦的耐盐性，减少化学肥料使用。该耐盐促生菌菌株具有广泛的应用前景，为运用PGPR来缓解作物盐害提供了理论依据和技术支撑。

附图说明

图1为本发明RL-WG26在LB固体培养基上的菌落形态；

图2为菌株K-1-3-2的革兰氏染色照片；

图3为本发明RL-WG26的系统发育树。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

菌株的分离和筛选

取黑碱地土壤样本置于锥形瓶内，并加入有100m L无菌水，用隔菌膜封住锥形瓶口，置于摇床内，180rpm30℃恒温振荡1h，得到土壤悬液。把得到的土壤悬液接种于含5％NaCl的LB培养基中，30℃振荡培养24h后，转接于10％Na Cl的LB培养基中，30℃振荡培养24h后，将所得细菌培养液106稀释涂布，挑取生长良好的单菌落进行培养。首先根据菌落颜色，大小及形态挑取单菌落于相应培养基上连续划线纯化5次以上，然后对分离菌株的划线平板进行拍照，结果如图1所示；并转接于LB液体培养基中，30℃振荡180rpm培养24h后，摇菌至细菌指数生长期时保存于25％的甘油水溶液中，冻存于-80℃冰箱备用。

实施例2：

1.菌株的鉴定

菌株的形态学特征：

图一所示：在TSA培养基上30℃培养24h后形成杆状。菌落光滑、粘稠、呈淡黄色。

2.细菌DNA提取：

将上述分离得到的菌株接种到LB培养基中，置于摇床中30℃180rpm条件下培养18。取培养后的菌液1m L，进行离心并收集菌体，用细菌DNA提取试剂盒提取基因组DNA，得到的DNA用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，-20℃保存备用。

3.菌株16S r RNA基因序列的PCR扩增：

以上述细菌DNA为模板，扩增引物采用细菌通用引物：

正向引27(F)5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’；

反向引物1492(R)5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’；

采用50μL PCR扩增体系：22μL无菌水，正向和反向引物各1μL，25μL r-Taq miμL目标微生物基因组DNA。

扩增反应程序：①95℃预变性2min，②95℃变性30s，③55℃退火30s，④72℃延伸1.5min，步骤②～④进行33个循环后，体系在72℃继续延伸10min，扩增产物保存于4℃。PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶(含0.01％Gel Red)电泳检测，以DNA Marker 2000作为参照，并置于0.5×TAE缓冲液内130V恒压电泳30min。随后在凝胶成像系统下观察PCR扩增产物条带，用Ta Ra Ka公司的切胶回收试剂盒进行PCR扩增产物的回收。

4.菌株16S r RNA基因序列测序与菌种鉴定：

将上述PCR扩增产物送由南京金唯智生物公司进行测序，并将所得16S r RNA基因序列上传至NCBI并进行比对，筛选亲缘关系较近的种属进行基于16S r RNA基因序列的系统发育分析，系统发育树如图2所示。

同时，基于16S r RNA基因序列分析结果，最终将该菌株鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas sp.)，命名为Pseudomonas sp.LS-K-1-3-2。该菌株于2023年2月20日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No：26538，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

实施例3：

菌株LS-K-1-3-2的耐盐性能试验

挑选大小一致、饱满的小麦品种新春9号种子用2％的Na Cl溶液表面消毒15min，用去离子水反复冲洗种子多次，置于去离子水中浸种24h，再将其置于铺有湿润纱布的培养皿上，27℃催芽2d。选取出芽一致的种子播种于，待幼苗长至三叶一心时移植到塑料盆(670×410×150mm)中，盐水为10％ Na Cl溶液。

小麦耐盐菌剂的配制：将菌株LS-K1-3-2接种于LB液体培养基，180rpm、30℃下培养至OD600为1.0得到菌液，将菌液5000rpm的转速离心10min，弃上清液，再注入等体积的ddH2O，振荡重悬浮后，以5000rpm的转速离心10min，弃上清液，重复2次，重悬浮后即得小麦耐盐菌剂。

本实验设0、1％和2％三个盐度处理，以适当浓度的盐水对小麦土进行浇灌，充分混匀后测定水层盐度，制备得测试用含盐土壤。

实验设置(1)非盐胁组：盐度浓度为0，采用自来水浇灌，(2)盐胁迫组：盐度浓度为

1％、2％，以及小麦耐盐菌剂处理组，采用菌株LS-K-1-3-2制备得到的耐盐菌剂。

各处理组按设定的盐浓度浇灌，在小麦耐盐菌剂在盐浓度处理后1d施用，每株幼苗根际注入2mL小麦耐盐菌剂。实验小麦设置三个重复一组30棵苗，处理30d后采样进行指标测定。整个培养过程在温室中进行，温度：白天26±5℃及夜间21±5℃，相对湿度：白天40％±10％及夜间45％±6％。

以下试验均按照非盐胁组、盐胁迫组和小麦耐盐菌剂处理组进行处理。

1.小麦成活率实验测试：

取上述小麦幼苗，移植到含盐土壤中，从全部小麦幼苗种下开始，记录成活率，随后每天记录各植株生长情况，实验结果见表1所示。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

结果如由表1所示，由此可知在盐胁迫下，小麦的成活率受到了明显的抑制，在1％和2％盐度处理下，小麦成活率为0；而在加了小麦耐盐菌剂的处理组中，水稻的成活率显著提升，分别提升到了71％和35％。

2.叶绿素含量测定：

取上述耐盐实验的小麦的叶片，采用分光光度法测定叶绿素含量浓度，将小麦的叶片洗净并吸干外附水分，用打孔器准确在主脉两侧钻取健康绿色叶圆片并剪碎叶片，称取0.20g，加入95％乙醇10ml，放入黑暗环境，直至无绿色为止。将提取液倒入比色皿，以95％乙醇为空白，分别于665波长下比色测定，记录吸光度。计算得到植物叶片的叶绿素含量。

检测结果如表2所示，由此可知在盐胁迫下，小麦的叶绿素含量明显被抑制，在1％和2％盐度处理下，叶绿素a比对照组分别降低了77％和88％；而在小麦耐盐菌剂处理组中：在1％盐度下，处理组植株较未施加小麦耐盐菌剂植株的叶绿素a提高了216％；在2％盐度下，处理组植株较未施加小麦耐盐菌剂植株的叶绿素a和提高了238.4％。

3.小麦根部钾、钠、钙离子含量测定：

称取上述耐盐实验的小麦的地下部，粉碎过筛样品0.15g样品，准确记录称样量，硝酸-高氯酸(混酸比例4：1)混酸6ml，置于消化炉内进行消化，消解至清凉后定容至100ml容量瓶中，过滤后待测钾、钠、钙离子含量。小麦茎叶中钠、钙离子含量采用电感耦合等离子体发射光谱仪测定，钾离子含量采用硝酸-高氯酸消解处理，火焰光度计测定。具体测量数据如下表3所示。

结果由表3可知，在非盐胁迫下，加小麦耐盐菌剂后的Ca+浓度下降，下降了2.7％；在1％盐胁迫下，加了小麦耐盐菌剂的小麦地上部Ca+浓度比不加菌剂的升高了239.3％。在2％盐胁迫下，加了小麦耐盐菌剂的小麦根部Ca+浓度比不加菌剂的地上部Ca+提高，提高了404.7％；在非盐胁迫下，小麦地上部的Na+降低了，降低了25％。在1％和2％盐胁迫下，小麦地上部加小麦耐盐菌剂的Na+含量与不加促生剂的相比也都降低了，分别降低了44％和54.4％；而K+与Na+相反，在非盐胁迫下，施加小麦耐盐菌剂的K+含量与不施加相比，提高了12.5％。在1％和2％盐胁迫下，小麦地上部加小麦耐盐菌剂的K+含量与不加菌剂的相比也都升高了，分别升高了43.2％和86.6％.

综上所述，施加耐盐促生菌LS-K1-3-2后的小麦品种“新春9号”在盐胁迫下，成活率显著提高，分别提升到了71％和35％。。其叶绿素含量有明显的提升，能够有效的调节植物体内离子的含量。且在非盐胁迫下，施加小麦耐盐菌剂后的小麦品种“新春9号”明显缓解盐害现象，促进水稻的生长。

序列表

<110>沃达农业科技股份有限公司

<120>一株里氏假单孢杆菌及其应用

<160>1

<170>SIPOSequenceListing 1.0

<210>1

<211>1432

<212>RNA

<213>里氏假单孢杆菌为Pseudomonas lini

<400>1

GGGGAGGCGCTACCTGCAGTCGAGCGGCAGCACGGGTACTTGTACCTGGTGGCGAGCGGCGGACGGG

TGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGATAACGCTCGGAAACGGACGCTAATACCGCAT

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