高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌基因工程菌、构建方法和应用

技术领域

本发明属于生物化工和能源开采技术领域，特别涉及一种高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌基因工程菌、构建方法和应用。

背景技术

石油是世界上重要的不可再生资源之一。经历利用天然能量进行开采的一次采油、注水开采的二次采油之后，仍有大量原油残留于地层，利用物理、化学和生物方法对于这部分原油进行开发的三次采油目前成为我国提高采收率的重要技术手段。微生物驱油是将微生物及产物注入地下来提高采收率的一种方法，将微生物代谢产生的生物表面活性剂或富含生物表面活性剂的发酵液注入地下进行微生物驱油、吞吐、清防蜡均属于微生物驱地面发酵法。生物表面活性剂是微生物代谢产生的集亲水极性基团和疏水基团于一体的两亲性物质，其于原油作用具有增溶、乳化、润湿、发泡、分散、降低表界面张力等性能从而有利于提高原油采收率，同时与化学表活剂相比，生物表活剂具有无毒环保、可生物降解、生态安全、表面活性高等特点。

鼠李糖脂类生物表活剂是石油开采中较常使用的糖脂类阴离子生物表面活性剂，其亲水基一般由1～2分子的鼠李糖环构成，疏水基则由1～2分子具有不同碳链长度饱和或不饱和脂肪酸构成。鼠李糖脂具有良好的乳化性能，表面活性高(降低表面张力至25～30mN/m)，临界胶束浓度低(40～150mg/L之间)，可生物降解、生态安全，产生菌种丰富，底物来源广泛，结构多样，应用范围较广，其对石油烃的去除及驱替效果优于化学表面活性剂，可用于微生物驱及含油污泥、污水的生物处理。鼠李糖脂类生物表面活性剂除用于石油工程之外，还可用于化工、医药、日化等领域。鼠李糖脂生物合成的糖基和脂基前体物质均依赖于细胞的中心代谢途径，其中两个关键酶是鼠李糖基转移酶I(复合酶RhlAB，由rhlAB基因编码)和鼠李糖基转移酶II(RhlC由rhlC基因编码)，鼠李糖基转移酶I负责合成单鼠李糖脂，单鼠李糖脂在鼠李糖基转移酶II催化下，结合另一鼠李糖基团，合成双鼠李糖脂。oprL是维持细胞膜完整性的肽聚糖相关脂蛋白的编码基因，其启动子PoprL是组成型强启动子；该基因广泛存在于多种属假单胞菌中，保证了PoprL在宿主菌种能够被有效识别。

目前对于鼠李糖脂的生物发酵仍存在自然筛选菌株发酵产量不高，从而影响生物表活剂生产规模及发酵生产成本，限制了以鼠李糖脂为主的驱油及洗油体系的大规模工业化应用，且从自然界筛选得到的野生鼠李糖脂生产菌株铜绿假单胞菌作为一株兼性厌氧菌，其在厌氧条件下不产或低产鼠李糖脂，增加了地面发酵成本、增加染菌率，并限制了其作为外源菌注入地下，以期能够在油藏中原位代谢产生鼠李糖脂的应用。

发明内容

针对上述问题，一方面，本发明提出了一种高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌基因工程菌，命名为铜绿假单胞菌WJPAB，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.24852。

另一方面，本发明提出了一种铜绿假单胞菌基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：

利用重组质粒pBBRPorpAB转化铜绿假单胞菌WJ的感受态细胞，将得到的转化细胞培养后提取质粒；

对提取的质粒进行PCR，对PCR产物筛选阳性克隆得到铜绿假单胞菌基因工程菌。

进一步地，所述重组质粒pBBRPorpAB由铜绿假单胞菌WJ的强启动子PoprL和rhlAB基因进行基因重叠PCR后，所得融合基因片段Popr－rhlAB与pBBR1MCS－5载体连接而成；

其中，所述强启动子PoprL的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述rhlAB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，所述重组质粒pBBRPorpAB按照以下步骤构建：

以oprL的强启动子PoprL替换rhlAB基因的原始启动子，获得融合基因片段Popr-rhlAB并进行纯化；

将pBBR1MCS－5载体和纯化后的融合基因片段Popr－rhlAB分别进行酶切后，在DNA连接酶催化下，将融合基因片段Popr－rhlAB连接在pBBR1MCS－5载体上得到连接产物；

利用所述连接产物转化E.col iDH5α的感受态细胞，并对感受态细胞进行培养，利用pBBR1MCS－5载体上的引物M13－47/RV－M引物对细胞培养液进行PCR，得到重组质粒pBBRPorpAB。

进一步地，所述引物M13－47和RV－M的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8所示。

进一步地，获得融合基因片段Popr－rhlAB包括以下步骤：

以铜绿假单胞菌WJ的基因组为模板；

以引物rhlAB－C1/rhlAB－C2进行PCR扩增不包含启动子的rhlAB基因片段，引物rhlAB－C2引入Hind III酶切位点；以Porp－1/Porp－2为引物进行PCR扩增包含启动子PoprL的DNA片段，引物Popr－1引入Kpn I酶切位点；

以两个PCR产物的混合物为模板进行重叠PCR，即得融合基因片段Popr－rhlAB。

进一步地，所述引物rhlAB－C1、rhlAB－C2、Porp－1和Porp－2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

本发明还提供了一种包含所述铜绿假单胞菌WJPAB的发酵液/种子液。

进一步地，所述铜绿假单胞菌WJPAB的种子液可以在制备鼠李糖脂表面活性剂上应用。

进一步地，所述铜绿假单胞菌WJPAB的发酵液可以在原油采收中应用。

本发明的有益效果：

本发明所提供的铜绿假单胞菌基因工程菌株提高了鼠李糖脂产量，实验室摇瓶条件下发酵液中鼠李糖脂产量达到47.8g/L，与铜绿假单胞菌WJ的最高鼠李糖脂产量14.9g/L相比提高了3.2倍。

本发明所提供的铜绿假单胞菌基因工程菌株使得原本厌氧条件下无鼠李糖脂代谢能力的铜绿假单胞菌WJ产生了可在厌氧或少氧条件下代谢产生鼠李糖脂的能力，实验室摇瓶条件下厌氧产鼠李糖脂0.425g/L。

本发明所提供的铜绿假单胞菌基因工程菌株可稳定遗传10代，10代内可保证构建质粒及功能基因片段不丢失，产量无下降。

铜绿假单胞菌基因工程菌发酵液对原油有显著的乳化作用，可广泛乳化各种烃类，耐受高盐、高温和广泛pH的极端环境，能够很好的应用在采油及生态修复等领域。

本发明提供的铜绿假单胞菌基因工程菌可以将原油采收率提高至13.51％，显示出较强的驱油潜力。

本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所指出的结构来实现和获得。

附图说明

图1示出了本发明实施例1中pBBRP－oprAB转入WJ－1菌株初次验证成功的琼脂糖凝胶电泳图片；

图2示出了本发明实施例2中好/厌氧发酵排油圈图片(左图：好氧培养；右图：厌氧培养)；

图3示出了本发明实施例4中菌株好氧发酵液表面张力曲线及CMC分析图；

图4示出了本发明实施例4中0.4％发酵液乳化照片(左：摇匀后乳化效果；右：静置2h后乳化效果)；

图5示出了本发明实施例4中发酵液作用后含油污泥清洗效果；

图6示出了本发明实施例4中物理模拟实验岩心照片。

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

本发明定向改良铜绿假单胞菌菌株，以强启动子PoprL替换rhlAB基因的原始启动子，构建了融合基因Popr－rhlAB拷贝数增加的基因工程菌株。以下实施例中，铜绿假单胞菌(Pseudom onas Aeruginosa)WJ为野生型铜绿假单胞菌，铜绿假单胞菌(Pseudom onasAeruginosa)WJPAB为铜绿假单胞菌基因工程菌。

实施例1重组质粒pBBRPorpAB的构建

铜绿假单胞菌WJ来源的目标序列获得，原始菌株来源于室内保藏，筛选自华北油田蒙古林油田水样。

本实施例

1.1基因组DNA提取。

利用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生物，北京)提取铜绿假单胞菌WJ的基因组DNA，经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测后，利用Nanodrop2000检测其浓度和纯度，置于冰箱中－20℃保存备用。

1.2融合片段Popr－rhlAB的PCR扩增与纯化。

分别设计鼠李糖脂合成相关基因rhlAB编码区和包含组成型强启动子PoprL的oprL(肽聚糖相关脂蛋白编码基因)片段的引物，所述强启动子PoprL的核苷酸序列如SEQID NO.1所示；所述rhlAB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

以铜绿假单胞菌WJ基因组DNA为模板，以表1中引物rhlAB－C1/rhlAB－C2进行PCR扩增不包含启动子的rhlAB基因片段，引物rhlAB－C1中5’端包含19bp的PorpL DNA片段的序列，引物rhlAB－C2引入HindIII酶切位点，表1中划线部分为酶切位点。以铜绿假单胞菌WJ基因组DNA为模板，以表1中Porp－1/Porp－2为引物扩增包含启动子PoprL的DNA片段，引物Popr－1引入Kpn I酶切位点，引物Porp－2的5’端包含18bp的rhlAB基因序列。利用引物Popr－1和引物rhlAB－C2，以上两步PCR产物的混合物为模板，进行重叠PCR(overlapPCR)，获得的PCR产物，即为融合基因片段Popr－rhlAB。经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测后，利用DNA片段纯化试剂盒(Ta Ka Ra Mini BEST DNA Fragm ent Purification Kit)对获得的PCR产物进行纯化。

表1所用到的PCR引物

1.3重组质粒pBBRPoprAB的构建。

将上一步中纯化后的连接产物，利用CaCl

实施例2铜绿假单胞菌WJPAB的构建。

本实施例所构建的基因工程菌为基因工程铜绿假单胞菌，该菌命名为铜绿假单胞菌(Pseudom onas Aeruginosa)WJPAB，其已于2022年5月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，保藏编号为：CGMCC No.24852。

2.1铜绿假单胞菌WJ感受态细胞制备。

从LB平板上挑取新活化的铜绿假单胞菌WJ的单菌落，接种于5mL LB液体培养基中，在37℃180r/min条件下振荡培养14h，以1：100的比例接种于50mL新鲜LB液体培养基中，37℃，180r/min振荡培养2－3h至OD600＝0.5左右。将0.1mol/L的CaCl

2.2重组质粒pBBRPoprAB转化铜绿假单胞菌WJ的感受态细胞。

取8μL的重组质粒pBBRPoprAB与100μL的铜绿假单胞菌WJ的感受态细胞，轻轻摇匀混合，冰上放置30min；42℃水浴中，热激4min后，迅速置于冰上冷却3min；加入890μL SOC培养基，在37℃，120r/min条件下，复苏培养1h。取120μL转化液涂布于含有30mg/L庆大霉素Gm的LB培养基平板上，于37℃培养箱中培养48h。挑取单菌落到5mL含30mg/L庆大霉素Gm的LB液体培养基中，37℃，180r/min，振荡培养16h，进行质粒提取，对提取的质粒以M13－47/RV－M引物，进行PCR验证阳性克隆。

所述SOC培养基购自生工生物(上海)有限公司，蒸馏水配置比例34g/L，121℃灭菌20min后备用。

经过上述操作，在含Gm的LB培养基平板上，筛选获得的阳性克隆，即铜绿假单胞菌WJPAB。通过重组质粒pBBRPoprAB在细胞内的扩增，实现rhlAB基因的启动子替换和Popr－rhlAB融合基因拷贝数的增加。

铜绿假单胞菌基因工程菌中融合基因Popr－rhlAB的拷贝数计算的方法如下：

单个细胞中融合基因Popr－rhlAB基因拷贝数的计算公式：拷贝数＝6.02×1023×c/MW/N，其中c是线性化质粒的浓度(Nanodrop测定)，MW是线性化质粒的相对分子量(碱基数目bp×660)，N是用来提取质粒的2mL菌液中的菌体细胞数目。选取工程菌PoprAB菌液(平板计数得菌体浓度为5.69＊10

对构建的铜绿假单胞菌WJPAB进行质粒稳定性检测：

1)将铜绿假单胞菌WJPAB在含有庆大霉素30mg/L的LB平板上划线培养过夜，获得阳性工程菌单菌落；

2)从上述平板上挑取单菌落100个，点种到新鲜的含有庆大霉素的LB平板和不含抗生素LB平板，培养24h；

3)计算含有庆大霉素平板上能生长的单菌落百分比，同时将LB平板上的100个单菌落点种到下一轮新鲜的含有庆大霉素的LB平板和不含抗生素LB平板，培养24h；

4)点种10次，计算每轮在含有庆大霉素平板上能够生长的单菌落的百分率，计算铜绿假单胞菌WJPAB中重组质粒的稳定性。对于质粒的稳定性结果显示，铜绿假单胞菌WJPAB经过上述点种10次后，在含有庆大霉素抗性平板上能够长出的菌落比率为100％，说明本发明所构建重组质粒在铜绿假单胞菌WJPAB中能够稳定遗传10代。

实施例3利用铜绿假单胞菌WJPAB发酵制备鼠李糖脂表面活性剂

3.1、好氧发酵鼠李糖脂表面活性剂

(1)培养铜绿假单胞菌WJPAB种子液

将铜绿假单胞菌WJPAB在含有庆大霉素30mg/L的固体LB培养基上进行划线，倒扣37℃培养14h。挑取铜绿假单胞菌WJPAB单菌接种于5mL含有庆大霉素30mg/L的液体LB试管中，37℃，200r/min震荡培养过夜后，按1％接种量接种于50mL含有庆大霉素30mg/L的液体LB摇瓶中，37℃，200r/min震荡培养至对数期。

(2)培养铜绿假单胞菌WJPAB好氧发酵液进行发酵实验

上述培养好的铜绿假单胞菌WJPAB种子液(即对数期培养液)按照体积比5％的接种量接种入500mL好氧发酵培养基摇瓶中，35℃，200r/min震荡培养72～168h，96h前每日检测发酵液排油圈，96h后每4h检测发酵液排油圈，连续12小时排油圈无变化时结束发酵。

好氧发酵培养基配方为：豆油60g/L，甘油1g/L，硝酸钠2.5g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，12水合磷酸氢二钠6g/L，氯化钾1g/L，氯化钠1g/L，酵母粉5g/L，7水合硫酸镁0.04g/L，加水补足剩余体积，pH调整至7.0～7.2，121℃高压灭菌20min。

以上述同样的培养方法及好氧培养基对铜绿假单胞菌WJ进行发酵实验。

以上摇瓶实验使用排油圈法测试发酵液生物表面活性剂含量如下，排油圈图片如图2所示：

表2铜绿假单胞菌WJPAB菌株与铜绿假单胞菌WJ好氧发酵产量对比

由表2可以看出，在所述好氧发酵培养基条件下好氧培养，铜绿假单胞菌WJPAB和铜绿假单胞菌WJ培养96h，铜绿假单胞菌WJPAB的最高鼠李糖脂产量47.8g/L，与铜绿假单胞菌WJ的最高鼠李糖脂产量14.9g/L相比提高了3.2倍。

3.2厌氧发酵鼠李糖脂表面活性剂

铜绿假单胞菌WJPAB种子液按照3.1中培养铜绿假单胞菌WJPAB种子液步骤进行制备，制备后种子液按照体积比5％的接种量接种入500mL厌氧发酵培养基摇瓶中，35℃，厌氧瓶培养120～240h，72h后每12h检测发酵液排油圈，连续24小时排油圈无变化时结束发酵。

所述厌氧发酵培养基配方为：甘油70g/L，硝酸钠4.5g/L，磷酸二氢钾5g/L，3水合磷酸氢二钾6g/L，7水合硫酸镁0.4g/L，氯化钾1g/L，氯化钠1g/L。

以同样的培养方法及厌氧培养基对铜绿假单胞菌WJ进行发酵实验。

以上摇瓶实验使用排油圈法测试发酵液生物表面活性剂含量如下：

表3基因工程菌株与原始菌株厌氧发酵产量对比

由表3可以看出，在所述厌氧发酵培养基条件下厌氧培养，铜绿假单胞菌WJPAB和铜绿假单胞菌WJ培养240h后，铜绿假单胞菌WJPAB的最高鼠李糖脂产量0.425g/L，而铜绿假单胞菌WJ发酵液未测出鼠李糖脂含量，铜绿假单胞菌WJAB厌氧发酵液能降体系表面张力降低至35.6mN/m，而铜绿假单胞菌WJ厌氧发酵液无降低表面张力能力。

实施例4发酵液性能测试

4.1好氧发酵液临界胶束浓度及表面张力测定

表面活性剂在高于其临界胶束浓度(CMC)时，在溶液中形成胶束，当表面活性剂浓度高于CMC时，溶液表面张力不再继续下降，临界胶束浓度是衡量表面活性剂活性的重要指标之一。

发酵液的CMC通过表面张力法测定，在常温下，通过利用QZBY－1型表面张力仪测定一系列不同浓度下的表面张力(mN/m)，然后以表面张力值为Y轴，以发酵液浓度的对数值为X轴作图，曲线拐点处对应的溶液浓度，即为发酵液的CMC。在对选定的表面活性剂浓度进行测定时，当表面张力仪显示稳定时读数，一个样品连续操作3次，3次测定数值的误差小于0.2mN/m时表明达到平衡。

以发酵液浓度对数值和表面张力绘图如图3所示，测试得到好氧发酵液CMC值为123mg/L，此时表面张力降低至29.3mN/m。铜绿假单胞菌WJ PAB发酵液CMC值比一般化学表面活性剂低1～2个数量级，显示出本株菌株的优越性能。

4.2发酵液乳化活性测试

铜绿假单胞菌WJPAB好氧发酵液乳化活性以乳化系数EI

0.4％发酵液以长庆地层水配置体系，加入20％长庆脱水原油测试乳化效果。乳化24h之后，乳化层高度与总高度的比值为乳化系数EI

4.3洗油性能测试

生物表面活性剂一个重要应用在于对含油污泥的生态处理，本部分测试好氧发酵液对含油污泥的洗油效果。

以清水配置0.4％发酵液作为洗油剂，以1：3的泥液比加入脱水含油污泥样品中；加入洗油剂及污泥的烧杯置于恒温水浴，45℃搅拌10min后停止搅拌并静置1h；回收上层原油，移除废水，底部固体使用离心机3500rpm离心15min；移除废水，样品50℃烘箱干燥16h后称重，记录质量，再继续干燥4h称重，记录质量，继续干燥4h直至恒重；除油率按以下公式计算：

式中：A表示脱水含油污泥样品的质量(g)；A1表示抽提后试样的质量(g)。

洗油效果图如图5所示(高速摄像机拍摄)，经发酵液清洗后含油污泥除油率74.77％，经索氏抽提，含油污泥含油率由17.79％降低到了4.49％。

4.4驱油性能测试

物理模拟驱油实验是在模拟油藏条件下，运用多孔介质岩心模型，进行模拟油田开发和提高采收率的驱替实验，获取驱油体系的采收率，是评价驱油效果不可缺少的手段，同时也是研究驱油机理的主要方法。

实验材料：

驱油体系：

①地层水配置铜绿假单胞菌WJPAB发酵液(实施例3中的3.1(2)中的好氧培养发酵液)占比0.4％驱油体系，用量0.4PV(注入体积与孔隙体积比)；；

②地层水配置铜绿假单胞菌WJPAB发酵液占比0.6％驱油体系，用量0.4PV；

③地层水配置铜绿假单胞菌WJPAB发酵液占比0.4％驱油体系，用量0.6PV；

④地层水配置铜绿假单胞菌WJPAB发酵液占比0.6％驱油体系，用量0.6PV；

⑤地层水配置铜绿假单胞菌WJPAB种子液占比1％，加入营养激活体系，用量0.4PV；营养激活体系为：硝酸钠2g/L，磷酸二氢钾2g/L，12水合磷酸氢二钠4g/L，酵母粉3g/L；体系注入后关井7天。

⑥地层水配置铜绿假单胞菌WJPAB种子液占比3％，加入营养激活体系，用量0.5PV；营养激活体系为：硝酸钠2g/L，磷酸二氢钾2g/L，12水合磷酸氢二钠4g/L，酵母粉3g/L；体系注入后关井7天。

原油样品：取自大庆油田庆新采油厂；

水样：取自大庆油田注入水；

岩心：渗透率170mD的均质胶结岩心，岩心照片如图6所示。

实验方法：实验温度设定为油藏平均温度61.5℃，采用恒速法驱替，根据实验要求以及模型参数，驱替速度为1.0mL/min，原油进行了脱水处理。详细步骤如下：

a)选择模型，并测量模型的尺寸；

b)气测渗透率；

c)抽真空饱和水，测量孔隙体积并计算出孔隙度Ф；

d)饱和油，建立束缚水，计算束缚水饱和度Swc；

e)用注入水进行驱油，至极限含水率98％停止水驱，计算水驱采收率；

f)按照驱油体系①～⑥要求注入驱油体系，计算原油采收率；

h)后续水驱至含水98％时停止实验，计算总采收率。

实验结果：六组实施方案室内物理模拟驱油效果如表4所示，针对模拟高含水岩心，实施方案的驱油体系均提高了原油采收率，提高采收率6.50％～13.51％，多个驱油体系含水下降率超过10％。驱油体系④效果最佳，提高采收率13.51％，含水下降15％。

表4各驱油体系驱油效果

从实施例3和实施例4可以看出，铜绿假单胞菌WJPAB在好氧条件下鼠李糖脂产量较铜绿假单胞菌WJ有了提高，且增加了厌氧条件下产鼠李糖脂的能力，发酵液产量在好氧条件下提高3.2倍(由表3中数据得到)，并且发酵液显示了良好的乳化、洗油及驱油性能，最高能够将采收率提高13.51％。

本发明实施例中所涉及到的强启动子PoprL的核苷酸序列SEQ ID NO.1；rhlAB基因的核苷酸序列SEQ ID NO.2；引物rhlAB－C1的核苷酸序列SEQ ID NO.3；引物rhlAB－C2的核苷酸序列SEQ ID NO.4；引物Porp－1的核苷酸序列SEQ ID NO.5和Porp－2的核苷酸序列SEQ ID NO.6；引物M13－47的核苷酸序列SEQ ID NO.7；引物RV－M的核苷酸序列SEQ IDNO.8分别如下：

SEQ ID NO.1：

ttcatcggcaactacaacgccaacccgaaactctcggccgacgagaagaccctggtaatggtccaccgccagcagggctacaccaacttccagatcgccgcccaggacctccagcgcggcaatctgcgggtgctgtcgaacaccactctggacgattcgcccactgttgcgcccaatggcaccatgctaatctacgccacccgccagcaggaccggggcgtgctgatgctcgtatccatcaacggacgcgtacggatacctctccctaccgctcagggcgatgtgcgcgagccttcctggtccccttacctgaactgacggtcgccaacggttacaaacttatacactggggttcattaggagttacat

SEQ ID NO.2：

atgcggcgcgaaagtctgttggtatcggtttgcaagggcctgcgggtacatgtcgagcgcgttgggcaggatcccgggcgcagcacggtgatgctggtcaacggcgcgatggcgaccaccgcctcgttcgcccggacctgcaagtgcctggccgaacatttcaacgtggtgctgttcgacctgcccttcgccgggcagtcgcgtcagcacaacccgcagcgggggttgatcaccaaggacgacgaggtggaaatcctcctggcgctgatcgagcgcttcgaggtcaatcacctggtctccgcgtcctggggcggtatctccacgctgctggcgctgtcgcgcaatccgcgcggcatccgcagctcggtggtgatggcattcgcccctggactgaaccaggcgatgctcgactacgtcgggcgggcgcaggcgctgatcgagctggacgacaagtcggcgatcggccatctgctcaacgagaccgtcggcaaatacctgccgccgcgcctgaaagccagcaaccatcagcacatggcttcgctggccaccggcgaatacgagcaggcgcgctttcacatcgaccaggtgctggcgctcaacgatcggggctacctggcttgcctggagcggatccagagccacgtgcatttcatcaacggcagctgggacgaatacaccaccgccgaggacgcccgccagttccgcgactacctgccgcactgcagtttctcgcgggtggagggcaccgggcatttcctcgacctggagtccaagctggccgcggtacgcgtgcaccgcgccctgctcgagcacctgctgaagcaaccggagccgcagcgggcggaacgcgcggcgggattccacgagatggccatcggctacgcctgaacccttgacctgcgaagacccggcctggccgggctttgcggttgcataacgcacggagtagcaccatgcacgccatcctcatcgccatcggctcggccggcgacgtatttcccttcatcggcctggcccggaccctgaaattgcgcgggcaccgcgtgagcctctgcaccatcccggtgtttcgcgacgcggtggagcagcacggcatcgcgttcgtcccgctgagcgacgaactgacctaccgccggaccatgggcgatccgcgcctgtgggaccccaagacgtccttcggcgtgctctggcaaaccatcgccgggatgatcgagccggtctacgagtacgtctcggcgcagcgccatgacgacatcgtggtggtcggctcgctctgggcgctgggcgcacgcatcgctcacgagaagtacgggattccctacctgtccgcgcaggtctcgccatcgaccttgttgtcggcgcacctgccgccggtacaccccaagttcaacgtgcccgagcagatgccgctggcgatgcgcaagctgctctggcgctgcatcgagcgcttcaagctggatcgcacctgcgcgccggatatcaacgcggtgcggcgcaaggtcggcctggagacgccggtgaagcgcatcttcacccaatggatgcattcgccgcagggcgtggtctgcctgttcccggcctggttcgcgccgccccagcaggattggccgcaacccctgcacatgaccggcttcccgctgttcgacggcagtatcccggggaccccgctcgacgacgaactgcaacgctttctcgatcagggcagccggccgctggtgttcacccagggctcgaccgaacacctgcagggcgacttctacgccatggccctgcgcgcgctggaacgcctcggcgcgcgtgggatcttcctcaccggcgccggccaggaaccgctgcgcggcttgccgaaccacgtgctgcagcgcgcctacgcgccactgggagccttgctgccatcgtgcgccgggctggtccatccgggcggtatcggcgccatgagcctggccttggcggcgggggtgccgcaggtgctgctgccctgcgcccacgaccagttcgacaatgccgaacggctggtccggctcggctgcgggatgcgcctgggcgtgccattgcgcgagcaggagttgcgcggggcgctgtggcgcttgctcgaggacccggccatggcggcggcctgtcggcgtttcatggaattgtcacaaccgcacagtatcgcttgcggtaaagcggcccaggtggtcgaacgttgtcatagggagggggatgcgcgatggctgaaggctgcgtcctgaa

SEQ ID NO.3：

ggttcattaggagttacatatgcggcgcgaaagtctgttg

SEQ ID NO.4：

atagcaagcttcaggacgcagccttcagc

SEQ ID NO.5：

gactaggtacccttcatcggcaactacaac

SEQ ID NO.6：

cagactttcgcgccgcatatgtaactcctaatgaacc

SEQ ID NO.7：

cgccagggttttcccagtcacgac

SEQ ID NO.8：

agcggataacaatttcacacagga

尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 中国石油天然气股份有限公司

<120> 高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌基因工程菌、构建方法和应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 369

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttcatcggca actacaacgc caacccgaaa ctctcggccg acgagaagac cctggtaatg 60

gtccaccgcc agcagggcta caccaacttc cagatcgccg cccaggacct ccagcgcggc 120

aatctgcggg tgctgtcgaa caccactctg gacgattcgc ccactgttgc gcccaatggc 180

accatgctaa tctacgccac ccgccagcag gaccggggcg tgctgatgct cgtatccatc 240

aacggacgcg tacggatacc tctccctacc gctcagggcg atgtgcgcga gccttcctgg 300

tccccttacc tgaactgacg gtcgccaacg gttacaaact tatacactgg ggttcattag 360

gagttacat 369

<210> 2

<211> 2235

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgcggcgcg aaagtctgtt ggtatcggtt tgcaagggcc tgcgggtaca tgtcgagcgc 60

gttgggcagg atcccgggcg cagcacggtg atgctggtca acggcgcgat ggcgaccacc 120

gcctcgttcg cccggacctg caagtgcctg gccgaacatt tcaacgtggt gctgttcgac 180

ctgcccttcg ccgggcagtc gcgtcagcac aacccgcagc gggggttgat caccaaggac 240

gacgaggtgg aaatcctcct ggcgctgatc gagcgcttcg aggtcaatca cctggtctcc 300

gcgtcctggg gcggtatctc cacgctgctg gcgctgtcgc gcaatccgcg cggcatccgc 360

agctcggtgg tgatggcatt cgcccctgga ctgaaccagg cgatgctcga ctacgtcggg 420

cgggcgcagg cgctgatcga gctggacgac aagtcggcga tcggccatct gctcaacgag 480

accgtcggca aatacctgcc gccgcgcctg aaagccagca accatcagca catggcttcg 540

ctggccaccg gcgaatacga gcaggcgcgc tttcacatcg accaggtgct ggcgctcaac 600

gatcggggct acctggcttg cctggagcgg atccagagcc acgtgcattt catcaacggc 660

agctgggacg aatacaccac cgccgaggac gcccgccagt tccgcgacta cctgccgcac 720

tgcagtttct cgcgggtgga gggcaccggg catttcctcg acctggagtc caagctggcc 780

gcggtacgcg tgcaccgcgc cctgctcgag cacctgctga agcaaccgga gccgcagcgg 840

gcggaacgcg cggcgggatt ccacgagatg gccatcggct acgcctgaac ccttgacctg 900

cgaagacccg gcctggccgg gctttgcggt tgcataacgc acggagtagc accatgcacg 960

ccatcctcat cgccatcggc tcggccggcg acgtatttcc cttcatcggc ctggcccgga 1020

ccctgaaatt gcgcgggcac cgcgtgagcc tctgcaccat cccggtgttt cgcgacgcgg 1080

tggagcagca cggcatcgcg ttcgtcccgc tgagcgacga actgacctac cgccggacca 1140

tgggcgatcc gcgcctgtgg gaccccaaga cgtccttcgg cgtgctctgg caaaccatcg 1200

ccgggatgat cgagccggtc tacgagtacg tctcggcgca gcgccatgac gacatcgtgg 1260

tggtcggctc gctctgggcg ctgggcgcac gcatcgctca cgagaagtac gggattccct 1320

acctgtccgc gcaggtctcg ccatcgacct tgttgtcggc gcacctgccg ccggtacacc 1380

ccaagttcaa cgtgcccgag cagatgccgc tggcgatgcg caagctgctc tggcgctgca 1440

tcgagcgctt caagctggat cgcacctgcg cgccggatat caacgcggtg cggcgcaagg 1500

tcggcctgga gacgccggtg aagcgcatct tcacccaatg gatgcattcg ccgcagggcg 1560

tggtctgcct gttcccggcc tggttcgcgc cgccccagca ggattggccg caacccctgc 1620

acatgaccgg cttcccgctg ttcgacggca gtatcccggg gaccccgctc gacgacgaac 1680

tgcaacgctt tctcgatcag ggcagccggc cgctggtgtt cacccagggc tcgaccgaac 1740

acctgcaggg cgacttctac gccatggccc tgcgcgcgct ggaacgcctc ggcgcgcgtg 1800

ggatcttcct caccggcgcc ggccaggaac cgctgcgcgg cttgccgaac cacgtgctgc 1860

agcgcgccta cgcgccactg ggagccttgc tgccatcgtg cgccgggctg gtccatccgg 1920

gcggtatcgg cgccatgagc ctggccttgg cggcgggggt gccgcaggtg ctgctgccct 1980

gcgcccacga ccagttcgac aatgccgaac ggctggtccg gctcggctgc gggatgcgcc 2040

tgggcgtgcc attgcgcgag caggagttgc gcggggcgct gtggcgcttg ctcgaggacc 2100

cggccatggc ggcggcctgt cggcgtttca tggaattgtc acaaccgcac agtatcgctt 2160

gcggtaaagc ggcccaggtg gtcgaacgtt gtcataggga gggggatgcg cgatggctga 2220

aggctgcgtc ctgaa 2235

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggttcattag gagttacata tgcggcgcga aagtctgttg 40

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atagcaagct tcaggacgca gccttcagc 29

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gactaggtac ccttcatcgg caactacaac 30

<210> 6

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cagactttcg cgccgcatat gtaactccta atgaacc 37

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgccagggtt ttcccagtca cgac 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

agcggataac aatttcacac agga 24