用于单分子检测的纳米火车

通过引用并入

本申请要求于2021年4月24日提交的美国临时申请第63/179,186号的优先权和权益，其通过引用整体并入本文。

技术领域

本公开涉及用于分析物的单分子检测的一维水溶性纳米阵列(nanoarray)，本文称为纳米火车(nanotrain)，以及制造该阵列的方法。

背景技术

大多数疾病状态涉及或破坏多种生物化学途径，通常对各种生物标记物的量化对于全面诊断和了解疾病是必要的。例如，患者的miRNA图谱可以是一种诊断特征，这需要多个miRNA的量化。

众所周知的多重检测技术是将分子探针连接到固体表面的微阵列

在过去的二十年里，纳米孔技术已被开发用于核酸测序和分子检测。纳米孔是由生物材料组装或由无机材料制造的纳米直径和深度的孔。

附图说明

图1示出了运载不同分子负载物的示例性DNA纳米火车，当其易位通过纳米孔设备时，会引起离子电流的波动。

图2A-2D显示了将负载物装载到DNA纳米火车的示例性过程。

图3：合成DNA纳米火车头的示例性途径及其与微珠的连接以组装DNA纳米火车。

图4A-4B：(图4A)合成DNA车厢(carriage)组分的示例性途径；(图4B)合成用于组装DNA纳米火车的聚乙二醇连接子(linker)的示例性途径。

图5示出了在固体基底上合成DNA纳米火车的示例性合成循环。

图6示出了用于将亲和分子装载到纳米火车的车厢的示例性经修饰的DNA结构。

图7：将适体(aptamer)连接到含有氨基修饰胸苷的经修饰的DNA的示例性途径。

图8A-8B：(图8A)在其3'-端用叠氮官能化的聚乙二醇

图9A-9B：(图9A)制备通过PEG

图10：DNA纳米火车及其组分的凝胶电泳图像。

图11：DNA纳米火车与其互补部分杂交的凝胶电泳图像。

发明内容

在一个方面，提供了一种纳米火车，其包括：

多个线性排列的单链DNA车厢，每个车厢具有独特的序列；

多个互补DNA序列，每个互补DNA序列预先设计为与单链DNA车厢互补，并且每个互补DNA序列与其互补的单链DNA车厢杂交；

用于捕获一个或多个靶标的多个亲和分子，其中每个亲和分子构建为连接到互补DNA序列；和

多个柔性的连接子，其连接每两个相邻的单链DNA车厢，其中每个柔性的连接子在第一端处连接到第一单链DNA车厢的5'-端，并且在第二端处连接到第二单链DNA车厢的3'-端。

在一些实施例中，每个单链DNA车厢和每个互补DNA序列独立地选自异源核酸(XNA)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)和环己烯基核酸(CeNA)，其中优选每个单链DNA车厢和每个互补DNA序列的长度范围为6至1000个碱基。

在一些实施例中，每个互补DNA序列修饰为具有预先设计为将亲和分子连接到其上的官能团，其中优选所述官能团选自胺、硫醇、叠氮化物、炔烃、环炔烃或四嗪。

在一些实施例中，每个亲和分子独立地选自核酸、XNA、适体、配体、抗体、抗体片段、抗原、纳米抗体、亲和体、蛋白质和/或碳水化合物中的一种或多种。

在一些实施例中，每个亲和分子包括微粒，例如磁珠、胺、硫醇、叠氮化物、炔烃、环炔烃和/或四嗪。

在一些实施例中，一个或多个靶标选自多重蛋白质标记物、单核苷酸多态性(SNP)、DNA和RNA突变、基因组的结构变异、药物分子、抗体、抗原和聚糖。

在一些实施例中，每个单链DNA车厢还包括携带至少一种官能团的蛋白质分子，所述官能团与天然氨基酸中存在的那些官能团正交，例如氧胺(oxyamine)、肼、醛、叠氮化物、炔烃、环炔烃、烯烃或四嗪。

在一些实施例中，每个单链DNA车厢还包含带电荷的多糖，其携带官能团，例如硫醇、叠氮化物、炔烃、环炔烃、四嗪或氧胺。

在一些实施例中，每个柔性的连接子包含多肽，其具有以下结构：

其中n＝2至200；w＝1至10；z＝0至10

X＝O、NH或ONH；

R＝H、胺、硫醇、叠氮化物、炔烃、环炔烃、四嗪、羧酸盐、羟基、烷基、烯烃、胍或聚糖、硒；

R'＝叠氮化物、炔烃、环炔烃、四嗪或醛；

R”＝H、叠氮化物、炔烃、环炔烃、环辛烯、四嗪或醛。

在一些实施例中，每个柔性的连接子包括聚乙二醇，其具有以下结构：

其中n＝2至500；

X＝胺、马来酰亚胺、乙烯基砜、环辛烯、硫醇、叠氮化物、炔烃、环炔烃、四嗪、氧胺、羧酸盐或醛；

Y＝胺、马来酰亚胺、乙烯基砜、硫醇、叠氮化物、炔烃、环炔烃、四嗪、氧胺、羧酸盐或醛。

在一些实施例中，纳米火车可以进一步包括中性的尾部。

在一些实施例中，纳米火车可以进一步包括磁珠。

另一方面涉及用于单分子检测的系统，其包括：

本文所公开的纳米火车中的任何一种，

纳米孔，所述纳米火车易位通过所述纳米孔，其中所述纳米孔由生物的、有机的、无机的、天然的或合成的材料形成，并且所述纳米孔具有在2至1000nm、优选2至50nm范围内的孔径和厚度；其中任选地将第一对电极嵌入所述纳米孔内用于测量电流、电压和/或容量；

纳米孔设备，其具有顺式储器(reservoir)和反式储器，所述顺式储器和反式储器由其中嵌入所述纳米孔的膜分离；

偏置电压，所述偏置电压通过第二对电极施加在所述顺式储器和反式储器之间；

用于记录由所述纳米火车易位通过所述纳米孔引起的电流、电压或容量波动的设备；其中所述电流、电压或容量波动检测由亲和分子捕获的一个或多个靶标；和

用于数据分析的软件，其识别或表征所述一个或多个靶标。

在一些实施例中，一个或多个靶标选自多重蛋白质标记物、单核苷酸多态性(SNP)、DNA和RNA突变、基因组的结构变异、药物分子、抗体、抗原和聚糖。

在一些实施例中，该系统可以包括多个纳米火车，其中所述纳米孔设备包括多个纳米孔，优选纳米孔的阵列，其中优选纳米孔设备含有10至10

另一方面涉及一种用于单分子检测的方法，其包括：

a.提供本文所公开的系统；

b.将纳米火车与包含一个或多个靶标的样品混合，从而形成负载的纳米火车，所述负载的纳米火车具有经由多个亲和分子捕获的所述一个或多个靶标；

c.任选地将负载的纳米火车从样品中分离，优选地经由在分离步骤之后可以去除的磁珠分离；

d.将负载的纳米火车放置到纳米孔设备中，优选地放置在顺式储器中；

e.在顺式储器和反式储器之间施加偏置电压，以使负载的纳米火车易位通过纳米孔；和

f.记录由负载的纳米火车易位通过纳米孔引起的电流、电压或容量波动；其中所述电流、电压或容量波动检测由亲和分子捕获的一个或多个靶标。

在一些实施例中，该方法用于使用包括多个纳米孔(优选纳米孔的阵列)的纳米孔设备高通量检测多个靶标，其中优选纳米孔设备含有10至10

还提供了一种合成纳米火车的方法，其包括：

a.提供多个车厢和柔性的连接子，其中每个车厢是具有独特序列的单链DNA车厢，其中每个车厢具有连接到其5'-端和3'-端的正交官能团，其中每个官能团独立地选自胺、马来酰亚胺、硫醇、乙烯基砜、叠氮化物、炔烃、环炔烃、环辛烯或氧胺；

b.经由可裂解的连接子将头车厢连接到固体基底，形成纳米火车的第一端；

c.将第一柔性的连接子连接到所述头车厢；

d.将第一车厢连接到所述第一柔性的连接子；

e.将第N个柔性的连接子连接到第(N-1)个车厢，其中N是≥2的整数；

f.将第N个车厢连接到第N个柔性的连接子；

g.将第(N+1)个柔性的连接子连接到第N个车厢；

h.重复步骤(e)-(g)，直到所需数量的车厢通过柔性的连接子连接；

i.将中性的尾部连接到所述纳米火车的第二端；以及

j.在所述可裂解的连接子处从所述固体基底裂解所述纳米火车。

具体实施方式

在一些实施例中，本文提供了一种带负电荷的DNA分子，其用作用于基于纳米孔的蛋白质检测的载体。在双链DNA上所捕获的蛋白质分子可以由易位通过纳米孔来检测。

本公开提供了一种一维纳米阵列(称为纳米火车)，其用于使用纳米孔装置感测生物分子，其中纳米孔是生物的、合成的、固态的或其组合，并且纳米孔的大小为约2nm至1000nm，优选为2nm至50nm。图1显示了运载多重分子负载物的DNA纳米火车，该分子负载物由纳米孔感测。当纳米火车电泳易位通过纳米孔时，其每一个负载物都会阻止电解质流动，导致离子电流波动。离子电流的变化通过其幅度(ΔI)和持续时间(t

图2A示出了一种典型的DNA纳米火车，其包括火车头(单链DNA，101)和四个连续的DNA车厢(单链DNA，102、103、104、105)，它们通过柔性的连接子(106)相互连接，在其末端有带中性电荷的尾部(107)。这些DNA车厢可以通过它们的序列相互区分。例如，对于蛋白质的检测，纳米火车装备有与互补DNA(108、109、110、111)缀合的受体，并通过杂交连接到用单链DNA(113)官能化的磁珠(112)(图2B)。可以以与图3中制作205相同的方法制作113。113的序列与101互补。113可以是DNA或其类似物，例如LNA、环己烯基核酸(CeNA)。当所装备的纳米火车与样品溶液混合时，它捕获那些同源配体(114、115、116、117，图2C)。装载有负载物的纳米火车可以通过磁力将其固定在小瓶壁上而与溶液分离，然后通过使用核酸酶切割磁珠旁边的单链DNA片段而释放。因此，具有双链DNA头(118，图2D)的经装载的纳米火车已准备好用于进行如上所述的纳米孔分析。

在一些实施例中，聚乙二醇(PEG)可以用作连接DNA车厢以形成纳米火车的连接子。与λDNA载体

本文中所描述和要求保护的实施例具有许多属性和实施例，包括但不限于本公开中所阐述、描述或引用的那些。本文所描述和要求保护的实施例不限于或不受本公开中所标识的特征或实施例的限制，其仅用于说明目的而非限制目的。以下将以DNA纳米火车作为示例。

定义

下文对某些术语进行了限定。在整个申请中提供了附加的定义。

如本文所用，冠词“一(a和an)”指的是冠词的语法对象中的一个或超过一个(例如，至少一个)。当与术语“包括(comprising)”一起使用时，单词“一(a或an)”的使用可能意味着“一个”，但它也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或超过一个”的含义一致。

如本文所用，考虑到测量的性质和精密度，“约”和“近似”通常意味着所测量的量的可接受误差程度。示例性的误差程度在给定值范围的20％(％)以内，通常在10％以内，更通常在5％以内。术语“基本上”意味着超过50％，优选超过80％，最优选超过90％或95％。

如本文所用，术语“包括(comprising或comprises)”是指在给定实施例中存在的组合物、方法及其各自的组分，但可包含未指明元件。

如本文所用，术语“基本上由……组成(consisting essentially of)”是指给定实施例所需的那些元件。该术语允许附加元件的存在，该附加元件不会实质性地影响本公开的实施例的基本和新颖或功能特性。

术语“由……组成(consisting of)”是指如本文所述的组合物、方法及其各自的组分，其不包括在实施例的描述中未列举的任何元件。

如本文所用，术语“纳米火车”是指线性分子结构，其包括由键联分子连接的一系列识别实体。这些识别实体充当运载负载物(分析物)的火车车厢。火车车厢的部分骨架可以由DNA、RNA、肽核酸(PNA)、多肽、多糖、抗体、受体、超分子、和任何带电荷的或不带电荷的、天然的、经修饰的或合成的线性分子、或其组合制成。骨架部分的一部分或全部可以是识别实体，或者与识别实体(如探针、受体、抗体、分子镊子等)顶合(top)或缀合。具体地，如果车厢包括DNA，则称为DNA纳米火车。键联分子是纳米火车的必要部分，其设计为产生与火车车厢的负载物部分的信号不同的信号，通常具有不同的大小(直径)或其他特性，这些特性归因于不同的纳米孔信号。

下文将进一步详细描述本公开的各个方面。附加的定义在整个说明书中均有规定。

在一个实施例中，本文提供了合成图2A中所示的DNA纳米火车的途径。首先，按照图3中所描述的过程合成DNA火车头(101)的前体。N-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-4-羟基-4-甲基戊酰胺(201)的氨基基团首先与三苯基氯甲烷(trityl chloride，TrCl)反应，得到氨基保护的产物(202)。使用Bergstrom的方法

在一些实施例中，提供了用于制备纳米火车DNA组分的方法，该组分用于组装DNA纳米火车。图4A描绘了合成DNA车厢(如图2A中所描述的102、103、104和105)的途径，DNA车厢在其5'-端带有具有叠氮功能的PEG连接子，在其3'-端带有二硫化物(303)。详细地，在传统的自动DNA合成器中合成DNA车厢，其含有在其5'-端的烷基胺和在其3'-端的二硫化物官能团(301)。通过与叠氮基-dPEG

在一个实施例中，提供了一种用于在微珠上组装纳米火车的合成循环(图5)。合成从连接到微珠(205)的纳米火车头前体开始。首先用TCEP处理以将二硫化物还原为硫醇，然后与PEG连接子405反应(步骤i)，并用碘甲烷(CH

在一些实施例中，提供了将不同亲和分子装载到DNA车厢以检测靶向分析物的方法。首先，合成一组DNA分子，其序列与纳米火车中车厢的序列互补，以分别包含官能团，如胺、硫醇或其他官能团(图6)。该官能团位于互补DNA(601)的末端或在内部DNA碱基(602)上。这些官能团用于将亲和分子连接到DNA上。例如，图7描绘了将适体连接到DNA上的途径。首先，合成车厢的互补DNA以包含内部经氨基修饰的胸苷(701)。然后，DNA与3-(2-叠氮乙氧基)丙酸-2,3,5,6-四氟苯基酯(702)反应以得到叠氮官能化的DNA(703)。用胺官能化的适体与DBCO-C5-NHS-酯(402)反应以产生含有DBCO官能团的适体(704)。将DNA 703与适体704混合允许点击反应自发发生，得到DNA-适体缀合物(705)。通过用互补序列与DNA车厢杂交，将缀合物装载到DNA纳米火车。

在一些实施例中，不同的分析物被单独地或在两种或更多种分析物的组合中感测/检测，其中分析物包括但不限于DNA、RNA、蛋白质、抗体/抗原、糖类、任何生物分析物、有机分析物等。

在一些实施例中，构建多个纳米火车分子结构，并将其与含有多个纳米孔或纳米孔阵列的纳米孔芯片设备一起使用。在一些实施例中，纳米孔阵列含有10至10

在一些实施例中，如在WO201707562、WO2018209286和PCT/US20/042188(所有这些均通过引用并入本文)中所述的纳米孔芯片设备中设计和构建纳米孔芯片设备。纳米孔可以是任何形状，例如其中所描述的那些形状。可以使用离子电流阻断法或使用嵌入纳米孔中的电极(例如其中所述的电极)来测量纳米火车及其各自的靶标。

示例

在一个实施例中，可以制备包含两个DNA车厢的纳米火车。例如，DNA车厢-1具有5'-GAT CTG ACA GTA GGT ACG CAT CAG GAC ATC/3AmMO/-3'(SEQ ID NO.1)的序列，其在3'-端具有氨基连接子(3AmMO)(CAR-1胺-3')，以及车厢-2具有5'-/5AmMC6/GAT ACA GGCTGC ACC ATT AGC GAC GGG ATC-3'(SEQ ID NO.2)，其在5'-端具有氨基酸连接子(5AmMC6)(CAR-2胺-5')，如图8A-8B所示。CAR-1胺-3'与叠氮基-

在一些实施例中，上面所述的纳米火车带有互补的DNA部分。示例包括两个DNA实体，分别与CAR-1和CAR-2互补的5'-GAT GTC CTG ATG CGT ACC TAC TGT CAG ATC-3'(CAR-1C)(SEQ ID NO.3)和5'-GAT CCC GTCGCT AAT GGT GCA GCC TGT ATC-3'(CAR-2C)(SEQ IDNO.4)。凝胶电泳分析表明，CAR-1PEG

附加的实施例：

用于识别和感测单个和多重分子的系统：

a.纳米孔，其包括生物的、有机的或无机的材料，并且具有在2至1000nm、优选2至50nm范围内的孔径和厚度；

b.纳米火车，其含有多个车厢(n>1)，每个车厢都连接有用于捕获其各自的靶标的亲和分子，其中车厢包括带电荷的头部和中性的尾部，并穿插有柔性的连接子，并且其中亲和分子包括核酸、XNA、适体、配体、抗体、抗体片段、抗原、纳米抗体、亲和体、蛋白质、或碳水化合物，但不限于它们，其中所述亲和分子含有胺、硫醇、叠氮化物、炔烃、环炔烃、或四嗪，但不局限于它们；

c.有两个储器的纳米孔设备，所述储器由具有嵌入的纳米孔的膜分离；

d.通过成对电极施加在所述两个储器之间的偏置电压；

e.记录由所述纳米火车易位所述纳米孔引起的电流波动的设备；

f.用于数据分析的软件，其识别或表征靶标生物分子；

g.包括核酸的DNA车厢，所述核酸包括长度在6至1000个碱基范围内的DNA、长度在6至1000个碱基范围内的RNA，所述核酸可以与其自身或其互补的核酸形成双链体、三链体、四链体，其中核酸及其互补核酸在内部或在末端含有可以将亲和分子连接到车厢的官能团，包括胺、硫醇、叠氮化物、炔烃、环炔烃、或四嗪，但不限于它们，并且其中核酸及其互补物包括天然核苷、非天然核苷、或它们的组合；

h.具有异源核酸(XNA)的DNA车厢，所述异源核酸(XNA)包括肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、环己烯基核酸(CeNA)，但不限于它们，所述XNA可以与其自身或其互补的XNA形成双链体、三链体、四链体，其中所述XNA和互补的XNA在内部或在末端含有可以将亲和分子连接到车厢的官能团，包括胺、硫醇、叠氮化物、炔烃、环炔烃、或四嗪，但不限于它们，并且其中所述XNA和互补的XNA包括天然核苷、非天然核苷、或它们的组合；

i.包括携带至少一种官能团的蛋白质分子的车厢，所述官能团与天然氨基酸中存在的那些官能团正交，其包括氧胺、肼、醛、叠氮化物、炔烃、环炔烃、烯烃、或四嗪，但不限于它们；

j.上述部分b的车厢包括携带至少一种官能团的蛋白质分子，所述官能团与天然氨基酸中存在的那些官能团正交，其包括氧胺、肼、醛、叠氮化物、炔烃、环炔烃、烯烃、或四嗪，但不限于它们；

k.上述部分b的车厢包括带电荷的多糖，所述带电荷的多糖携带官能团，所述官能团包括硫醇、叠氮化物、炔烃、环炔烃、四嗪、或氧胺，但不限于它们；

l.上述部分b的柔性的连接子包含多肽

其中n＝2至200；w＝1至10；z＝0至10

X＝O、NH或ONH；

R＝H、胺、硫醇、叠氮化物、炔烃、环炔烃、四嗪、羧酸盐、羟基、烷基、烯烃、胍或聚糖、硒，但不限于它们；

R'＝叠氮化物、炔烃、环炔烃、四嗪或醛，但不限于它们；

R”＝H、叠氮化物、炔烃、环炔烃、环辛烯、四嗪或醛，但不限于它们；

m.上述部分b的柔性的连接子，包括聚乙二醇，该柔性连接子具有如下所述的结构：

其中n＝2至500；

X＝胺、马来酰亚胺、乙烯基砜、环辛烯、硫醇、叠氮化物、炔烃、环炔烃、四嗪、氧胺、羧酸盐或醛，但不限于它们；

X＝胺、马来酰亚胺、乙烯基砜、硫醇、叠氮化物、炔烃、环炔烃、四嗪、氧胺、羧酸盐或醛，但不限于它们；

n.上述部分b的柔性的连接子包括上述部分m中的多肽和上述部分l中的聚乙二醇的组合。

在固体基底上合成纳米火车的方法：

a.合成纳米火车的循环方法。

b.在纳米火车头的一端处的可裂解的连接子，通过其将纳米火车的第一组分连接到固体基底。

c.连接到车厢两端的正交官能团，其中所述官能团是胺、马来酰亚胺、硫醇、乙烯基砜、叠氮化物、炔烃、环炔烃、环辛烯、氧胺，但不限于它们。

d.重复将柔性的连接子和车厢组分依次掺入到纳米火车头的合成循环。

e.将中性的尾部掺入到纳米火车的末端。

f.从固体基底上裂解纳米火车。

其中，所述固体基底包括微珠、纳米珠、平面基底(flat substrate)，但不限于它们；并且其中所述固体基底包括无机材料、金属、金属氧化物、聚合物材料、有机材料，但不限于它们。

本文提及的所有出版物、专利和其他文件均通过引用整体并入本文。除非另有定义，否则本文中所使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的那些术语相同的含义。虽然本公开已经通过各种实施例的描述来说明，并且虽然这些实施例已经被相当详细地描述，但是申请人的意图不是限定或以任何方式限制本申请的范围。对于本领域技术人员而言，其他的优点和修改将是容易地发生。因此，本公开在其更广泛的方面不限于所示和描述的具体细节、代表性设备、装置和方法以及说明性示例。因此，在不偏离申请人的总的发明构思的精神的情况下，可以偏离这些细节。

引文：

1.Jet,T.；Gines,G.；Rondelez,Y.；Taly,V.,Advances in multiplexedtechniques for the detection and quantification of microRNAs.Chemical SocietyReviews 2021,50,4141-4161.

2.Serna,G.；Ruiz-Pace,F.；Cecchi,F.；Fasani,R.；Jimenez,J.；Thyparambil,S.；Landolfi,S.；Elez,E.；Vivancos,A.；Hembrough,T.；Tabernero,J.；Dienstmann,R.；Nuciforo,P.,Targeted multiplex proteomics for molecular prescreening andbiomarker discovery in metastatic colorectal cancer.Scientific reports 2019,9,13568.

3.Favresse,J.；Brauner,J.；Bodart,N.；Vigneron,A.；Roisin,S.；Melchionda,S.；Douxfils,J.；Ocmant,A.,An original multiplex method to assess fivedifferent SARS-CoV-2antibodies.Clin Chem Lab Med 2020,59,971-978.

4.Caceres-Martell,Y.；Fernandez-Soto,D.；Campos-Silva,C.；Garcia-Cuesta,E.M.；Casasnovas,J.M.；Navas-Herrera,D.；Beneitez-Martinez,A.；Martinez-Fleta,P.；Alfranca,A.；Sanchez-Madrid,F.；Escudero-Lopez,G.；Vilches,C.；Jara-Acevedo,R.；Reyburn,H.T.；Rodriguez-Frade,J.M.；Vales-Gomez,M.,Bead-assisted SARS-CoV-2multi-antigen serological test allows effective identification ofpatients.medRxiv 2021,2021.04.08.21254348.

5.Deshpande,A.；White,P.S.,DNA Microarrays and Genetic Testing.InMolecular Diagnostics,2017；pp 327-337.

6.Heiss,K.；Heidepriem,J.；Fischer,N.；Weber,L.K.；Dahlke,C.；Jaenisch,T.；Loeffler,F.F.,Rapid Response to Pandemic Threats:Immunogenic EpitopeDetection of Pandemic Pathogens for Diagnostics and Vaccine Development UsingPeptide Microarrays.Journal of Proteome Research 2020,19,4339-4354.

7.Syu,G.D.；Dunn,J.；Zhu,H.,Developments and Applications of FunctionalProtein Microarrays.Mol Cell Proteomics 2020,19,916-927.

8.Brittain,W.J.；Brandsetter,T.；Prucker,O.；Rühe,J.,The Surface Scienceof Microarray Generation–A Critical Inventory.ACS applied materials&interfaces 2019,11,39397-39409.

9.Parsa,S.F.；Vafajoo,A.；Rostami,A.；Salarian,R.；Rabiee,M.；Rabiee,N.；Rabiee,G.；Tahriri,M.；Yadegari,A.；Vashaee,D.；Tayebi,L.；Hamblin,M.R.,Earlydiagnosis of disease using microbead array technology:A review.Anal.Chim.Acta2018,1032,1-17.

10.Qu,X.；Bian,F.；Guo,Q.；Ge,Q.；Sun,Q.；Huang,X.,Ligation-Rolling CircleAmplification on Quantum Dot-Encoded Microbeads for Detection of Multiplex G-Quadruplex-Forming Sequences.Analytical Chemistry 2018,90,12051-12058.

11.Qu,X.；Jin,H.；Liu,Y.；Sun,Q.,Strand Displacement AmplificationReaction on Quantum Dot-Encoded Silica Bead for Visual Detection of MultiplexMicroRNAs.Analytical Chemistry 2018,90(5),3482-3489.

12.Kotagiri,N.；Li,Z.；Xu,X.；Mondal,S.；Nehorai,A.；Achilefu,S.,Antibodyquantum dot conjugates developed via copper-free click chemistry for rapidanalysis of biological samples using a microfluidic microsphere arraysystem.Bioconjug Chem 2014,25,1272-1281.

13.Ke,Y.；Lindsay,S.；Chang,Y.；Liu,Y.；Yan,H.,Self-Assembled Water-Soluble Nucleic Acid Probe Tiles for Label-Free RNA HybridizationAssays.Science 2008,319,180-183.

14.Chaput,J.；Lindsay,S.；Yan,H.；Zhang,P.MODIFIED NUCLEIC ACIDNANOARRAYS AND USES THEREFOR.US 8,685,894 B2,2014.

15.Zhao,S.；Tian,R.；Wu,J.；Liu,S.；Wang,Y.；Wen,M.；Shang,Y.；Liu,Q.；Li,Y.；Guo,Y.；Wang,Z.；Wang,T.；Zhao,Y.；Zhao,H.；Cao,H.；Su,Y.；Sun,J.；Jiang,Q.；Ding,B.,ADNA origami-based aptamer nanoarray for potent and reversible anticoagulationin hemodialysis.Nature Communications 2021,12,358.

16.Dekker,C.,Solid-state nanopores.Nature Nanotechnology 2007,2,209-215.

17.Feng,Y.；Zhang,Y.；Ying,C.；Wang,D.；Du,C.,Nanopore-based fourth-generation DNA sequencing technology.Genomics Proteomics Bioinformatics 2015,13,4-16.

18.Shasha,C.；Henley,R.Y.；Stoloff,D.H.；Rynearson,K.D.；Hermann,T.；Wanunu,M.,Nanopore-based conformational analysis of a viral RNA drugtarget.ACS Nano 2014,8,6425-30.

19.Zahid,O.K.；Wang,F.；Ruzicka,J.A.；Taylor,E.W.；Hall,A.R.,Sequence-Specific Recognition of MicroRNAs and Other Short Nucleic Acids with Solid-State Nanopores.Nano Lett 2016,16,2033-2039.

20.Garalde,D.R.；Snell,E.A.；Jachimowicz,D.；Sipos,B.；Lloyd,J.H.；Bruce,M.；Pantic,N.；Admassu,T.；James,P.；Warland,A.；Jordan,M.；Ciccone,J.；Serra,S.；Keenan,J.；Martin,S.；McNeill,L.；Wallace,E.J.；Jayasinghe,L.；Wright,C.；Blasco,J.；Young,S.；Brocklebank,D.；Juul,S.；Clarke,J.；Heron,A.J.；Turner,D.J.,Highlyparallel direct RNA sequencing on an array of nanopores.Nature methods 2018,15,201-206.

21.Dong,Z.；Kennedy,E.；Hokmabadi,M.；Timp,G.,Discriminating ResidueSubstitutions in a Single Protein Molecule Using a Sub-nanopore.ACS Nano2017,11,5440-5452.

22.Waduge,P.；Hu,R.；Bandarkar,P.；Yamazaki,H.；Cressiot,B.；Zhao,Q.；Whitford,P.C.；Wanunu,M.,Nanopore-Based Measurements of Protein Size,Fluctuations,and Conformational Changes.ACS Nano 2017,11,5706-5716.

23.Fennouri,A.；Przybylski,C.；Pastoriza-Gallego,M.；Bacri,L.；Auvray,L.；Daniel,R.,Single Molecule Detection of Glycosaminoglycan Hyaluronic AcidOligosaccharides and Depolymerization Enzyme Activity Using a ProteinNanopore.ACS nano 2012,6,9672–9678.

24.Rivas,F.；Zahid,O.K.；Reesink,H.L.；Peal,B.T.；Nixon,A.J.；DeAngelis,P.L.；Skardal,A.；Rahbar,E.；Hall,A.R.,Label-free analysis of physiologicalhyaluronan size distribution with a solid-state nanopore sensor.NatureCommunications 2018,9,1037.

25.Karawdeniya,B.I.；Bandara,Y.M.N.D.Y.；Nichols,J.W.；Chevalier,R.B.；Dwyer,J.R.,Surveying silicon nitride nanopores for glycomics and heparinquality assurance.Nature Communications 2018,9,3278.

26.Im,J.；Lindsay,S.；Wang,X.；Zhang,P.,Single Molecule Identificationand Quantification of Glycosaminoglycans Using Solid-State Nanopores.ACS Nano2019,13,6308-6318.

27.Bell,N.A.W.；Keyser,U.F.,Specific Protein Detection Using DesignedDNA Carriers and Nanopores.Journal of the American Chemical Society 2015,137,2035-2041.

28.Sze,J.Y.Y.；Ivanov,A.P.；Cass,A.E.G.；Edel,J.B.,Single moleculemultiplexed nanopore protein screening in human serum using aptamer modifiedDNA carriers.Nature Communications 2017,8,1552.

29.Morin,T.J.Multiplexed Biomarker Quantitation by Nanopore Analysisof Biomaker-Polymer Complexes 2014,WO 2014/210219.

30.Yao,F.；Peng,X.；Su,Z.；Tian,L.；Guo,Y.；Kang,X.-f.,Crowding-InducedDNA Translocation through a Protein Nanopore.Analytical Chemistry 2020,92,3827-3833.

31.Fang,S.；Bergstrom,D.E.,Fluoride-cleavable biotinylationphosphoramidite for 5'-end-labeling and affinity purification of syntheticoligonucleotides.Nucleic acids research 2003,31,708-715.