微生物的预处理方法、核酸提取方法、试剂盒及装置

技术领域

本发明属于核酸检测技术领域，涉及微生物的预处理方法、核酸提取方法、试剂盒及装置。

背景技术

肺结核(PTB)是由结核分枝杆菌复合体(MTBC)引起的慢性传染病，是全球主要公共卫生问题之一。目前用于结核病患者发现的方法包括传统诊断方法和快速诊断方法两大类，这两种方法大多数基于检测结核病可疑者的痰标本。MTBC生长缓慢，其意味着这种生物体和其他临床上重要的分枝杆菌的分离、鉴定和药敏试验非常困难并且可能需要数周或数月。对于部分没有痰标本的结核病可疑者，可通过在舌背用拭子采集标本进行检测，是大规模患者发现的一种补充手段。目前批量或精准的标本检测可采用分子检测技术，这依赖于对标本中核酸的采集。有研究通过采用Xpert MTB/RIF Ultra检测舌拭子，结果显示其灵敏度低于痰标本，因Xpert MTB/RIF Ultra目前的标本处理流程是基于检测痰标本的方法，如果用来处理舌拭子标本，后期还需要进一步的优化。舌拭子作为一个新的用于结核分枝杆菌检测样本类型，其采集方式和处理方法尚无统一标准，标准有效的采集方法和样本处理方法是结核病能准确检测的重要前提。

包括结核分枝杆菌复合群在内的多种微生物容易导致生物体感染，在分子生物学诊断工具的帮助下能够更好地判断微生物的类型或浓度，无论何种标本的采集方式，诊断结果的准确性都依赖于微生物的核酸提取。包括结核分枝杆菌复合群在内的多种致病微生物，较一般细菌坚固，核酸提取更困难。例如结核分枝杆菌复合群的蜡状细胞壁中含有霉菌酸，使其难以破坏并且大大减少了大多数化学或酶提取过程的核酸提取效率，强壮的细菌细胞壁阻碍了细胞裂解和核酸的有效提取两者。目前市场缺乏从处于适合PCR和其他复杂的分子分析(例如微阵列、高通量测序、基因芯片等)的形式的大量样本(例如痰标本、咽拭子、舌拭子等)中提取/分离核酸的有效方法。目前对于具有顽强细胞壁的微生物中核酸的提取依赖成分复杂的裂解液和/或蛋白酶K，单次提取成本高，人工操作多，也容易变质影响提取效果，例如CN112063617A公开了一种快速提取痰液中结核杆菌核酸的试剂盒，包括裂解液，磁珠悬液，清洗液和洗脱液，裂解液包括3～5mol/L氯化钾、3～5mol/L盐酸胍、1％乙基黄原酸钾和0.2mol/L磷酸钾缓冲液；CN110684764B公开了一种用于核酸提取的裂解液、核酸提取试剂盒及核酸提取方法，核酸提取裂解液包括0.5～2M钠盐、2～5M胍盐、1～5mM金属离子络合剂、0.25～1％非离子表面活性剂和1～3％PEG。也有分别采用高温短时热解处理或机械破壁从微生物中提取核酸的方法，例如CN102807975B公开了一种从生物样本中快速提取核酸的方法，取生物样本，置于chelex-100的水溶液或chelex-100的DEPC水溶液中，在80～100℃加热1～50分钟；CN105385682B提供了一种快速提取人粪便细菌DNA的简易方法，依次包括以下步骤：人粪便样品的热-冷破裂细胞；AMPure XP磁珠液抓取DNA；利用磁珠和磁力分离架的磁力吸附去除杂质以及纯化DNA。但这类技术方案用于具有顽强细胞壁的微生物的核酸提取效率低，提取效果不佳。

发明内容

本发明的目的在于解决对于具有顽强细胞壁的微生物的核酸提取需要裂解液和蛋白酶K等进行辅助裂解导致提取效率不佳的技术问题。

基于上述目的，本发明提供了一种微生物的预处理方法、核酸提取方法、试剂盒及装置来解决本领域内的这种需要。

本申请中所使用的术语“待测样本”或“样本”将被理解为意指可能含有感兴趣的物质的任何样本，其任选地是核酸、蛋白质或其它感兴趣的生物分子。术语“样本”可涵盖溶液(如水性溶液)、细胞、组织、活组织检查、粉末、或其一个或更多的群体。该样本可以是生物样本，如唾液、痰、颊拭子样本、血清、血浆、血液、血沉棕黄层、咽、鼻腔/鼻咽或窦拭样或分泌物、咽拭样或刮屑、尿、黏液、粪便、直肠拭样、病灶拭样、食糜、呕吐物、胃液、胰液、胃肠液、精液/精子、尿道拭样和分泌物、脑脊髓液、乳产品或月经、蛋黄、羊水、房水、玻璃状液、宫颈分泌物或拭样、阴道液/分泌物/拭样或刮屑、骨髓样本和抽出物、胸膜液体和胸腔积液、汗液、脓、泪、淋巴液、支气管或肺灌洗液或抽出物、腹膜积液、细胞培养物和细胞悬液、结缔组织、上皮细胞、上皮拭子和涂片、粘膜、肌肉组织、胎盘组织、活组织检查、渗出液、器官组织、神经组织、毛发、皮肤、指甲、植物、植物提取物、藻类、土壤样本、污水、废水、食品、肉类加工设备拭样等。样本也可以是稳定化的或保藏的样本，其中包含原始核酸的样本已经与存储溶液混合。或以其他方式被存储溶液处理，例如在试剂盒中发现的存储溶液。

本申请中所使用的术语“微生物”将被理解为意指任何微观生物体和孢子，包括所有的原核生物，即真细菌和古细菌，以及各种形式的真核生物，包括原生动物、真菌(如酵母)、藻类和动物(如轮虫和真涡虫)。

一方面，本发明涉及一种微生物的预处理方法，其包括：在中性或弱碱性条件下对待测样本进行高温短时热解处理，然后进行机械破壁；

所述中性或弱碱性条件为pH值7～9；

所述高温短时热解处理的温度为90～100℃，所述高温短时热解处理的时间为10～30min。

本发明的方法和产品，能够从抵抗一般标准核酸提取技术的微生物和孢子中释放核酸，例如，分枝杆菌属的一个或多个物种，结核分枝杆菌复合体的一个或多个物种、结核分枝杆菌的MDR菌株、梭菌属的一个或多个物种、芽孢杆菌的一个或多个物种、以及具有顽强的细胞壁的其他微生物。

本发明的方法和产品，在人类和动物的医学诊断和研究中是有用的(例如，研究微生物进化、毒性、耐药性、和流行病学的群体基因组学)。另外，许多市场/行业正在寻找有效的方法来破开坚韧的小虫和孢子，包括食品安全(食品/肉类加工厂)、土壤和水样采集(环境测试)、生物安全或生物防御(炭疽孢子和其他生物武器)、动物饲料测试、农业/植物科学/工业、酒精生产等。

进一步地，本发明提供的微生物的预处理方法中，所述中性或弱碱性条件由TE缓冲液提供，所述TE缓冲液包括0.5～2M Tris和0.05～0.2M EDTA。本申请请求保护的TE缓冲液由Tris和螯合剂组成，目的是稳定预处理时的pH，本领域技术人员容易到的是采用其他pH缓冲剂也能达到相近的效果，例如磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、巴比妥钠、柠檬酸、柠檬酸钠中的一种或多种。本领域技术人员也可以将EDTA替换为其他的螯合剂，例如乙二醇四乙酸(EGTA)、(2-羟乙基)乙二胺三乙酸(HEDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺三乙酸(EDTA)、环己烷二胺四乙酸(CDTA)，N,N-双(羧基甲基)甘氨酸、无水柠檬酸、柠檬酸钠、柠檬酸钙、柠檬酸铵、二柠檬酸铵、柠檬酸、柠檬酸二铵、柠檬酸铁铵、柠檬酸锂。

进一步地，本发明提供的微生物的预处理方法中，所述TE缓冲液还包括pH调节剂，所述pH调节剂为HCl或NaOH。TE缓冲液中使用pH调节剂的目的是将TE缓冲液的pH值调整至7～9，采用其他pH调节剂也能达到相近的效果，优选地，采用HCl或NaOH进行pH调整。

进一步地，本发明提供的微生物的预处理方法中，所述机械破壁使用锆珠或玻璃珠；优选地，所述机械破壁使用玻璃珠。

本发明人已意外地发现，适量的pH条件、温度和机械破壁能显著地提高核酸从细菌或真菌中的释放。机械破壁是指采用机械的方式使得细胞分裂，例如珠粒打浆、破碎和研磨、湿磨、超声波、液压剪、冻结压力。考虑到便捷使用和核酸提取效果，优选地，机械破壁使用锆珠或玻璃珠进行珠粒破壁。

优选地，本发明提供的微生物的预处理方法中，所述锆珠或玻璃珠的粒径为0.05～1mm。

优选地，本发明提供的微生物的预处理方法中，所述机械破壁的条件为2～7M/s，匀浆3～10次，0.5～1min间隔。

进一步地，本发明提供的微生物的预处理方法中，所述待测样本包括舌拭子。舌拭子是使用拭子从舌头上采集得到的样本。本发明提供的微生物的预处理方法适用于舌拭子，但不限于舌拭子。舌拭子样本的提取难点是提取效率较低、提取时间较长，难以保证检测准确度的前提下、简化核酸提取或纯化过程，缩短检测周期。

另一方面，本发明涉及一种核酸提取方法，其采用上述的微生物的预处理方法得到的预处理后的样本进行核酸提取，条件是排除使用裂解液和/或蛋白酶K。本发明由于预处理中的裂解效果得到强化，因此不需要裂解液和蛋白酶K等进行辅助裂解，降低成本、减少人工操作。本领域内技术人员在进行核酸提取时，一般使用的裂解液包括裂解液和/或蛋白酶K，也包括Tris和螯合剂，应当可以理解的是，Tris和螯合剂在裂解液中不发挥主要裂解作用，不应当视为裂解液，而是应当视为缓冲液。

进一步地，本发明提供的核酸提取方法中，还包括：将预处理后的样本采用XP磁珠对核酸进行吸附富集后，采用乙醇漂洗至少2次，获得纯化后的核酸。本发明还将XP磁珠代替结合液和磁珠的组合，减少去蛋白等漂洗步骤，改为乙醇漂洗至少2次，可有效减少抑制物的残留，提取效果不变且更节省耗时。

另一方面，本发明涉及一种核酸提取试剂盒，其包括TE缓冲液、研磨珠、磁珠和乙醇；

所述TE缓冲液包括Tris和EDTA，所述TE缓冲液的pH为7～9；

所述研磨珠为粒径0.1～0.5mm的锆珠和/或粒径0.1～0.5mm的玻璃珠；

不包括裂解液和/或蛋白酶K。

另一方面，本发明涉及一种核酸提取的装置，其包括：

加热结构，所述加热结构用于将含待测样本的缓冲液进行加热，所述缓冲液的pH为7～9；

机械破壁结构，所述机械破壁结构用于将所述加热结构获得的样本与研磨珠进行机械破壁。

本发明与现有技术相比具有以下有益效果或者优点：

(1)本发明提供了微生物预处理方法采用在中性或弱碱性条件下对待测样本进行高温短时热解处理，然后进行机械破壁，得到用于核酸提取纯化的样本。该预处理方法需要时间短，裂解效果好，可提高具有顽强细胞壁的微生物的核酸提取效率。

(2)本发明提供的微生物预处理方法适用于舌拭子样本，可提高舌拭子样本的结核分枝杆菌的核酸提取效率。本发明提供的核酸提取方法无需结合液，即可完成核酸的提取，提高了核酸提取效率，降低了核酸提取成本。本发明由于预处理中的裂解效果得到强化，因此不需要裂解液和蛋白酶K等进行辅助裂解，降低成本、减少人工操作。本申请发明人已意外地发现，适量的pH条件、温度和机械破壁能显著地提高核酸从细菌或真菌中的释放，特别适用于具有顽强细胞壁的微生物的核酸提取。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例。

图1为样本1的荧光曲线图。

具体实施方式

下面，结合实施例对本发明的技术方案进行说明，但是，本发明并不限于下述的实施例。

为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。

下述各实施例中所述实验方法和检测方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可在市场上购买得到。

实施例1

本实施例提供了结核阳性患者舌拭子的采集、提取及验证。

试验使用的玻璃珠购自Research products international(RPI)，锆珠购自天根生化科技(北京)有限公司。

样本1～8的试验：

样本采集：采集8例疑似结核病患者样本，并收集患者的临床诊断结果，样本具体采集方式如下：患者采集样本前4个小时禁止进食。用一次性拭子在患者舌背3/4处刮取15s，将拭子置于500μL样本保存液中，所述样本保存液为TE缓冲液(0.5M Tris和0.05MEDTA，采用HCl或NaOH调整pH为7.0)。

样本预处理：将样本采集管置于90℃孵育10min。待样本冷却后，吸取400μL样本溶液置于含150mg0.05mm玻璃珠的研磨管中使用组织匀浆仪进行机械打断，打断条件如下：2M/s，匀浆3次，0.5min间隔。打断完成后短暂离心，吸出200μL液体至新离心管中。

样本提取：往步骤2离心管中加入200μL AMPure XP磁珠，充分涡旋混匀后室温孵育5min。将离心管置于磁力架上静置3min，待溶液澄清，弃上清。用800μL 80％乙醇清洗磁珠两次后，加入40μL去离子水进行洗脱，室温孵育5min后，将离心管置于磁力架上，待溶液澄清，取35μL上清即为样本所提取核酸溶液。

样本9～16的试验：

样本采集：采集8例疑似结核病患者样本，并收集患者的临床诊断结果，样本具体采集方式如下：患者采集样本前4个小时禁止进食。用一次性拭子在患者舌背3/4处刮取15s，将拭子置于500μL样本保存液中，所述样本保存液为TE缓冲液(1.0M Tris和0.1MEDTA，采用HCl或NaOH调整pH为8.0)。

样本预处理：将样本采集管置于95℃孵育20min。待样本冷却后，吸取400μL样本溶液置于含150mg0.5mm玻璃珠的研磨管中使用组织匀浆仪进行机械打断，打断条件如下：4M/s，匀浆5次，0.75min(45s)间隔。打断完成后短暂离心，吸出200μL液体至新离心管中。

样本提取：往步骤2离心管中加入200μL AMPure XP磁珠，充分涡旋混匀后室温孵育5min。将离心管置于磁力架上静置3min，待溶液澄清，弃上清。用800μL 80％乙醇清洗磁珠两次后，加入40μL去离子水进行洗脱，室温孵育5min后，将离心管置于磁力架上，待溶液澄清，取35μL上清即为样本所提取核酸溶液。

样本17～24的试验：

样本采集：采集8例疑似结核病患者样本，并收集患者的临床诊断结果，样本具体采集方式如下：患者采集样本前4个小时禁止进食。用一次性拭子在患者舌背3/4处刮取15s，将拭子置于500μL样本保存液中，所述样本保存液为TE缓冲液(2.0M Tris和0.2MEDTA，采用HCl或NaOH调整pH为9.0)。

样本预处理：将样本采集管置于100℃孵育30min。待样本冷却后，吸取400μL样本溶液置于含150mg 1mm锆珠的研磨管中使用组织匀浆仪进行机械打断，打断条件如下：7M/s，匀浆10次，1min(45s)间隔。打断完成后短暂离心，吸出200μL液体至新离心管中。

样本提取：往步骤2离心管中加入200μL AMPure XP磁珠，充分涡旋混匀后室温孵育5min。将离心管置于磁力架上静置3min，待溶液澄清，弃上清。用800μL 80％乙醇清洗磁珠两次后，加入40μL去离子水进行洗脱，室温孵育5min后，将离心管置于磁力架上，待溶液澄清，取35μL上清即为样本所提取核酸溶液。

qPCR检测：为评估所提取核酸溶液中MTBC的检出情况，使用qPCR体系对核酸溶液进行检测。反应配方如下：

按照上述配方配制PCR反应体系，其中特异上下游引物和探针的靶标区域是结核分枝杆菌复合群保守区域IS6110，引物探针序列如下：

特异探针的5’段连接FAM，5’段连接BHQ。

体系配制好后将PCR管置于SLAN-96S荧光PCR仪上进行实时荧光PCR，反应程序为：37℃2min；95℃5min；95℃10sec，60℃30sec(收集荧光)(45cycles)。记录各样本FAM信号Ct值，以Ct值≤40判定为阳性。

测结果分析：

根据各样本的Ct值判定样本的阴阳性，并与临床诊断结果进行比较，具体结果如下：

由上述结果可得，24例舌拭子样本的检测结果与临床诊断结果的一致性为95.8％，表明通过本发明阐述的采样方法、预处理方法和核酸提取纯化方法可有效采集并提取舌拭子样本中的MTBC核酸。

实施例2

本实施例提供了一种微生物样本预处理方法，结合热裂解和机械破壁两种方法，使得样本中MTBC能够充分释放和破壁，从而提升结核分枝杆菌复合群的提取得率。

样本准备：按照实施例1中的样本采集方法采集健康人群的阴性舌拭子，然后在阴性舌拭子中添加一定量的结核分枝杆菌(H37Ra)菌液，使菌液的终浓度为500CFU/mL、50CFU/mL和10CFU/mL，分别得到菌液浓度为500CFU/mL、50CFU/mL和10CFU/mL的舌拭子模拟样本。

将配制好的3种浓度的样本分别按照仅热裂解、仅机械破壁、热裂解加机械破壁三种方法进行预处理。具体方法如下：

a.仅热裂解：取400μL样本溶液(TE缓冲液，1.0M Tris和0.1MEDTA，采用HCl或NaOH调整pH为8.0)置于95℃孵育15min，待样本冷却后，吸出200μL样本溶液至新离心管中。

b.仅机械破壁：吸取400μL样本溶液(TE缓冲液，1.0M Tris和0.1M EDTA，采用HCl或NaOH调整pH为8.0)置于含0.5mm玻璃珠的研磨管中使用组织匀浆仪进行机械打断，打断条件如下：2M/s，匀浆10次，1min间隔。打断完成后短暂离心，吸出200μL液体至新离心管中。

c.热裂解加机械破壁：吸取400μL样本溶液(TE缓冲液，1.0M Tris和0.1M EDTA，采用HCl或NaOH调整pH为8.0)置于95℃孵育15min。待样本冷却后，吸取全部溶液置于含150mg0.5mm玻璃珠的研磨管中使用组织匀浆仪进行机械打断，打断条件如下：2M/s，匀浆10次，1min间隔。打断完成后短暂离心，吸出200μL液体至新离心管中。

参考实施例1进行核酸提取和qPCR验证。

比较三种预处理方法所提取核酸的Ct值，具体结果如下：

由上述结果可以看出热裂解结合机械破壁能够使舌拭子样本中的病原体核酸得到充分破壁和释放，提取所得病原体载量最高，而重复热裂解步骤和机械破壁步骤无法得到本申请的提取效果。

实施例3

本实施例提供了不同试验条件下，对MTBC核酸提取的影响。

样本准备：按照实施例1中的样本采集方法采集健康人群的阴性舌拭子，然后在阴性舌拭子中添加一定量的结核分枝杆菌(H37Ra)菌液，使菌液的终浓度为500CFU/mL、50CFU/mL和10CFU/mL，分别得到菌液浓度为500CFU/mL、50CFU/mL和10CFU/mL的舌拭子模拟样本。

试验组1：吸取400μL样本溶液(阴性拭子保存液为去离子水)95℃孵育15min，待样本冷却后，吸出200μL样本溶液至新离心管中。待样本冷却后，吸取全部溶液置于含0.5mm玻璃珠的研磨管中使用组织匀浆仪进行机械打断，打断条件如下：2M/s，匀浆10次，1min间隔。打断完成后短暂离心，吸出200μL液体至新离心管中。

试验组2：吸取400μL样本溶液(阴性拭子保存液为TE缓冲液，1.0M Tris和0.1MEDTA，采用HCl或NaOH调整pH为6.0)置于95℃孵育15min。待样本冷却后，吸取全部溶液置于含0.5mm玻璃珠的研磨管中使用组织匀浆仪进行机械打断，打断条件如下：2M/s，匀浆10次，1min间隔。打断完成后短暂离心，吸出200μL液体至新离心管中。

试验组3：吸取400μL样本溶液(阴性拭子保存液为TE缓冲液，1.0M Tris和0.1MEDTA，采用HCl或NaOH调整pH为8.0)置于室温孵育15min。待样本冷却后，吸取全部溶液置于含0.5mm玻璃珠的研磨管中使用组织匀浆仪进行机械打断，打断条件如下：2M/s，匀浆10次，1min间隔。打断完成后短暂离心，吸出200μL液体至新离心管中。

实验组4：吸取400μL样本溶液(阴性拭子保存液为TE缓冲液，1.0M Tris和0.1MEDTA，采用HCl或NaOH调整pH为8.0)置于95℃孵育15min。待样本冷却后，吸取全部溶液置于含0.5mm玻璃珠的研磨管中使用组织匀浆仪进行机械打断，打断条件如下：2M/s，匀浆10次，1min间隔。打断完成后短暂离心，吸出200μL液体至新离心管中。

参考实施例1进行核酸提取和qPCR验证。

比较三种预处理方法所提取核酸的Ct值，具体结果如下：

由上述试验结果可知，不加入TE缓冲液，或在pH为酸性或弱酸性以及不做高温灭活处理，会影响病原体核酸的破壁和释放，影响检测的灵敏度。

实施例4

本实施例提供了一种简化版的核酸提取纯化流程，该流程与商品化的核酸提取试剂相比，时间短、成本低，且所提取的核酸干扰物质少，可用于qPCR等下游检测。

样本准备：按照实施例1中步骤1的样本采集方法采集健康人群的阴性舌拭子，然后在阴性舌拭子中添加一定量的结核分枝杆菌(H37Ra)菌液，使菌液的终浓度为500CFU/mL、50CFU/mL和10CFU/mL，分别得到菌液浓度为100CFU/mL、50CFU/mL和10CFU/mL的舌拭子模拟样本。

样本预处理：吸取400μL样本溶液置于95℃孵育15min。待样本冷却后，吸取全部溶液置于含0.5mm玻璃珠的研磨管中使用组织匀浆仪进行机械打断，打断条件如下：2M/s，匀浆10次，1min间隔。打断完成后短暂离心，吸出200μL液体至新离心管中。

分别将预处理后的模拟样本分别用商品化的提取试剂盒和简化版的提取流程进行提取。具体方法如下：

a.所述商品化试剂盒为Quick-DNAMiniprep Plus Kit(zymo，D4068)，具体操作步骤参考试剂盒说明书，洗脱体积为35μL。

b.简化版提取流程如下：往步骤2离心管中加入200μL AMPure XP磁珠，充分涡旋混匀后室温孵育5min。将离心管置于磁力架上静置3min，待溶液澄清，弃上清。用800μL80％乙醇清洗磁珠两次后，加入40μL去离子水进行洗脱，室温孵育5min后，将离心管置于磁力架上，待溶液澄清，取35μL上清即为样本所提取核酸溶液。

参考实施例1中的步骤4对所提取的核酸进行qPCR验证。

比较两种提取方法所提取核酸的Ct值，具体结果如下：

由上述结果可以得出，简化流程对微量病原体的提取得率不弱于商业化提取试剂盒。且操作快速简便、成本低，较常规商品化提取试剂盒具有一定的优势。

如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。