耐盐碱促生菌及其在盐碱环境下改良重金属污染土壤的应用

技术领域

本发明涉及的是一种环境工程领域的技术，具体是一种耐盐碱促生菌及其在盐碱环境下改良重金属污染土壤的应用。

背景技术

我国滩涂盐碱地面积约9000万亩，滩涂围垦是缓解土地资源紧张和增加耕地面积的重要方式。而人工围垦的滩涂区域，由于成陆时间短，地势低、地下水位高，土体表现为明显的滨海或近海盐渍化土壤特征，即盐分含量高、碱化不明显、有机质含量低等特征，严重制约了围垦滩涂土地、土壤资源的有效利用。同时，早期围垦多采用未经腐熟处理的生活污泥、城市固废等，将Cd、As、Pb等重金属带入土壤，造成土壤重金属污染风险。

发明内容

本发明针对现有菌株无法应用于具有重金属污染风险的盐碱地土壤改良的不足，提出一种耐盐碱促生菌及其在盐碱环境下改良重金属污染土壤的应用，该菌株能够耐受高浓度盐胁迫，快速降解秸秆等生物质废弃物转化为有机质，通过分泌胞外多糖缓解盐胁迫对植物的不利影响，并利用菌株自身的促生特性促进植物在盐碱地中的生长，实现土壤改良和植物生长的双重功效。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一种坚强芽孢杆菌(Cytobacillus sp.)L71，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。保藏日期为2023年3月23日，保藏编号为CGMCC No.26877。

所述的坚强芽孢杆菌L71，通过从滩涂重度盐渍化区域土壤中筛选培养得到，其16S rDNA如SEQ ID No.1所示。

本发明涉及一种基于上述坚强芽孢杆菌L71的应用，将其作用于滩涂盐碱地土壤以实现土壤修复，具体为：将坚强芽孢杆菌L71扩大培养得到固体制剂后施用于待修复土壤，在土壤中种植蔬菜植物，菌剂通过分泌胞外多糖吸附土壤中的盐分离子，缓解盐胁迫对植物的盐害作用，并降低土壤中重金属的迁移风险，促进植物生长，从而达到改良土壤和保障蔬菜安全的双重目的。

所述的扩大培养是指：将坚强芽孢杆菌L71菌株接种于含有碳源、氮源、无机盐和水的无菌发酵培养基中，在C/N比大于或等于5，初始pH为6.0～7.5、培养温度为20～37℃的环境下培养8～24小时。

所述的无菌发酵培养基的组分含量为：碳源2～20g/L，氮源0.1～10g/L，无机盐0.01～10g/L，其余为水，pH 6.0～7.5；其中碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、麸皮、甘油、玉米粉、糖蜜或其组合；氮源为豆饼粉、豆粕粉、棉籽饼粉、酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、尿素、(NH

所述的固体制剂中含有坚强芽孢杆菌L71菌株形成的芽孢2亿个以上/克以及有机物料。

所述的有机物料包括但不限于腐殖酸、粉煤灰、秸秆粉等。

所述的蔬菜植物包括：叶菜类、根茎类蔬菜、龙葵、苜蓿。

所述的施用包括：

1)针对滩涂盐碱地土壤，每亩土壤施用50～100kg微生物固体制剂，1～3天后直接种植叶菜类、根茎类蔬菜、苜蓿，之后每隔30天以25～40kg/亩用量将微生物固体制剂进行追施；

2)针对滩涂区盐碱地与Cd、As、Pb中至少一种重金属的复合污染土壤，每亩土壤施用50～100kg微生物固体制剂，1天后种植龙葵，30天后收割，再次施用25～40kg微生物固体制剂，2～3天后种植叶菜类、根茎类蔬菜、苜蓿，之后每隔30天施用15kg微生物固体制剂。

所述的滩涂盐碱地土壤是指：土壤pH为7.5～8.8，全盐量小于或等于10g/kg。

所述的重金属污染土壤是指：Cd、As、Pb污染土壤中的总Cd含量为小于或等于3.0mg/kg、总As含量为小于或等于100mg/kg、总Pb含量为小于或等于400mg/kg。

技术效果

本发明筛选获得的Cytobacillus sp.L71培养条件十分粗放，操作方便简单，能够有效修复盐碱地土壤，提高土壤有机质含量，降低土壤含盐量，并且该菌株可显著降低土壤中重金属的迁移风险、提高超积累植物对重金属的吸收，同时促进植物生长，有效实现重金属污染的盐碱地土壤修复。

附图说明

图1为本发明的Cytobacillus sp.L71的菌落形态示意图；

图2为本发明的Cytobacillus sp.L71菌株的扫描电镜示意图。

具体实施方式

实施例1

Cytobacillus sp.L71的分离和纯化

富集培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 100g/L，pH 7.0。

从上海市崇明滩涂重度盐渍化区域采集土壤样品，将采样点土壤5g加入富集培养基中，28℃、150r/min培养2天，以10％接种量接入新的富集培养基中，继续按照上述方法进行培养，如此反复驯化4次，以富集耐盐细菌。

将上述富集培养液至于80℃水浴10min，吸取上述1mL水浴后的富集培养液至9mL无菌生理盐水中，得到10

本实施例通过上述方法筛选得到的Cytobacillus sp.L71，在蛋白胨琼脂培养基上营养细胞为0.5～0.6×1.3～2.0μm大小的杆菌，37℃培养2～3天形成芽孢，芽孢为长圆形或圆柱状。在上述培养基中30℃培养8h菌体可以大量生长。菌落呈白色，边缘完整，不透明，不闪光。

所述的Cytobacillus sp.L71培养温度20～37℃，最适温度为32℃；在pH 5.8～7.5范围内生长；革兰氏染色检测呈阳性；接触酶实验、V-P实验、明胶液化检测均呈阳性，精氨酸脱羧酶实验、精氨酸双水解酶实验、苯丙氨酸脱氨酶实验、鸟氨酸脱羧酶实验、赖氨酸脱羧酶实验、甲基红实验、H

所述的Cytobacillus sp.L71经16S rDNA序列测得，其16S rDNA大部分序列1484bp，如SEQ ID No.1所示，将该序列与GenBank中的基因序列进行同源性比较，发现其与Cytobacillusfirmus NBRC 15306同源性达到98.98％，认定本实施例使用的是Cytobacillus sp.，具体为Cytobacillus sp.L71。

所述的Cytobacillus sp.L71的促生特性检测，具体包括：

i.固氮能力的鉴定

将Cytobacillus sp.L71接种于LB培养基，30℃、200r/min条件下振荡培养24h，吸取上述1mL培养液至9mL无菌生理盐水中，得到10

ii.产铁载体能力的鉴定

CAS固体检测平板：称取蔗糖2.0g/L，酸水解酪素3.0g/L，CaCl

MgSO

CAS染液：铬天青0.60g/L，FeCl

挑取Cytobacillus sp.L71菌株接种在CAS检测平板上，28℃培养48h，发现菌落周围出现黄色晕圈，表示Cytobacillus sp.L71具有产铁载体能力。

iii.产1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)脱氨酶能力的鉴定

将Cytobacillus sp.L71接入5mL液体无氮培养基中，30℃、200r/min振荡培养24h，吸取上述培养液0.1mL接种至5mL DF培养基并振荡培养24h，吸取上述培养液0.1mL接种至5mLADF培养基中振荡培养24-48h，将在ADF中生长的菌种重复转接、培养，并以ADF培养基作为阴性对照，结果显示Cytobacillus sp.L71能够以ACC为唯一氮源生长，即该菌株具备产ACC脱氨酶能力。

所述的Cytobacillus sp.L71的耐受重金属特性检测，具体包括：

LB培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L。

1)分别配制氯化镉、氯化铅、亚砷酸钠溶液，加入LB培养基中，分别制备成Cd

2)将Cytobacillus sp.L71在LB培养基、30℃、200r/min的摇床条件下培养12h，将种子液按2％(v/v)的种子量接种于含有不同浓度Cd

本实施例中涉及的培养基的组分具体如下：

LB培养基(每升)的组分含量为：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L。

阿须贝氏无氮培养基：甘露醇10g/L，MgSO

KH

DF培养基(每升)的组分含量为：组分一：H

ADF加富培养基(每升)的组分含量为：DF培养基不加(NH

实施例2

本实施例涉及将实施例1得到的Cytobacillus sp.L71制成固体制剂，具体包括：

将Cytobacillussp.L71在种子培养基、30℃、200r/min的摇床条件下培养12h，将种子液按2％(v/v)的种子量接种于预装有600L灭菌后的发酵培养基的1000L发酵罐中进行培养，培养条件：32℃，100r/min，通气量1.5L/min，发酵过程无需调节pH。发酵10h，产芽胞数达到100×10

本实施例中涉及的培养基的组分具体如下：

种子培养基(每升)的组分含量为：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L。

发酵培养基(每升)的组分含量为：糖蜜20g/L，豆饼粉10g/L，磷酸氢二钾1.0g/L，NaCl 50g/L，pH 7.0。

实施例3

本实施例涉及将实施例1得到的Cytobacillus sp.L71进行滩涂盐碱地土壤的修复，具体包括：

步骤①将Cytobacillussp.L71在种子培养基、30℃、200r/min的摇床条件下培养12h，将种子液按2％(v/v)的种子量接种于预装有300L灭菌后的发酵培养基的500L发酵罐中进行培养，培养条件：35℃，150r/min，通气量1.5L/min，发酵过程无需调节pH。发酵12h，产芽胞数达到110×10

步骤②将含有Cytobacillussp.L71的固体菌剂、秸秆粉均匀抛撒施于滩涂盐碱地土壤(pH 8.3，全盐量6.8g/kg)，用量为50kg/亩，浅耕使其与土壤混匀，正常灌溉，使土壤湿润，1天后种植生菜(Lactucasativa Linn.var.ramosa Hort.)。35d后收获生菜，收集土壤和植物样品进行检测。同时设置空白对照，即不施用秸秆粉或菌剂的处理。由表1可知，施用菌剂显著降低了土壤全盐量(去除率33.8％)，尤其是Na

表1菌剂对滩涂盐碱地土壤的修复效果

表2菌剂对生菜产量的影响

本实施例中涉及的培养基的组分具体如下：

种子培养基(每升)的组分含量为：葡萄糖5g/L，牛肉膏3g/L，蛋白胨5g/L，NaCl10g/L，pH 7.0。

产芽胞培养基(每升)的组分含量为：麸皮20g/L，硫酸铵10g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸锰0.1g/L，NaCl 20g/L，pH 7.0。

实施例4

本实施例涉及将实施例1得到的Cytobacillus sp.L71进行重金属污染的滩涂盐碱地土壤的修复，具体包括：

步骤①将Cytobacillussp.L71在种子培养基、30℃、200r/min的摇床条件下培养12h，将种子液按2％(v/v)的种子量接种于预装有30L灭菌后的发酵培养基的50L发酵罐中进行培养，培养条件：32℃，180r/min，通气量2.0L/min，发酵过程无需调节pH。发酵12h，产芽胞数达到110×10

步骤②将含有Cytobacillussp.L71的固体菌剂均匀抛洒于重金属污染的滩涂盐碱地土壤(pH 8.0，全盐量5.3g/kg，Cd 1.41mg/kg、Pb 188mg/kg、As 54.77mg/kg)表面，施用量80kg/亩，浅耕使其与土壤混匀，正常灌溉，使土壤湿润，1天后种植龙葵，行距50cm，株距40cm，30天后收割；再以40kg/亩施用菌剂，2天后种植花椰菜，行距45cm，株距40cm，之后每隔30天按照15kg/亩施用菌剂，成熟后收获；再以50kg/亩施用菌剂，1天后种植龙葵，行距50cm，株距40cm，60天后收割。设置对照组，即采用相同的方式种植龙葵和花椰菜，不施用菌剂。成熟后分别对土壤进行检测。结果显示，施用菌剂显著降低了土壤全盐量(去除率47.2％)，提高了土壤有机质含量(提高率11.2％)，还能有效降低土壤Cd、Pb、As含量。也能有效促进蔬菜生长，对花椰菜平均亩产的促生率达到14.6％。

表3菌剂对重金属污染的滩涂盐碱地土壤的修复效果

表4菌剂对花椰菜产量的影响

本实施例中涉及的培养基的组分具体如下：

种子培养基(每升)的组分含量为：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L。

产芽胞培养基(每升)的组分含量为：麸皮10g/L，玉米饼10g/L，尿素10g/L，硫酸镁0.5g/L，碳酸钙0.1g/L，NaCl 20g/L，pH 7.0。

与现有技术相比，本发明筛选获得的Cytobacillus sp.L71能够有效修复具有重金属污染风险的盐碱地土壤，通过提高土壤微生物活性降低土壤含盐量，提高土壤有机质含量，并且该菌株可显著降低土壤中重金属的迁移风险、提高超积累植物对重金属的吸收，有效实现重金属污染的盐碱地土壤修复。

上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同的方式对其进行局部调整，本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施所限，在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。