一种人工多细胞体系及其在易腐垃圾堆肥中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人工多细胞体系及其在易腐垃圾堆肥中的应用。

背景技术

易腐垃圾又称湿垃圾，主要包括餐厅、食堂、居民家庭等在生产生活过程中产生的餐厨废弃物和有机垃圾等，是城市生活垃圾的主要组成部分之一，其成分复杂，含水率高，主要由油、水、果皮、蔬菜、米面、鱼、肉、骨头以及废餐具、塑料、纸巾等多种物质的混合物组成。从化学组成上分析，易腐垃圾由淀粉、蛋白质、纤维素、脂类等组成，极易腐烂发臭，传播细菌和病毒，大量堆积不仅影响市容市貌，还污染环境和危害人们的健康，但因其有机物含量丰富因此具有较佳的资源回收潜力。

相较于填埋法、焚烧法等易腐垃圾处理方法，微生物好氧堆肥处理技术近年来成为易腐垃圾高效减量化处理的新方法。所谓微生物好氧堆肥处理技术是在有氧条件下，利用好氧微生物对易腐垃圾进行氧化、分解代谢，是一种传统好氧堆肥技术与外源微生物强化结合的定向减量处理的现代堆肥技术，且处理后的残留物可以制成有机肥料。专利CN109182179A中使用枯草芽孢杆菌制备成菌剂，以1公斤降解菌剂加入餐厨垃圾降解机中，加入0 .4公斤剩余的饭菜进行降解处理，48小时内餐厨垃圾减重率达到93.2％；专利CN107435032A中由解淀粉芽孢杆菌HQY-01、蔬菜芽孢杆菌HQY-02、特基拉芽孢杆菌HQY-03制成菌剂以冻干粉、菌液、菌泥等不同形式加入到餐厨垃圾中，降解反应的时间为1～3天，垃圾减量率达90％以上；在专利CN103121859B中采用将餐厨垃圾进行油水分离，将固体物质加入2%固体菌剂并通过控制通风搅拌堆肥15～20天，得到初级有机肥料。总体而言，目前报道的有关餐厨垃圾减量处理的专利更专注于总重量的减少，所提供的菌剂组分较为复杂，且降解效率较为有限，处理周期较长。此外，考虑到餐厨垃圾含有高达70～90％的含水率，因此单一的减重率并不能直观说明餐厨垃圾内有机物的降解情况。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种人工多细胞体系，通过多轮次筛选，获得了具有较好易腐垃圾降解能力的三株优势菌株，经复配得到了人工多细胞体系，其对易腐垃圾的综合降解能力较好，且降解效率极佳。

本发明的第一个目的在于，提供一种人工多细胞体系，包括地衣芽孢杆菌（

本发明针对易腐垃圾的主要化学成分，通过多轮次筛选，获得了具有较好易腐垃圾降解能力的优势菌株，其中地衣芽孢杆菌ZJB20148淀粉酶酶活最高，恶臭假单胞菌ZJB18047对蛋白质、纤维素的酶解效果好，嗜热球形脲芽孢杆菌ZJB20037对脂肪降解的效果最好。三种菌株经复配后制成人工多细胞体系，经测试其对易腐垃圾的综合降解效果良好。

作为优选，地衣芽孢杆菌ZJB20148、恶臭假单胞菌ZJB18047和嗜热球形脲芽孢杆菌ZJB20037的质量比为1 ：0.5：1。

作为优选，所述人工多细胞体系还包括用于菌剂固定的秸秆粉、草炭粉和硅藻土。

作为进一步优选，以湿菌体重量计，三种细菌湿菌体加入量占人工多细胞体系总质量的5%～15%。

作为优选，秸秆粉、草炭粉和硅藻土的质量比为5：3：2。

本发明的第二个目的在于，提出了上述任一种人工多细胞体系在易腐垃圾堆肥中应用。

本发明的第三个目的在于，提出了一种易腐垃圾堆肥方法，具体为使用上述任一种人工多细胞体系对易腐垃圾进行发酵降解。

作为优选，所述易腐垃圾堆肥方法包括以下步骤：

（1）将易腐垃圾和人工多细胞体系投入发酵仓，搅拌均匀；

（2）先进行升温处理后降温处理，此过程保持通风，并间歇搅拌，进行降解；

（3）投入易腐垃圾，重复步骤（2），进行再次降解；

（4）重复步骤（3）直至发酵仓满仓，得到有机堆肥料。

作为进一步优选，步骤（1）中易腐垃圾的含水量为50%~60%。

作为进一步优选，步骤（1）中人工多细胞体系为干制剂，所述干制剂的加入量至少为易腐垃圾重量的1%。

作为优选，使用添加锯末的方式调节步骤（1）中易腐垃圾的含水率。

作为优选，步骤（2）中高温处理的温度为55~65℃，时间12h。

作为进一步优选，步骤（2）中高温处理的温度为60℃。

作为优选，步骤（2）中低温处理的温度为40~50℃，时间12h。

作为进一步优选，步骤（2）中低温处理的温度为45℃。

作为优选，步骤（2）中间歇搅拌条件为每搅拌15～30min，静止5～10min。

作为优选，步骤（3）中易腐垃圾的加入量为步骤（1）中易腐垃圾加入量的相当量。

所谓相当量是指投入易腐垃圾的量不得对堆肥效果产生负面影响。

作为进一步优选，步骤（3）中易腐垃圾的投入量等于步骤（1）中易腐垃圾的加入量。

本发明的第四个目的在于，提供一种有机堆肥料，通过使用上述任一种易腐垃圾堆肥方法制得。

本发明的第五个目的在于，提出了上述有机堆肥料在制备有机肥料、土壤改良剂以及盆栽基质中应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明的人工多细胞体系能够对易腐垃圾中的淀粉、蛋白质、脂肪等进行有效降解，满足易腐垃圾主要成分的降解需求，提高了易腐垃圾降解的减量化程度。此外，本发明的人工多细胞体系对易腐垃圾进行堆肥的方法简单，操作方便，周期短，且经堆肥后的产物达到堆肥产品标准，实现了易腐垃圾的高效资源利用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例，下面将对附图做简单介绍：

图1是本发明性能测试2中种子发芽指数（GI）监测表。

具体实施方式

下面结合说明书附图以及具体实施例对本发明做进一步描述。本领域普通技术人员在基于这些说明的情况下将能够实现本发明。此外，下述说明中涉及到的本发明的实施例通常仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

实施例1

（1）菌株的获取

从浙江工业大学毓秀餐厅附近的土样中取2克新鲜样品悬浮在无菌水中， 30℃，150 rpm震荡30min，得到悬浮液。将悬浮液用无菌水进行梯度稀释，浓度梯度为10

由于油脂难以降解，因此需要对油脂降解菌株进行单独筛选。在浙江工业大学毓秀餐厅的排风口附近收集了油污区域的土壤。用含有2.0％植物油的矿物盐培养基（其中NH4NO3 1.0 g/L，KH2PO4 0.5 g/L，K2HPO4·3H2O 5.24 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，CaCl20.02 g/L，FeCl3 0.002 g/L，NaCl 0.01 g/L，酵母粉0.05 g/L，植物油20.0 g/L）对油脂降解菌株进行富集后，同样使用梯度稀释法在琼脂培养基上进行分离。

用FastDNATM Spin Kit for Soil试剂盒提取菌株基因组DNA，以此为模板，进行PCR扩增，真菌通用引物：

ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，

ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’，

细菌通用引物：

27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3'，

1492R：5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'。

产物由擎科生物技术有限公司进行PCR产物测序，将获得的DNA序列，输入GenBank，用Blast程序与数据库中的所有序列进行比对，选择合适的DNA序列建立系统发育树，确定筛选获得菌株的种属。最终共筛选获得87株菌株。

（2）菌株的初筛

将上述87株菌株分别接种到淀粉培养基、脂肪培养基、蛋白质培养基和纤维素培养基中进行初筛，其中淀粉培养基组分及含量为：蛋白胨5.0g/L，可溶性淀粉20.0g/L，琼脂20.0g/L，NaCl 5.0g/L，pH 7.0~7.2，碘 1g/L；蛋白质培养基组分及含量为：脱脂奶粉50g/L，琼脂20.0g/L；脂脂培养基组分及含量为：蛋白胨 10.0g/L，NaCl 10.0g/L，CaCl

表1. 降解效果较好菌株的降解活性表

注：表中“-”表示无或者未检出。

通过观察表1可知，从淀粉的降解活性指标上来看，表1中的6种菌株的降解活性都良好，其中地衣芽孢杆菌ZJB20148对淀粉的降解活性最为突出，其降解活性为蜡状芽孢杆菌的一倍之多；从蛋白质的降解活性指标上来看，表1中的6种菌株对其均具有一定的降解活性，其中恶臭假单胞菌ZJB18047对蛋白质的降解活性最高，其次为地衣芽孢杆菌ZJB20148，两者的降解活性指标仅相差0.3；从油脂的降解活性指标上来看，表中并非所有的菌株对油脂都具有降解活性，嗜热球形脲芽孢杆菌ZJB20037对油脂的降解活性最高，其指标高达3.8，其次为恶臭假单胞菌ZJB18047，但是恶臭假单胞菌ZJB18047的降解活性未达到嗜热球形脲芽孢杆菌ZJB20037的1/3；从纤维素的降解活性指标上来看，除嗜热球形脲芽孢杆菌ZJB20037外，其他5种菌株的降解活性均良好，但是活性最佳的是地衣芽孢杆菌ZJB20148，其次为恶臭假单胞菌ZJB18047，两者降解活性指标仅相差0.1。

（3）菌株二次筛选

用平板活化LB固体培养基将冻存的表1中的初筛菌株甘油管分别平板划线，37℃培养12h。将生长良好的菌落挑到2L摇瓶中含有700mL的LB发酵培养基中，200r/min，于37℃培养24h。取发酵液于8000rpm/min离心10min，取上清液测定淀粉酶、蛋白质酶、脂肪酶和纤维素酶酶活。淀粉酶活性测定采用DNS法，酶活定义为：1ml酶液每分钟生成1μg还原糖，即为1个酶活单位，以“U/ml”表示。蛋白质酶酶活性通过福林酚法测定，酶活定义为1ml酶液每分钟生成1μg酪氨酸，即为1个酶活单位，以“U/ml”表示。脂肪酶酶活性测定用酸碱滴定法，酶活定义为：1mL酶液每分钟产生1μmol的可滴定的脂肪酸，即为1个酶活力单位，以“U/mL”表示。纤维素酶活性测定用DNS法，1mL酶液每分钟生成1μg还原糖所需的酶量，即为1个酶活单位，以“U/mL”表示。反应温度为40℃，pH=7.0。经测试，得菌株酶活检测结果表如下：

表2. 菌株酶活检测结果表

通过观察表2可知，从淀粉酶酶活检测结果上来看，地衣芽孢杆菌ZJB20148的酶活最高，达到818.6 U/ml，远超其他菌株，其次为酶活为352.9 U/ml的肠杆菌，其酶活不及地衣芽孢杆菌ZJB20148对淀粉的酶活的一半；从蛋白质酶酶活上来看，恶臭假单胞菌ZJB18047的酶活最高，达到1027 U/ml，其次为地衣芽孢杆菌ZJB20148，其酶活为605 U/ml；从纤维素酶酶活上来看，恶臭假单胞菌ZJB18047的酶活最高，为10.1 U/ml，其次为地衣芽孢杆菌ZJB20148，两者纤维素酶酶活仅相差0.2 U/ml；从脂肪酶酶活上来看，嗜热球形脲芽孢杆菌ZJB20037的酶活最高，其次为地衣芽孢杆菌ZJB20148，但是地衣芽孢杆菌ZJB20148脂肪酶酶活不及嗜热球形脲芽孢杆菌ZJB20037的酶活的1/3。

（4）菌株的选取

通过上述两轮筛选与分析，最终选择由地衣芽孢杆菌ZJB20148、恶臭假单胞菌ZJB18047和嗜热球形脲芽胞杆菌ZJB20037构建人工多细胞体系。其中地衣芽孢杆菌（

实施例2

（1）菌株的制备

用平板活化LB固体培养基将冻存的地衣芽孢杆菌ZJB20148、恶臭假单胞菌ZJB18047和嗜热球形脲芽胞杆菌甘油管分别平板划线，37℃培养12h，进行菌株活化。之后，将生长良好的菌落挑到2L摇瓶中含有100mL 的LB发酵培养基中，200r/min，37℃培养48h，得到地衣芽孢杆菌ZJB20148、恶臭假单胞菌ZJB18047、嗜热球形脲芽孢杆菌ZJB20037种子液。将种子液转接到含有800ml LB的2L摇瓶中，200r/min，37℃培养48小时，8000r/min离心10min，得到三株菌株的湿菌体。

（2）人工多细胞体系的制备

将地衣芽孢杆菌ZJB20148、恶臭假单胞菌ZJB18047、嗜热球形脲芽孢杆菌ZJB20037湿菌体分别以1：1：0.5、1：0.5：1、0.5：1：1的质量比混合，并与用于菌剂固定的秸秆粉、草炭粉和硅藻土混匀，40℃烘干后即得到人工多细胞体系的干制剂，40℃自然烘干后4℃保存备用。其中秸秆粉、草炭粉和硅藻土的质量比为5：3：2，三种细菌湿菌体的加入量占人工多细胞体系总质量的5%。

实施例3

本实施例使用实施例2制得的人工多细胞体系（地衣芽孢杆菌ZJB20148、恶臭假单胞菌ZJB18047、嗜热球形脲芽孢杆菌ZJB20037湿菌体的质量比为1：1：0.5）进行易腐垃圾堆肥，包括以下步骤：

（1）将易腐垃圾进行初步挑拣，剔除塑料，骨头等不易降解物质，并将其粉碎，得到粒径小于2cm的易腐垃圾；

（2）向发酵仓内投入1000g易腐垃圾，加入锯末以调节易腐垃圾的含水率至50%，之后投入人工多细胞体系的干制剂100g，搅拌均匀；

（3）调节发酵仓内温度至60℃，刺激微生物活性，12h后，降低温度至45℃，继续维持12h，并视情况补充水分，期间保持通风，并间歇搅拌，具体为：每搅拌15min，静止5min；

（4）再次投入1000g易腐垃圾，控制相同反应条件，进行再次降解，重复直至发酵仓满仓，得到有机堆肥料。

实施例4

本实施例使用实施例2制得的人工多细胞体系（地衣芽孢杆菌ZJB20148、恶臭假单胞菌ZJB18047、嗜热球形脲芽孢杆菌ZJB20037湿菌体的质量比为1：0.5：1）进行易腐垃圾堆肥，包括以下步骤：

（1）将易腐垃圾进行初步挑拣，剔除塑料，骨头等不易降解物质，并将其粉碎，得到粒径小于2cm的易腐垃圾；

（2）向发酵仓内投入1000g易腐垃圾，加入锯末以调节易腐垃圾的含水率至60%，之后投入人工多细胞体系10g，搅拌均匀；

（3）调节发酵仓内温度至55℃，刺激微生物活性，12h后，降低温度至40℃，继续维持12h，并视情况补充水分，期间保持通风，并间歇搅拌，具体为：每搅拌30min，静止10min；

（4）再次投入1000g易腐垃圾，控制相同反应条件，进行再次降解，重复直至发酵仓满仓，得到有机堆肥料。

实施例5

本实施例使用实施例2制得的人工多细胞体系（地衣芽孢杆菌ZJB20148、恶臭假单胞菌ZJB18047、嗜热球形脲芽孢杆菌ZJB20037湿菌体的质量比为0.5：1：1）进行易腐垃圾堆肥，包括以下步骤：

（1）将易腐垃圾进行初步挑拣，剔除塑料，骨头等不易降解物质，并将其粉碎，得到粒径小于2cm的易腐垃圾；

（2）向发酵仓内投入1000g易腐垃圾，加入锯末以调节易腐垃圾的含水率至60%，之后投入人工多细胞体系50g，搅拌均匀；

（3）调节发酵仓内温度至65℃，刺激微生物活性，12h后，降低温度至50℃，继续维持12h，并视情况补充水分，期间保持通风，并间歇搅拌，具体为：每搅拌20min，静止8min；

（4）再次投入1000g易腐垃圾，控制相同反应条件，进行再次降解，重复直至发酵仓满仓，得到有机堆肥料。

实施例6

本实施例与实施例2仅存在以下区别，其余相同部分在此处不再进行赘述：

在步骤（2）中，三种细菌湿菌体的加入量占人工多细胞体系总质量的15%。

性能测试1

为测试本发明人工多细胞体系对易腐垃圾主要成分的降解效果，本性能测试对实施例2中3种不同菌株比例的人工多细胞体系对易腐垃圾的淀粉降解率、蛋白质降解率、油脂降解率、纤维素降解率及总减重率进行测试，同时设置对照组，其中对照组1为添加等量易腐垃圾的空白对照，对照组2、3、4分别添加含地衣芽孢杆菌ZJB20148、恶臭假单胞菌ZJB18047、嗜热球形脲芽孢杆菌ZJB20037单菌株的干制剂代替人工多细胞体系。经检测计算，得下表：

表3.降解情况表

注：表中降解率=（A-B）÷A×100%，其中A为某一成分初始含量，B为某一成分剩余含量；总减重率=（a-b）÷a×100%，其中a为总质量，b为易腐垃圾降解后的总质量。

经观察表3可以发现，本发明通过将三种菌株进行复配，有效的提高了对易腐垃圾的综合降解能力，增加了总减重率，其中地衣芽孢杆菌ZJB20148、恶臭假单胞菌ZJB18047、嗜热球形脲芽孢杆菌ZJB20037湿菌体的质量比为1：0.5：1时综合降解效果最佳。

性能测试2

本性能测试对实施例3堆肥过程中降解产物的腐熟情况进行监测，监测指标为种子发芽指数（GI）。其中发芽率（GI）测定方法为：取5g有机堆肥料加入50ml蒸馏水，震荡1h，过滤，加到铺有2张滤纸的9cm培养皿中，每个培养皿均匀放置20粒完整饱满的黄瓜种子，30℃培养48小时，测定发芽率和根长，经计算取平均值。同时以不接种人工多细胞体系做空白对照组，得附图1。参阅图1可知，使用人工多细胞体系进行堆肥，在第六天后GI大于80%，此时堆肥完全腐熟，而对照组经10天监测发现，其最大GI值仅能达到65%。

性能测试3

为测试经本发明易腐垃圾堆肥方法得到的有机堆肥料的产品质量，进一步测试实施例3制得的有机堆肥料的堆肥成熟度指标。主要测定方法如下：使用元素分析仪测定样品的总碳（TC）和总氮（TN），并计算碳氮比（C/N）；将样品通过微波消解在硝酸中，然后分别采用光谱法和原子吸收法测定总磷（TP）和总钾（TK）；将样品与蒸馏水按1:10的质量体积比进行混匀，180 rpm水平震荡2 h，静置30 min后，分别用pH计和电导仪测定样品的pH和电导率（EC）；利用电感耦合等离子体（ICP）法测定各样品中的重金属浓度，包括Cd、Pb、Hg、As和Cr，种子发芽率（GI）测定方法同性能测试2。与此同时，添加等量易腐垃圾用作空白对照，经检测得实验结果如下：

表4.肥成熟度指标

通过观察上表可知，使用本发明的人工多细胞体系对易腐垃圾进行堆肥后，得到有机堆肥料经监测完全符合中国有机肥标准，实现了易腐垃圾的高效资源利用。