利用KASP快速检测绵羊FecB基因单核苷酸多态性的方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术与家畜育种领域，涉及基因单核苷酸多态性(SNP)的检测，特别涉及利用竞争性等位基因特异性PCR(KASP)方法进行快速、精准地检测与绵羊繁殖性状相关的FecB基因的g.30050773SNP标记。

背景技术

绵羊作为最早被人类驯化的动物之一，在畜牧产业中具有重要的经济价值，可以为人们提供羊肉、羊奶、羊绒、羊皮等一系列动物副产品。现代绵羊育种旨在提高其生产性能从而大大提高其经济价值。随着生物科学技术的发展以及遗传学研究的深入，传统的选择方法逐渐暴露出周期长、难度大等弊端。近年来，分子标记辅助选择(Marker-assistedSelection，MAS)在动物育种中广为应用，可以显著提高选择的准确性和选择效率。分子标记辅助选择可以从分子水平上快速准确地分析个体的遗传组成，从而实现对基因型的直接选择，进行分子育种。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。利用SNP分析个体基因组，可以更好地解释个体的表型差异，在动物分子育种中具有重要意义。SNP遍布于整个基因组，其中大部分位于已知的基因区域内，还有一些位于决定基因功能的关键性区域，如启动子区和外显子区等。常见的SNP检测方法包括：测序法、酶切法、基因芯片法、SNPshot、KASP(KompetitiveAllele Specific polymerase chain reaction，竞争性等位基因特异性PCR)法等。然而测序法、酶切法、基因芯片法、SNPshot等方法存在阳性率低、设备要求高、成本偏高等问题。而KASP具有以下几个优势：(1)优异的准确性和检测效果，准确性＞99.8％；(2)超强的灵活性，支持低、中、高通量的检测及个体重复；(3)低成本，无需昂贵的标记探针，较低的DNA样本量。KASP已逐渐成为目前主要的SNP检测方法之一，在SNP分型研究中发挥重要作用。

绵羊繁殖性状的早期选择一直是养殖行业的难题之一，绵羊繁殖性状的提升是发展相关产业并获得经济效益的关键。为解决这一难题，需要在DNA水平上筛查和检测与绵羊繁殖性状密切相关的分子标记。目前尚未见到有关绵羊FecB基因的g.30050773SNP位点上与绵羊产羔数性状相关的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用KASP快速检测绵羊FecB基因单核苷酸多态性的方法及其应用，通过对绵羊FecB基因的g.30050773SNP的检测以及利用相应的绵羊FecB基因的g.30050773SNP标记进行繁殖性状早期选择，从而加快绵羊良种选育速度。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种利用KASP快速检测绵羊FecB基因单核苷酸多态性(g.30050773SNP)的方法，该检测绵羊FecB基因的g.30050773单核苷酸多态性的方法包括以下步骤：

以待测绵羊个体全基因组DNA为模板，通过引物混合物扩增包含g.30050773单核苷酸多态性位点的FecB基因部分片段；根据荧光类型和强度的分析结果鉴定个体在该g.30050773单核苷酸多态性位点的基因型；

所述FecB基因的g.30050773单核苷酸多态性位点为定位于绵羊参考序列NC_056059.1:g.30050773的C>T变异位点；

优选的，所述引物混合物包括由上游分型引物FAM、上游分型引物VIC和下游引物R组成的KASP引物：

上游分型引物FAM：

5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCATCTGAATTTGCTTTGCTATCGTC-3’；

上游分型引物VIC：

5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCATCTGAATTTGCTTTGCTATCGTT-3’；

下游引物R：

5’-GTGCCGTGAACGCACTAACAGTGTGTTGG-3’。

优选的，所述检测FecB基因的g.30050773单核苷酸多态性的方法中，KASP反应体系包括待测绵羊个体全基因组DNA以及引物混合物。

优选的，所述检测FecB基因的g.30050773单核苷酸多态性的方法中，KASP的扩增反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s，61℃退火1min，共10个循环，每个循环后退火温度降低0.6℃；95℃变性15s，55℃退火1min，共30个循环。

优选的，采用PCR仪完成上述扩增反应程序后，qPCR仪分析荧光类型和强度。

优选的，所述基因型的鉴定具体包括以下步骤：根据与KASP引物(具体指两个上游分型引物)带有的接头序列匹配的不同类型荧光的强度对FecB基因的g.30050773单核苷酸多态性位点的CC、CT、TT三种基因型进行分型。

上述利用KASP快速检测绵羊FecB基因的g.30050773单核苷酸多态性的方法在绵羊分子标记辅助选择育种中的应用，所述BMPR1B基因的g.30050773单核苷酸多态性位点(具体为NC_056059.1:g.30050773C>T)的不同基因型与绵羊产羔性状显著相关。

优选的，所述FecB基因的g.30050773单核苷酸多态性位点的CT基因型可以作为提高绵羊繁殖性状的分子标记。

本发明的有益效果体现在：

本发明根据对绵羊FecB基因的g.30050773单核苷酸多态性位点(NC_056059.1:g.30050773)与绵羊产羔数性状进行关联分析的结果，首次发现该位点的不同基因型与绵羊产羔数性状显著相关，并存在作为提高绵羊繁殖性状早期选择的分子标记。据此本发明的检测方法可加快建立繁殖性状优良的绵羊种群，提高良种选育速度，可应用于绵羊分子标记辅助选择育种中，加快建立优良绵羊遗传资源群体。

进一步的，本发明通过KASP方法可以对绵羊FecB基因的g.30050773单核苷酸多态性位点(NC_056059.1:g.30050773)进行准确的基因分型鉴定，具有简单、快速、低成本的优点。

附图说明

图1为绵羊FecB基因的g.30050773SNP位点(NC_056059.1:g.30050773)分型结果。其中TT基因型为正方形、CT基因型为三角形、CC基因型为圆形。

图2为绵羊FecB基因的g.30050773SNP位点(NC_056059.1:g.30050773)扩增产物测序图；其中：上部测序峰图表示基因型为CC，下部测序峰图表示基因型为TT，框出的碱基位置为SNP位点。

具体实施方式

下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

一种快速检测绵羊FecB基因单核苷酸多态性用引物混合物，所述引物混合物能够用于扩增绵羊FecB基因NC_056059.1:g.30050773单核苷酸多态性位点。

优选的，所述引物混合物包括由上游分型引物FAM、上游分型引物VIC和下游引物R组成的KASP引物：

上游分型引物FAM：

5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCATCTGAATTTGCTTTGCTATCGTC-3’；

上游分型引物VIC：

5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCATCTGAATTTGCTTTGCTATCGTT-3’；

下游引物R：

5’-GTGCCGTGAACGCACTAACAGTGTGTTGG-3’。

如上所述的绵羊FecB基因NC_056059.1:g.30050773单核苷酸多态性位点检测用引物混合物在绵羊繁殖性状分子标记辅助选择育种方面中的应用。

一种利用如上所述的引物混合物的FecB基因NC_056059.1:g.30050773单核苷酸多态性位点的检测方法，步骤如下：

以待测绵羊个体全基因组DNA为模板，通过引物混合物扩增包含g.30050773单核苷酸多态性位点的FecB基因部分片段；根据荧光类型和强度的分析结果鉴定个体在该g.30050773单核苷酸多态性位点的基因型；

优选的，所述检测FecB基因的g.30050773单核苷酸多态性的方法中，KASP的扩增反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s，61℃退火1min，共10个循环，每个循环后退火温度降低0.6℃；95℃变性15s，55℃退火1min，共30个循环。

一种如上所述的绵羊FecB基因NC_056059.1:g.30050773单核苷酸多态性位点检测方法在绵羊繁殖性状分子标记辅助选择育种方面中的应用。更为具体地相关制备步骤如下：

本发明利用KASP方法对绵羊FecB基因的g.30050773单核苷酸多态性位点与绵羊产羔数性状进行关联分析，验证其是否可以作为绵羊分子育种中辅助选择的分子标记。

1.实验药品与试剂

1.1生化试剂与生物学试剂

①Taq DNA聚合酶(购自Fermantas，即MBI公司)；②蛋白酶K(购自华美生物工程公司)；③Marker I(购自天根生化科技(北京)有限公司)。

1.2普通试剂

普通试剂从华美生物工程公司购买，为进口分装产品：柠檬酸、柠檬酸钠、葡萄糖、Tris、EDTA、NaCl、NaOH、KCl、Na

1.3溶液与缓冲液

所有溶液与缓冲液均采用去离子超纯水配制。高压灭菌条件为15bf/in(1.034×10

1)提取组织样DNA所用溶液

①2mol/L NaCl：11.688g NaCl溶于水，定容至100mL，高压灭菌。

②组织DNA提取液(100mL)：l mol/L Tris-Cl(pH 8.0)l mL、0.5mol/L EDTA(pH8.0)20mL，以及2mol/L NaCl 5mL，定容至100mL。

③基因组DNA提取时的公用溶液

2)琼脂糖凝胶电泳分析所用溶液

①0.5×TBE缓冲液：取10×TBE 50mL，定容至1000mL。

②上样缓冲液：0.25％溴酚蓝及0.25％二甲基苯氰FF，溶剂为40.0％(w/v)蔗糖水溶液。2.设计绵羊FecB基因的g.30050773SNP位点的KASP引物

在NCBI上检索绵羊FecB基因的序列，并利用Primer 6.0设计能够扩增绵羊FecB基因的g.30050773SNP SNP位点(NC_056059.1:g.30050773)的PCR引物对，具体引物序列如下：

上游分型引物FAM：

5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCATCTGAATTTGCTTTGCTATCGTC-3’；

上游分型引物VIC：

5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCATCTGAATTTGCTTTGCTATCGTT-3’；

下游引物R：

5’-GTGCCGTGAACGCACTAACAGTGTGTTGG-3’。

3.获取绵羊组织样品DNA及繁殖性状数据

3.1绵羊耳组织样品的采集与繁殖性状数据收集

实验所用的动物共计820个样本，具体信息见表1。随机选择饲养环境、管理条件一致的成年绵羊，采集每个个体的耳组织样，在70％乙醇中保存，冰盒低温收集后置于-80℃冻存。采样信息如下：澳洲白绵羊耳组织样在天津奥群牧业有限公司采用群体随机抽样方式收集，采集时间为2019年8月；共采集820个澳洲白绵羊个体耳组织样。其中，568只绵羊殖性状数据由育种场测量，包括第一胎产羔数、第二胎产羔数、第三胎产羔数、第四胎产羔数和第五胎产羔数等产羔数性状。

表1采样信息

3.2组织样品中基因组DNA的提取

1)取约10mg绵羊组织样，放于1.5mL的离心管中，用小剪刀尽量剪碎。

2)加入600μL组织DNA提取液，加入10％SDS至终浓度为1％，加入蛋白酶K至终浓度为100μg/mL，55.0℃消化过夜，保证组织样较均匀地分布在组织DNA提取液中。

3)消化完毕后溶液冷却至室温，加入等体积的Tris饱和酚，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，至少持续10min以上，12000r/min离心15min。

4)取上清液，加入等体积的酚:氯仿(1:1)，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，至少持续10min以上，12000r/min离心15min。

5)取上清液，加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，至少持续10min以上，12000r/min离心15min。

6)取上清液，加入2倍体积的冰冷无水乙醇和1/10体积的3mol/L乙酸钠，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，直至液体清亮、出现白色絮状DNA。

7)挑出DNA，放进一个1.5mL的离心管中，加入500μL 70％乙醇，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，然后12000r/min离心3～5min，小心倒掉乙醇，将管倒置于吸水纸上。

8)再一次向离心管中加入500μL 70％乙醇，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，然后12000r/min离心3～5min，小心倒掉乙醇，将管倒置于吸水纸上。

9)待干燥后，加入60μL灭菌超纯水，为使DNA完全溶解，4℃保存过夜，待检测。

3.3DNA的纯化

1)500μL的DNA溶液中加入10％ SDS，使SDS终浓度为0.1％，加入蛋白酶K至终浓度达到100μg/mL。

2)55℃保温10h左右。

3)等体积苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿分别抽提一次。

4)12000r/min离心5min分相，吸取上层水相至另一离心管中。

5)加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇沉淀DNA。

6)倒掉液体，70％乙醇洗涤，待DNA晾干，加入60μL灭菌超纯水溶解，4℃保存，待检测。

3.4分光光度法检测DNA

用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值。计算OD

DNA浓度(ng/μL)＝50×OD

DNA检测合格后，取出一定的量DNA溶液，稀释为50ng/μL模板DNA，存于-20℃备用，其余的存放于-80℃。

4.利用KASP方法检测SNP位点

4.1KASP反应体系

首先在每个96孔板中加入10μL石蜡油，然后加入KASP反应体系(13μL)：FLu-Arms2×PCR Mix 6.5μL；绵羊样本基因组DNA(模板DNA)1μL；50μM引物混合液(上游分型引物FAM:上游分型引物VIC:下游引物R摩尔比＝1:1:3)0.5μL；其余用ddH

4.2KASP反应程序

反应程序为：

(1)预变性：95℃预变性10min；

(2)降落PCR：95℃变性15s，61℃退火1min，共10个循环，每个循环后退火温度降低0.6℃；

(3)扩增：95℃变性15s，55℃退火1min，共30个循环；

(4)读板：30℃25s(read)，1循环。

5.鉴定绵羊FecB基因的g.30050773遗传变异位点KASP分型

根据不同类型荧光的强度进行KASP分型，在KASP分型结果中，FecB基因NC_056059.1:g.30050773的C>T变异位点的CC、CT、TT三种基因型清晰且明显分为三簇，三种基因型KASP结果清晰可分辦，其中TT基因型为正方形、CT基因型为三角形、CC基因型为圆形(图1)。

6.绵羊FecB基因的g.30050773遗传变异位点的频率统计分析

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率：

P

式中，P

等位基因频率的计算公式为：

P

式中，P

在绵羊遗传资源群体中，NC_056059.1:g.30050773C>T变异位点的基因频率统计结果如表2所示。

表2.澳洲白绵羊FecB基因的g.30050773遗传变异位点的基因型频率、等位基因频率及遗传参数分析

7.绵羊FecB基因的g.30050773SNP位点变异基因效应的关联分析

基因型数据：FecB基因NC_056059.1:g.30050773C>T变异位点的CC、CT、TT三种基因型；

繁殖数据：澳洲白绵羊的产羔数性状；

分析方法：利用SPSS对绵羊个体进行基因型与产羔数性状的关联分析。

表3.SNP位点(NC_056059.1:g.30050773)与澳洲白绵羊繁殖性状的相关性分析

由表3可以看出，利用SPSS进行关联分析，研究FecB基因NC_056059.1:g.30050773C>T变异位点不同基因型对绵羊产羔性状的影响，结果发现，不同基因型与澳洲白绵羊第四胎产羔数显著相关(P<0.05)，而且CT基因型个体第四胎产羔数显著高于CC基因型个体；因此，绵羊FecB基因NC_056059.1:g.30050773C>T变异位点(NC_056059.1:g.30050773)的CT基因型可作为绵羊繁殖性状的DNA分子标记。

总之，本发明发现了绵羊FecB基因NC_056059.1:g.30050773C>T变异位点(NC_056059.1:g.30050773)并将其与绵羊的繁殖性状进行关联分析，发现其与绵羊繁殖性状显著相关，可以作为绵羊繁殖性状早期选择的分子育种的辅助选择的分子标记，从而加快良种选育速度。本发明所建立的利用KASP快速检测绵羊FecB基因单核苷酸多态性的方法及其应用，有利于快速建立繁殖性状优良的绵羊种群，加快良种选育速度。

上游分型引物FAM：

5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCATCTGAATTTGCTTTGCTATCGTC-3’；

上游分型引物VIC：

5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCATCTGAATTTGCTTTGCTATCGTT-3’；

下游引物R：

5’-GTGCCGTGAACGCACTAACAGTGTGTTGG-3’。

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

序列1:"西北农林科技大学_seq_1"

特征

残基

gaaggtgacc aagttcatgc tcatctgaat ttgctttgct atcgtc 46

序列2:"西北农林科技大学_seq_2"

特征

残基

gaaggtcgga gtcaacggat tcatctgaat ttgctttgct atcgtt 46

序列3:"西北农林科技大学_seq_3"

特征

残基

gtgccgtgaa cgcactaaca gtgtgttgg 29。