用于鉴定上饶大面白茶树的分子标记及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种上饶大面白茶树的分子标记及其应用。

背景技术

上饶大面白茶树(Prunus salicina var.taoxingli)是茶树无性系品种之一，原产江西省上饶县上泸乡及钻山、龙元岗一带，栽培历史已有一百余年。原产江西省上饶县上沪乡洪水坑。主要分布在江西上饶等县。河南、湖南、安徽、广东等省有引种。1985年全国农作物品种审定委员会认定为国家品种，编号GS13018—1985。上饶大面白茶树植株较高大，树姿开张，分枝密度中等，叶片下垂状着生。叶长椭圆形，叶色绿，有光泽，叶面微隆起，叶齿粗，叶质厚软。芽叶肥壮，黄绿色，茸毛特多，一芽三叶百芽重73.5g。花冠直径6.5cm，花瓣6瓣，子房茸毛中等，花柱3裂。芽叶生育力强，持嫩性强。春茶萌发期在3月下旬，一芽三叶盛期在4月中旬。产量高，每667平方米可达200kg。春茶一芽二叶干样约含氨基酸3.1％、茶多酚21.1％、儿茶素总量12.3％。适制绿茶、红茶和乌龙茶。制上饶白眉、仙台大白，条索壮实，隐绿显毫，香气清鲜，味醇回甘。扦插繁殖力较强。

由于上饶大面白茶引种广泛，且不同茶树在种苗期，甚至成苗期表型都比较接近，难以鉴别。目前还未有用于上饶大面白茶树准确鉴定的分子标记。

发明内容

为了克服上述困难，我们采用了基于二代测序的方法获得了上饶大面白茶树的两段段AT富集片段。经分析该片段与现有任何茶树的基因组均不存在高度同源,适合作为上饶大面白茶树的鉴定的参考序列。进一步利用测序数据设计了一种可靠的鉴定上饶大面白茶树的方法。本发明所采取的技术方案是：

一方面，本法提供一种鉴定或辅助鉴定上饶大面白茶树分子标记，其核酸序列如SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示。

另一方面，本发明的另一目的在于提供上述分子标记在上饶大面白茶树鉴定或辅助鉴定中的应用。

另一方面，本发明提供一种鉴定或辅助鉴定上饶大面白茶树的方法，其特征在于包含以下步骤：

1)采集待检测的茶树绿色组织作为待检测样品；

2)提取待检测样品的总DNA；

3)对上述样品的总DNA分别进行二代高通量测序，获得测序reads；

4)对测序数据进行组装，将组装的contigs与前述分子标记比对；

5)将能够完全覆盖分子标记且一致性最高的contigs与分子标记进行序列比对，根据比对结果判断所述样品是否为上饶大面白茶树；如能与所述分子标记序列一致，即判断待测样品的物种是上饶大面白茶树。

另一方面，本发明提供一种鉴定或辅助鉴定上饶大面白茶树的方法，其特征在于包含以下步骤：

1)采集待检测茶树绿色组织作为待检测样品；

2)提取待检测样品的总DNA；

3)对上述样品的总DNA分别进行二代高通量测序，获得测序reads；

4)利用Geneious软件的默认参数将上述测序reads比对到本申请所述的DNA分子标记上；

5)根据测序reads在DNA分子标记上的覆盖情况判断所述样品是否含上饶大面白茶树；如能够完全覆盖所述分子标记，且可生成与DNA分子标记完全一致的一致性序列，即判断待测样品的物种包含是上饶大面白茶树；

在一个实施例中，步骤4)中将多个样品测序reads混合分组。

在一个实施例中，如果前述步骤4)中将多个样品测序reads混合分组，则进一步包含步骤6)将含有上饶大面白茶树的样品进一步分成两组，分别混合测序reads，重复上述5)，直至鉴定出单独的样品的上饶大面白茶树。

在一个实施例中，步骤2)中所述高通量测序为二代测序或三代测序。

在一个实施例中，步骤3)中使用Geneious、Bowtie、Tophat或HISAT任一款软件进行reads比对。

在一个实施例中，单独使用SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。

在一个实施例中，将SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2联合使用。

本发明的有益效果是：

第一，本发明第一次提供了两段上饶大面白茶树基因组AT富集片段。经分析该片段与现有任何其它茶树的基因组均不存在高度同源,适合作为上饶大面白茶树鉴定的参考序列。

第二，本发明可以对混合样品，例如直接采集绿色组织进行总DNA提取，通过高通量测序获得样品的DNA信息，并通过与参考序列比对鉴定样品是否含有上饶大面白茶树。

第三，直接通过高通量测序，无需引物设计，避免引物设计困难，操作方便，灵敏度高。

第四，本发明同时提供了2段特异性标记，可单独使用或联合使用，联合使用更加准确。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式，对本发明的进行详细说明。

图1是上饶大面白茶树的分子标记SEQ IN NO.1在NCBI的nr/nt库中的比对结果。

图2是上饶大面白茶树的分子标记SEQ IN NO.2在NCBI的nr/nt库中的比对结果。

图3是不同品种茶树测序组装组装序列与分子标记SEQ IN NO.1的比对结果。

图4是不同品种茶树测序组装组装序列与分子标记SEQ IN NO.2的比对结果。

图5是含上饶大面白茶树的样品的高通量测序reads比对到上饶大面白茶树的分子标记SEQ IN NO.1上的结果。

图6是含上饶大面白茶树的样品的高通量测序reads比对到上饶大面白茶树的分子标记SEQ IN NO.2上的结果。

图7是不含上饶大面白茶树的样品的高通量测序reads比对到上饶大面白茶树的分子标记SEQ INNO.1上的结果。

图8是不含上饶大面白茶树的样品的高通量测序reads比对到上饶大面白茶树的分子标记SEQ INNO.2上的结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。

实施例1上饶大面白茶树的分子标记

本发明通过测序组装和比较分析，确定了上饶大面白茶树分子标记标准检测序列，具体序列为

SEQ ID NO.1：

5’GGCCTGTCAATTCCTTCCCTTAGAACCGTACTTGAGAGTTTCCTACCTCATACGGCTCAGCCGTCAACTCTTTTGGTATCTCAT TTTAATCTACCATATTTTAATCTACCATATCTAATTGAATGAGCTTCCTCATAGATCTATTCCATTTTTTCGGGCTAACCAAAAGAGG-3’(SEQ ID NO:1)；

SEQ ID NO.2:

5’GTGAGTTATTTCAGCTCCACGCTTTCTTTCCTTTGAATAAAAATTCAATCAAGTAGAGTATTAAGTTTCATTATTTTATTTGTA ATTAGTTTATCGGAATCAAAGTCAAAATCAGAAGAATGGGGTTTTTTTTGGTGACATAAGATCTAATTGTAGAAAGAATCAAAAGTTGCGG ATAATTCTTTTTTTTTTTTTTACTAATATTTCTTTTTACTAATATTTCTTTTTACTAATATTTCTTTTTACTAATATTTCTTATTACTAATATTACTGATTAGTAATCCGGAAGCCTCT-3’(SEQ ID NO:2)；

实施例2上饶大面白茶树的分子标记与近缘物种序列比对

为了确定本发明所述分子标记具有物种特异性，将本发明所述分子标记提交到NCBI进行在线blast比对，选择nr/nt库，不限定物种，选择More dissimilar sequences参数。如图1和图2所示，发现本发明所述分子标记在NCBI的nr/nt库种近缘物种均为山茶属植物。图1显示SEQ ID NO.1一致性最高的为茶树(Camellia sinensis)，一致性为94.56％。图2显示SEQ ID NO.2一致性最高的为山茶属植物Camellia japonica，前20的同源序列均来自非茶树(Camellia sinensis)植物。表明本发明所述分子标记特异性极强。

实施例3上饶大面白茶树的鉴定方法一

1)采集待检测的茶树绿色组织作为待检测样品；

2)提取待检测样品的总DNA；

3)对上述样品的总DNA分别进行二代高通量测序，获得测序reads；

4)对测序数据进行组装，将组装的contigs与前述分子标记比对；

5)将能够完全覆盖分子标记且一致性最高的contigs与分子标记进行序列比对，根据比对结果判断所述样品是否为上饶大面白茶树；如能与所述分子标记序列一致，即判断待测样品的物种是上饶大面白茶树，反之则获得相反结果。

检测结果如图3和图4所示，图中茶树品种如下表：

由上表1和图3以及图4可以看出，样品2～4和1号的分子标记序列完全一致，其它品种则和分子标记序列不一致，表明本发明的方法可以准确鉴定出上饶大面白。

实施例4上饶大面白茶树的鉴定方法二

1)采集待检测茶树绿色组织作为待检测样品；

2)提取待检测样品的总DNA；

3)对上述样品的总DNA分别进行二代高通量测序，获得测序reads；

4)利用Geneious软件的默认参数将上述测序reads比对到本申请所述的DNA分子标记上；

5)根据测序reads在DNA分子标记上的覆盖情况判断所述样品是否含上饶大面白茶树；如能够完全覆盖所述分子标记，且可生成与DNA分子标记完全一致的一致性序列，即判断待测样品的物种包含是上饶大面白茶树；

6)如果前述步骤4)中将多个样品测序reads混合分组，则进一步包含步骤6)将含有上饶大面白茶树的样品进一步分成两组，分别混合测序reads，重复上述5)，直至鉴定出单独的样品的上饶大面白茶树。

检测结果如图5～图8所示，其中图5～图6为含上饶大面白茶树的样品，图中显示测序reads在参考序列(即本申请所述分子标记SEQ ID NO.1)上完全覆盖,且生成与分子标记序列完全一致的一致性序列。图7～图8为不含上饶大面白茶树的样品，参考序列上reads覆盖不完整，且无法生成与分子标记序列完全一致的一致性序列，表明本发明的方法可以准确鉴定出上饶大面白。

根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。