一种产碱杆菌及其用途

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体涉及一种产碱杆菌及其用途。

背景技术

木质素是由聚合的芳香醇构成的一类物质，存在于木质组织中，主要作用是通过形成交织网来硬化细胞壁，为次生壁主要成分。烟丝中木质素的平均含量约为8％，其分子聚合度较大，燃烧热裂解性能较差，热裂解后会产生苯酚、邻苯二酚、烷基儿茶酚等物质，这些酚类化合物不仅会造成涩口，而且对健康有害。而且，烟丝所含木质素燃烧时有木质气，且产生灼喉感，烟丝中木质素的聚合度及分子量是影响木质素高温条件下裂解的重要因素，会影响燃吸品质。烟丝中的果胶以α-1，4糖苷键聚合形成的聚半乳糖醛酸为基本结构，其含量的高低与烟丝品质密切相关，果胶含量过高，会使烟丝在燃吸时产生强烈的刺激感，严重制约卷烟制品整体品质的提高；同时，果胶在燃烧过程中会产生甲醇，甲醇进一步氧化成甲醛、甲酸等，对烟草吸食及安全性带来不利影响。

因此，为改善烟丝质量，提升卷烟原料品质，需要有效降解烟丝中的木质素、果胶等细胞壁物质，使其含量保持在合理范围。然而，本发明研究发现木质素、果胶等细胞壁物质结构性质较为稳定，在烟丝自然醇化过程中很难降解。

现有技术公开了一种烟秆表皮厌氧处理方法及其处理装置，其通过对烟秆表皮经微生物厌氧发酵处理降低木质素，但该方法处理时间长，且仅能降低烟丝中木质素含量，无法降低烟丝果胶含量。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中对烟丝中木质素的降低处理时间长，且无法降低烟丝中果胶含量的技术问题，从而提供一种产碱杆菌及其用途，能够降低烟丝中的果胶和木质素含量，提高烟丝的处理效率。

一方面，本发明提供一种粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)GXZY02，已保藏于中国典型培养物保藏管理中心，保藏地址为中国，武汉，武汉大学，邮编为430072，保藏日期为2023年7月20日，保藏编号为CCTCC No：M20231347。

另一方面，本发明提供一种生物制剂，所述生物制剂包括所述的粪产碱杆菌GXZY02。

所述生物制剂还包括所述粪产碱杆菌GXZY02的代谢酶产物。

一种生物制剂的制备方法，包括如下步骤，S1，将粪产碱杆菌GXZY02菌株活化，培养得到种子液；S2，将种子液进行选择培养，得到菌液；S3，将步骤S2中的菌液进行继续培养，离心。

步骤S1的活化步骤包括将粪产碱杆菌GXZY02接种于NA固体培养基上，在35～38℃条件下培养1～2d得到菌体。

所述步骤S1中培养的步骤包括，将活化后的菌体接种于NA液体培养基中，在25～40℃，100～200r/min振荡培养24～72h。

可选的，NA培养基的配方包括，牛肉浸膏3.0g/L、蛋白胨5.0g/L、葡萄糖2.5g/L、琼脂18.0g/L。

步骤S2中选择培养的步骤包括，取所述步骤S1制得的种子液，以接种量为1～5％接种于产漆酶选择性诱导培养基中，在30℃～38℃中，转速为160～200r/min振荡培养36～72h，其中，所述产漆酶选择性诱导培养基包含：蔗糖15.0g/L，蛋白胨10.0g/L，酵母粉5.0g/L，K

取所述步骤S1制得的种子液，以接种量为1～5％接种于产果胶酶选择性诱导培养基中，在30℃～38℃中，转速为200～240r/min振荡培养24～48h，其中，所述产果胶酶选择性诱导培养基包含：果胶5g/L，K

步骤S3中，继续培养的步骤包括，将所述步骤S2制得的菌液于35～38℃，160～190r/min下振荡培养35～40h。

离心转速为6000～10000r/min，离心8～12min。

本发明提供的粪产碱杆菌GXZY02、生物制剂以及生物制剂的制备方法得到的生物制剂在改善烟丝品质上的用途，具体为降解烟丝中的果胶和/或木质素。

所述改善烟丝品质的方法，包括如下步骤，将所述生物制剂与烟丝混合，密封，烘干。

所述生物制剂与烟丝的质量比为1:2～5；和/或，所述生物制剂中漆酶酶活为15.00～18.00U/mL；和/或，果胶酶的酶活为17.00～20.00U/mL；

可选的，密封温度35～38℃，湿度65～75％，时间65～78h；

可选的，烘干温度75～85℃，时间15～25min；

可选的，所述密封前，生物制剂与烟丝混合后的混合物含水率为20-30％。

所述产漆酶选择性诱导培养基包含：蔗糖15.0g/L，蛋白胨10.0g/L，酵母粉5.0g/L，K

所述产果胶酶选择性诱导培养基包含：果胶5g/L，K

本发明技术方案，具有如下优点：

1.本发明提供的粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)GXZY02，于2023年7月27日已保藏于中国典型培养物保藏管理中心，保藏编号为CCTCC No：M20231347，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072，所述粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)GXZY02能够经过诱导产生果胶酶和漆酶，与烟丝发酵后，能够降解烟丝中的木质素和果胶，提高烟丝品质。

2.本发明提供的生物制剂，包括粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)GXZY02及其代谢酶产物，烟丝在燃吸时，烟丝中的木质素含量过高产生木质气、烟丝中的果胶氧化为甲醛、甲酸和甲醇等影响烟草吸食的口感的安全性，本发明将能够降解烟丝中果胶和木质素的粪产碱杆菌GXZY02及其酶产物作为生物制剂，能够降解烟丝中的木质素和果胶，确保烟丝的口感和安全性。

3.本发明提供的生物制剂的制备方法，包括，将粪产碱杆菌GXZY02菌株活化，振荡培养得到种子液；将种子液选择培养得到菌液；将菌液继续培养，离心得到生物制剂。本发明生物制剂的制备方法简便，不需要额外增加酶制剂，利用粪产碱杆菌GXZY02及其代谢产物即可实现对木质素或果胶的降解。

4.本发明提供的粪产碱杆菌GXZY02、生物制剂和生物制剂制备方法制得的生物制剂可以应用于改善烟丝品质上，将所述粪产碱杆菌GXZY02的菌液或所述生物制剂与烟丝混合，密封，烘干，即可完成对烟丝品质的改善，本发明改善烟丝品质的方法简便高效，烟丝处理成本低，且处理周期较短、安全可靠，可选择性降低烟丝中的木质素、果胶等物质含量，并有效改善烟丝品质，在卷烟制造技术领域具有较好地推广应用价值。

生物保藏信息

本发明的粪产检杆菌(Alcaligenes faecalis)GXZY02，保藏于中国典型培养物保藏管理中心，保藏地址为中国湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学，邮编为430072，保藏日期为2023年7月20日，保藏编号为CCTCC No：M 20231347。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明粪产碱杆菌GXZY02电镜图；

图2是本发明粪产碱杆菌GXZY02系统发育树；

图3为本发明实施例1不同继续培养条件对产漆酶酶活性方差变量分析；

图4为本发明实施例2不同继续培养条件对产果胶酶活性方差变量分析。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

本发明研究发现，木质素、果胶等细胞壁物质结构性质较为稳定，在烟丝自然醇化过程中很难降解，研究和开发新的烟丝细胞壁物质降解技术，对提高卷烟品质，具有重要意义。

本发明从烤烟品种C3F烟叶中分离得到的一种粪产碱杆菌(Alcaligenesfaecalis)GXZY02，通过选择性培养基诱导培养，可选择性分泌漆酶或者果胶酶，其酶制剂可选择性的降解烟丝中的木质素和/或果胶，能够有效改善烟丝的品质。

本发明实施例中粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)GXZY02从云南大理的C3F烤烟的烟叶中分离得到，其电镜图参阅图1，可知，粪产碱杆菌GXZY02细菌为杆状，大小为(6～9)×(22～26)μm。

采用16S rDNA基因片段为通用引物，对采集到的粪产碱杆菌GXZY02进行PCR和测序，得到1416bp序列，进行系统进化分析，参见图2，显示菌株GXZY02与粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)的同源性高达100％，鉴定GXZY02为产碱杆菌属(Alcaligenes)，粪产检杆菌(Alcaligenes faecalis)，保藏于中国典型培养物保藏管理中心，保藏编号为CCTCC No：M 20231347。

本发明实施例中NA培养基的配方为，牛肉浸膏3.0g/L、蛋白胨5.0g/L、葡萄糖2.5g/L、琼脂18.0g/L。

本发明应用例中的烟丝品种为中烟100，取中部叶(C3F)为应用材料。

实施例1

本实施例提供一种生物制剂的制备方法，具体步骤和方法如下：

1.菌种活化：将保存的粪产碱杆菌GXZY02菌株采用点种法接种于NA固体培养基上，于37℃条件下培养1.5d；

2.种子液制备：刮取步骤1中所培养的菌体，接种于NA液体培养基中，在37℃，120r/min的摇床中振荡培养48h，即得到粪产碱杆菌GXZY02种子液；

3.选择培养：产漆酶的选择性诱导，将步骤2中粪产碱杆菌GXZY02种子液按照接种量3％(v/v)接种于产漆酶选择性诱导液体培养基中(培养基组成：蔗糖15.0g/L，蛋白胨10.0g/L，酵母粉5.0g/L，K

4、生物制剂的制备：将选择培养得到的菌液在温度为35℃，转速为185r/min的摇床中培养36h得到菌株生长浑浊液，在4℃、8000r/min条件下离心10min得到上清液，即得生物制剂。

对制得的生物制剂进行检测，测得漆酶酶活是17.74U/mL。

实施例2

本实施例提供一种生物制剂的制备方法，具体步骤和方法如下：

1.菌种活化：将保存的粪产碱杆菌GXZY02菌株采用点种法接种于NA固体培养基上，于37℃条件下培养1.5d；

2.种子液制备：刮取步骤1中所培养的菌体，接种于NA液体培养基中，在37℃，120r/min的摇床中振荡培养48h，即得到粪产碱杆菌GXZY02种子液；

3.选择培养：产果胶酶的选择性诱导，将步骤2中粪产碱杆菌GXZY02种子液按照接种量3％(v/v)接种于产果胶酶选择性诱导液体培养基中(培养基组成：果胶5g/L，K

4、生物制剂的制备：将选择培养得到的菌液在温度35℃，转速为185r/min的摇床中培养36h得到菌株生长浑浊液，在4℃、8000r/min离心10min得到上清液，即得生物制剂。

对制得的生物制剂进行检测，测得果胶酶酶活是19.37U/mL。

实施例3

本实施例提供一种生物制剂的制备方法，具体步骤和方法如下：

1.菌种活化：将保存的粪产碱杆菌GXZY02菌株采用点种法接种于NA固体培养基上，于35℃条件下培养1d；

2.种子液制备：刮取步骤1中所培养的菌体，接种于NA液体培养基中，在25℃，200r/min的摇床中振荡培养72h，即得到粪产碱杆菌GXZY02种子液；

3.选择培养：产漆酶的选择性诱导，将步骤2中粪产碱杆菌GXZY02种子液按照接种量1％(v/v)接种于产漆酶选择性诱导液体培养基中(培养基组成：蔗糖15.0g/L，蛋白胨10.0g/L，酵母粉5.0g/L，K

4、生物制剂的制备：将选择培养得到的菌液在温度38℃，转速为160r/min的摇床中培养38h得到菌株生长浑浊液，在4℃、6000r/min条件下离心12min得到上清液，即得生物制剂。

对制得的生物制剂进行检测，测得产漆酶酶活是15.21U/mL。

实施例4

本实施例提供一种生物制剂的制备方法，具体步骤和方法如下：

1.菌种活化：将保存的粪产碱杆菌GXZY02菌株采用点种法接种于NA固体培养基上，于38℃条件下培养2d；

2.种子液制备：刮取步骤1中所培养的菌体，接种于NA液体培养基中，在40℃，100r/min的摇床中振荡培养24h，即得到粪产碱杆菌GXZY02种子液；

3.选择培养：产果胶酶的选择性诱导，将步骤2中粪产碱杆菌GXZY02种子液按照接种量1％(v/v)接种于产果胶酶选择性诱导液体培养基中(培养基组成：果胶5g/L，K

4、生物制剂的制备：将选择培养得到的菌液在温度37℃，转速为190r/min的摇床中培养40h得到菌株生长浑浊液，在4℃、10000r/min条件下离心8min得到上清液，即得生物制剂。

对制得的生物制剂进行检测，测得果胶酶酶活是17.08U/mL。

实施例5

本实施例提供一种生物制剂的制备方法，具体步骤和方法如下：

1.菌种活化：将保存的粪产碱杆菌GXZY02菌株采用点种法接种于NA固体培养基上，于35℃条件下培养1d；

2.种子液制备：刮取步骤1中所培养的菌体，接种于NA液体培养基中，在30℃，150r/min的摇床中振荡培养56h，即得到粪产碱杆菌GXZY02种子液；

3.选择培养：产漆酶的选择性诱导，将步骤2中粪产碱杆菌GXZY02种子液按照接种量5％(v/v)接种于产漆酶选择性诱导液体培养基中(培养基组成：蔗糖15.0g/L，蛋白胨10.0g/L，酵母粉5.0g/L，K

4、生物制剂的制备：将选择培养得到的菌液在温度38℃，转速为160r/min的摇床中培养38h得到菌株生长浑浊液，在4℃、8000r/min条件下离心10min得到上清液，即得生物制剂。

对制得的生物制剂进行检测，测得产漆酶酶活是16.55U/mL。

实施例6

本实施例提供一种生物制剂的制备方法，具体步骤和方法如下：

1.菌种活化：将保存的粪产碱杆菌GXZY02菌株采用点种法接种于NA固体培养基上，于37℃条件下培养2d；

2.种子液制备：刮取步骤1中所培养的菌体，接种于NA液体培养基中，在37℃，100r/min的摇床中振荡培养24h，即得到粪产碱杆菌GXZY02种子液；

3.选择培养：产果胶酶的选择性诱导，将步骤2中粪产碱杆菌GXZY02种子液按照接种量5％(v/v)接种于产果胶酶选择性诱导液体培养基中(培养基组成：果胶5g/L，K

4、生物制剂的制备：将选择培养得到的菌液在温度为37℃，转速为190r/min的摇床中培养40h得到菌株生长浑浊液，在4℃、8000r/min条件下离心10min得到上清液，即得生物制剂。

对制得的生物制剂进行检测，测得果胶酶酶活是18.56U/mL。

应用例1

本应用例提供生物制剂在改善烟丝品质的用途，具体步骤和方法如下：

将实施例1制备的生物制剂与烟丝按照1：3的质量比，将生物制剂以喷雾的方式均匀的添加到烟丝中，将烟丝的水分调节至25％，用密封袋密封，在温度35℃、湿度70％的条件下放置72h，形成生物制剂处理后的烟丝。将生物制剂处理后的烟丝在80℃条件下烘干15min，以使生物制剂灭活。

应用例2

本应用例提供生物制剂在改善烟丝品质的用途，具体步骤和方法与应用例1相同，不同之处在于生物制剂为本发明实施例2制得的生物制剂。

应用例3

本应用例提供生物制剂在改善烟丝品质的用途，具体步骤和方法如下：

将实施例1制备的生物制剂和实施例2制备的生物制剂按照1:1.2的质量比进行混合，得到复合生物制剂，将复合生物制剂与烟丝按照1：3的质量比，将复合生物制剂以喷雾的方式均匀的添加到烟丝中，将烟丝的水分调节至25％，用密封袋密封，在温度35℃、湿度70％的条件下放置72h，形成生物制剂处理后的烟丝。将生物制剂处理后的烟丝在80℃条件下烘干15min，以使生物制剂灭活。

应用例4

本应用例提供生物制剂在改善烟丝品质的用途，具体步骤和方法与应用例1相同，不同之处在于密封温度为38℃，湿度65％，时间65h，烘干温度为75℃，烘干时间25min，生物制剂添加后的烟丝含水率为20％。

应用例5

本应用例提供生物制剂在改善烟丝品质的用途，具体步骤和方法与应用例2相同，不同之处在于密封温度为35℃，湿度75％，时间78h，烘干温度为85℃，烘干时间15min，生物制剂添加后的烟丝含水率为30％。

应用例6

本应用例提供生物制剂在改善烟丝品质的用途，具体步骤和方法与应用例1相同，不同之处在于，生物制剂与烟丝的质量比为1:2。

应用例7

本应用例提供生物制剂在改善烟丝品质的用途，具体步骤和方法与应用例1相同，不同之处在于，生物制剂与烟丝的质量比为1:5。

对比例1

本对比例提供生物制剂在改善烟丝品质的用途，具体步骤和方法与应用例1相同，不同之处在于本对比例将等质量无菌水替代生物制剂。

实验例1

对应用例1-3处理后的烟丝、对比例用无菌水处理后的烟丝以及未经任何处理的烟丝的木质素、果胶含量和降解率进行检测，同时对烟丝感官质量进行质量评价，其中，烟丝木质素和果胶含量检测方法采用YC/T 347-2010标准测定，烟丝感官质量评价采用YC/T138-1998标准测定，烟丝木质素和果胶含量结果见表1，烟丝感官质量评价结果见表2。

表1烟丝的木质素和果胶降解率结果

由表1可知，等量无菌水处理的烟丝木质素降解率较未处理的烟丝降低了3.71％，产漆酶的生物制剂处理的烟丝木质素降解率较未处理的烟丝降低了41.03％，说明通过本发明制得的粪产碱杆菌GXZY02得到的能够产生漆酶的生物制剂可以有效降低烟丝中木质素的含量；等量无菌水处理的烟丝果胶降解率较未处理的烟丝降低了7.26％，果胶酶的生物制剂处理的烟丝果胶降解率较未处理的烟丝降低了45.6％，说明通过本发明制得的粪产碱杆菌GXZY02得到的能够产生果胶酶的生物制剂可以有效降低烟丝中果胶的含量。复合生物制剂处理的烟丝木质素降解率较未处理的烟丝降低了47.43％，复合生物制剂处理的烟丝果胶降解率较未处理的烟丝降低了38.71％，说明通过本发明制得的粪产碱杆菌GXZY02得到的能够产生复合生物制剂可以同时有效降低烟丝中木质素和果胶的含量。

表2烟丝的感官评价得分表

由表2可知，应用例1处理的烟丝香气质、香气量、杂气、刺激性、余味、浓度得分高于对比例采用等量无菌水处理的烟丝和未处理的烟丝，由此说明粪产碱杆菌GXZY02所产漆酶可提高烟丝香气质、香气量，降低烟丝杂气、刺激性，优化余味。应用例2处理烟丝的香气质、香气量、杂气、刺激性、余味、浓度得分高于未处理的烟丝和采用等量无菌水处理的烟丝，由此说明粪产碱杆菌GXZY02所产果胶酶可提高烟丝香气质、香气量，降低烟丝杂气、刺激性，优化余味。应用例3处理的烟丝香气质、香气量、杂气、刺激性、余味、浓度得分高于对比例采用等量无菌水处理的烟丝和未处理的烟丝，由此说明粪产碱杆菌GXZY02所产漆酶和果胶酶可同时使用，一定程度的提高烟丝香气质、香气量，降低烟丝杂气、刺激性，优化余味提高烟气浓度和柔细度。应用例1、应用例2和应用例3处理的烟丝总分高于采用等量无菌水处理的烟丝，即对比例和未经任何处理的烟丝，由此可知经过本发明制得的粪产碱杆菌GXZY02得到的生物制剂发酵处理后的烟丝整体感观质量得到提升。

实验例2

对实施例1和2得到的种子液分别在培养温度为30℃、32℃、34℃、36℃、培养时间12h，24h，36h，48h和转速160r/min、180r/min、200r/min、220r/min条件下继续培养进行多因素多梯度组合实验，结果见图3和图4，可知，粪产碱杆菌GXZY02可以在不同的培养条件下，均能够保持较好的产酶活性。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。