充分自裂解重组C1s蛋白的表达质粒组合、表达宿主细胞及表达方法

技术领域

本发明涉及一种充分自裂解重组C1s蛋白的表达质粒组合、表达宿主细胞及表达方法，属于蛋白表达技术领域。

背景技术

重组蛋白表达技术是指将编码目标蛋白的外源基因通过分子克隆的方法插入表达载体，随后使用表达载体侵染宿主细胞，通过宿主细胞自身的转录和翻译机制进行蛋白表达生产，再通过分离纯化获得目标蛋白的方法，至今已有50多年的历史。常用的表达用的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞等。

C1s蛋白由两个亚基组成，其中其B亚基是一种丝氨酸蛋白酶。C1s蛋白是补体系统中蛋白级联的体系的重要组成元件之一，与C1q和C1r一起组成C1补体系统，是机体免疫机制的重要组成部分。C1r蛋白激活C1s蛋白，释放其蛋白酶活性，随即C1s蛋白进一步激活补体系统中的C2和C4蛋白，完成补体系统的级联反应。C1s蛋白是重要的药物靶点之一，其缺失会导致诸多免疫相关疾病，包括Ehlers-Danlos综合症，桥本氏甲状腺炎，肝炎等。因此，C1s蛋白具有重要的研究价值。科研用C1s蛋白通常通过重组蛋白表达技术制备，使用的主要宿主是哺乳动物细胞。常见哺乳动物细胞表达体系(比如HEK293)宿主细胞含有一定的本底蛋白酶，可以部分裂解激活C1s蛋白，然而由于宿主细胞本底蛋白酶特异型较差，故表达的C1s蛋白通常无法被完全裂解激活，且批次间蛋白激活的比例差异性较大，因此无法制备具有生物学意义的完全激活的C1s蛋白。当前制备得到完全激活的具有充分生物学意义的C1s蛋白需要使用特殊的细胞系，比如小鼠骨髓瘤细胞系NS0，为一般实验室获得研究用C1s蛋白带来了巨大的挑战。

发明内容

本发明的目的是提供一种充分自裂解重组C1s蛋白的表达质粒组合，能直接培养获得激活C1s蛋白。

本发明采用的技术方案为：

一种充分自裂解重组C1s蛋白的表达质粒组合，其中质粒一中含有C1s蛋白的表达基因，质粒二中含有C1r蛋白的表达基因，其中C1s蛋白的表达基因编码的C1s蛋白C末端携带纯化标签，其中C1r蛋白的表达基因编码的C1r蛋白不引入纯化标签。

优选的，所述纯化标签为His标签。

优选的，其中C1s蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，C1r蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.4所示。

本发明还公开了一种充分自裂解重组C1s蛋白的表达宿主细胞，系转染有上述两个表达质粒的哺乳动物细胞系。

优选的，所述哺乳动物细胞系为HEK293细胞。

本发明还公开了一种充分自裂解重组C1s蛋白的表达方法，其步骤包括：

(1)构建重组蛋白表达质粒：构建权利要求1-3中任一项所述的表达质粒组合；

(2)将构建好的两个重组蛋白表达质粒转染到哺乳动物细胞系中，培养转染后的哺乳动物细胞系；

(3)收集培养液上清，过镍离子亲和层析柱，然后洗脱，收集含有目标蛋白的洗脱峰，获得C1s蛋白。

优选的，所述哺乳动物细胞系为HEK293细胞。

优选的，洗脱液为20mMTris,pH7.4，150mMNaCl，1M咪唑。

优选的，步骤(2)具体为：用无血清CD培养基传代培养HEK293细胞，调节细胞密度至0.5～1X10

优选的，培养至少7天后，收集培养液上清，过滤后加样至镍离子亲和层析柱，随后使用含10mM咪唑的Tris缓冲液进行平衡，平衡完成后使用线性咪唑浓度梯度洗脱，收集含有目标蛋白的洗脱峰；含10mM咪唑的Tris缓冲液为20mMTris,pH7.4，150mMNaCl，10mM咪唑；洗脱缓冲液为20mMTris,pH7.4，150mMNaCl，1M咪唑。

本发明借用C1s蛋白的级联机制，通过在表达C1s蛋白的同时共转表达其上游C1r蛋白，从而在宿主细胞中引入特异型激活C1s蛋白的机制，获得充分自裂解的重组C1s蛋白。使用该方法可以通过利用实验室常用哺乳动物细胞表达体系(比如HEK293)制备获得充分裂解的C1s蛋白。

附图说明

图1：C1s蛋白酶活性计算公式。

图2：原始工艺，单转C1s表达质粒，纯化后蛋白裂解激活情况。左：SDS-PAGE和WB检测重组C1s蛋白的激活。C1s蛋白激活后会断裂成AB两个亚基，通过链间二硫键相连，因此未完全裂解的C1s蛋白在非还原PAGE上呈现一条条带，而在还原PAGE上呈现三条条带。右：C1s蛋白激活程度和丝氨酸水解酶活性的关系。图中R＝还原SDS-PAGE电泳，NR＝非还原SDS-PAGE电泳，WB系采用抗-C1s的抗体做的westernblot还原SDS-PAGE凝胶电泳图片。

图3：共转C1s表达质粒和C1r辅助质粒，纯化后蛋白裂解激活情况。左：SDS-PAGE检测重组C1s蛋白的激活。右：充分激活的C1s蛋白丝氨酸水解酶活性。图中R＝还原SDS-PAGE电泳，NR＝非还原SDS-PAGE电泳。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但实施例的描述不对本发明的保护范围产生任何限制。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同，本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

下列实施例中所用的物质或仪器，如果未进行特殊说明的话，均可以从常规的商用渠道获取。

实施例1

重组蛋白表达质粒的构建：使用重组DNA技术分别将C1s和C1r蛋白的基因分别整合到哺乳动物细胞表达载体中，后通过测序的方法验证插入基因的序列正确性。编码C1s和C1r蛋白的cDNA序列通过全基因合成方法制备得到，并通过XbaI和BshTI酶切位点分别构建至pCDNA3.4表达载体(pCDNA3.4表达载体的图谱参考https://www.snapgene.com/resources/plasmid-files/？set＝ta_and_gc_cloning_vectors&plasmid＝pcD NA3.4-TOPO_(linearized))上。C1s蛋白的C末端携带纯化标签，而C1r蛋白构建中不引入纯化标签，以便于后期使用亲和层析的方法纯化C1s蛋白。编码C1s蛋白的cDNA序列见SEQ1，翻译后得到的氨基酸序列见SEQ2；编码C1r蛋白的cDNA序列见SEQ3，翻译后得到的氨基酸序列见SEQ4。

重组蛋白表达：用无血清CD培养基(义翘神州，货号SMM293-TI)传代培养HEK293细胞,调节细胞密度至0.5～1X106时将C1s蛋白表达质粒和C1r蛋白表达质粒以质量比1：1混合后，与转染试剂TF1(义翘神州，货号STF02)混合，随后加入细胞中进行转染。转染后第1,3,5天添加293无血清加料液(义翘神州，货号M293-SUPI-100)。细胞培养7天后进行蛋白纯化。

重组C1s蛋白纯化：培养7天后收集培养液上清，过滤后加样至镍离子亲和层析柱，随后使用含10mM咪唑的Tris缓冲液(20mMTris,pH7.4，150mMNaCl，10mM咪唑)进行平衡。平衡完成后使用线性咪唑浓度梯度洗脱，收集含有目标蛋白的洗脱峰。洗脱缓冲液为20mMTris,pH7.4，150mM NaCl，1M咪唑。使用还原和非还原SDS-PAGE对纯化得到的C1s蛋白的纯度和裂解激活程度进行表征。结果如图3所示。

重组C1s蛋白酶活性检测：

试剂和材料：

测试缓冲液＝50mM Tris,250mM NaCl,pH8.0

测试底物＝N苄氧基赖氨酸硫代苄酯(Z-K-SBzl，Bachem货号M-1300)，溶解于DMSO后配置成10mM母液

DTNB＝5,5’二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB，Sigma货号D-8130)，溶解于DMSO后配置成10mM母液

材料＝96孔板(Costar货号92592)，读板器(SpectraMax Plus，MolecularDevices)

测试方法：

1.将重组C1s用测试缓冲液稀释至0.2ng/μL

2.将测试底物用测试缓冲液和DTNB母液配置成含有200μM测试底物和200μM的DTNB的工作溶液

3.在96孔板的样品孔中加入50μL的0.2ng/μL重组C1s蛋白，并加入50μL的200μM底物工作溶液，底物工作溶液加入时间点为反应开始时间。在孔板的另一个样品中添加50μL的200μM底物工作溶液和50μL的测试缓冲液，作为对照。

4.底物加入后反应5分钟，使用读板器的动力学模式在405nm吸光度值下持续读取荧光信号变化。

5.酶比活计算：公式见图1，结果见图2和图3。

对比例1

采用和实施例1相同的工艺，将表达C1s蛋白的重组蛋白表达质单独转染到HEK293细胞中并进行C1s蛋白的表达和纯化，编码C1s蛋白的cDNA序列见SEQ ID No.1，翻译后得到的氨基酸序列见SEQ ID No.2。结果如图2所示。

可以看出，在HEK293细胞中单独表达C1s，蛋白在宿主蛋白酶的作用下有一定程度的裂解，然而无法实现蛋白的完全裂解激活(图2，左侧)。C1s的蛋白酶活性随着蛋白裂解激活比例的增加而增加(图2，右侧)，批次1～3系使用同样的工艺分别进行了三次C1s蛋白的表达，可见三个批次之间C1s蛋白的表达存在明显的差异，这是由宿主细胞对表达的C1s蛋白出现了不完整的后处理而造成的。故原始工艺对C1s蛋白的后处理不完全，且重现性较差。

使用C1s和C1r共转的生产方法获得完全裂解激活的C1s蛋白(图3，左侧)，其蛋白酶活性也较使用原始工艺生产得到的部分裂解激活的C1s蛋白有大幅度提升(图3，右侧)。且本方法重现性强，使用相同方法重复生产两次均获得完全裂解激活的且酶催化活性相当的C1s蛋白，且两批酶活相差较小，工艺稳定(图3，右侧)。其中，图3中的原工艺即为对比例1的工艺。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。