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一种经过突变改造的高性能腺苷蛋氨酸合成酶及其应用

文献发布时间：2024-04-18 20:02:18

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种经突变改造的用于固定化使用的高性能腺苷蛋氨酸合成酶。经改造后的腺苷蛋氨酸合成酶在配合氨基型酶载体固定化使用时具有更高的酶活保留、更好的底物转化率以及更长的使用寿命，且重组酶于大肠杆菌工程菌中的表达量可达30％以上。

背景技术

S-腺苷-L-蛋氨酸(英文名S-adenosyl-L-methionine，简称腺苷蛋氨酸、SAM)是一种肝胆疾病常用药物的活性成分。它作为生物体最为重要的甲基供体具有转甲基作用，也具有转硫基、转丙胺基等作用，广泛分布于人体内各种组织和细胞中。在人体内能够发挥解毒、抗氧化作用，减少肝细胞的损伤；能够使质膜磷脂甲基化而调节肝脏细胞膜的流动性；只要肝内腺苷蛋氨酸的生物利用度在正常范围内，这些反应便有助于防止肝内胆汁淤积。其临床应用广泛，多应用于肝硬化前和肝硬化所致肝内胆汁淤积；妊娠期肝内胆汁淤积；抗脂肪肝等。另据国外报道，丁二磺酸腺苷蛋氨酸在治疗急慢性肝炎和妊娠黄疸方面均有明显疗效。国内报道该药品用于黄疸性肝炎的治疗时，其退黄作用显著。

S-腺苷-L-蛋氨酸的化学名称为5`-[[(3S)-3-氨基-3-羧基-丙基]甲基-(S)-砜]-5`-脱氧腺苷，其分子结构式参见附图1。SAM是一种双手性物质，(R,S)-SAM与(S,S)-SAM两种异构体，其中只有后者才具有生物活性。S-腺苷-L-蛋氨酸的制备方法主要有三种：(1)天然酵母菌(或经育种的筛选菌株)发酵后提取SAM；(2)利用重组腺苷蛋氨酸合成酶进行酶促催化生成SAM；(3)采用S-腺苷同型半胱氨酸与甲基供体进行化学合成SAM。其中，化学合成技术应用于工业化生产的难度很高，目前尚未见应用于腺苷蛋氨酸工业化生产的成功案例。天然菌发酵提取与体外酶促合成法则均已应用于工业化生产。

体外酶促合成法系利用基因工程技术，于细菌或酵母菌中超量表达重组腺苷蛋氨酸合成酶(简称SAM合成酶)。再将SAM合成酶提取并进行纯化后，作用于ATP、蛋氨酸、镁盐、钾盐等组成的底物液，在适宜的温度及pH值下消耗ATP使蛋氨酸腺苷化，酶促生成S-腺苷-L-蛋氨酸。该工艺的关键在于重组SAM合成酶的表达量与使用效率。酶活保留率、底物转化率、使用周期、重复使用次数等都是反映酶使用效率的指标。引入固定化酶技术能够大幅提高SAM合成酶的使用效率。固定化酶的技术及基质多种多样，其中氨基型载体是比较适用于SAM合成酶固定化的，例如专利CN 101985616所述。

氨基型载体以丙烯酸共聚物等材料为骨架结构，以氨基为官能团，其典型的伯氨基载体结构如附图2所示。该类酶载体在联酶使用前，一般首先于适宜条件下以稀的戊二醛溶液进行活化处理，戊二醛的一端醛基与载体官能团缩合连接，经活化后另一端暴露的醛基与酶分子中的碱性氨基酸残基侧链(如赖氨酸、精氨酸)及末端氨基缩合交联，进而实现酶分子的固定化。固定化酶是一项复杂的多因素交互影响的技术，成功的开发以及使用效率的提升难度很高。虽然固定化酶技术发展至今已具备了丰富的理论基础与技术手段。但由于各类酶的分子构象、性质与应用的多样性，使在载体与酶之间很难建立一个通用性固定化原则及方法，问题的复杂性依然存在。对于戊二醛活化的氨基型酶载体而言，酶分子的活性区域或其附近的碱性氨基酸残基侧链与载体连接，酶活性中心会被遮蔽进而造成固定化后酶活力的丧失；酶分子上一些不在酶活性中心的结构域，与载体发生交联也可能会导致酶活保留率的下降，比如一些位点的交联会阻碍酶分子高级结构的形成，进而导致酶活性的降低，因此酶取向的可控制性对于酶活保留率非常重要。酶分子与载体的成键数量过多、过高的结合点密度会使酶分子的空间结构柔性降低，导致酶活力降低；酶分子与载体官能团成键数量过少则会使酶分子更易脱落，造成使用寿命与次数的下降。

对于大多数天然酶分子而言，碱性氨基酸残基是无规律散布在其氨基酸全序列上的。如大肠杆菌源腺苷蛋氨酸合成酶由384个氨基酸残基组成，其N端第3位、18位、37位、47位、99位、154位、166位、177位、197位、209位、222位、246位、266位、270位、284位、320位、353位、370位、373位、384位，均为赖氨酸残基。在进行固定化处理时，这些赖氨酸残基侧链只要是暴露于酶分子表面的均有一定几率与酶载体上的醛基发生交联。“Takusagawa F,Kamitori S,Misaki S,et al.Crystal structure of S-adenosylmethioninesynthetase.[J].Journal of Biological Chemistry,1996,271(1):136-47.”、“Taylor JC,Markham GD.Conformational dynamics of the active site loop of S-adenosylmethionine synthetase illuminated by site-directed spin labeling[J].Archives of Biochemistry and Biophysics,2003,415(2):164-171.”等文献对大肠杆菌腺苷蛋氨酸合成酶的三维构象、活性区域进行了研究与报导。揭示了大肠杆菌源metK基因编码的腺苷蛋氨酸合成酶由分子量为43KD的四个相同亚基组成，单亚基含有384个氨基酸残基。单体亚基结合为四聚体的高级结构后，才能够发挥生物活性。而在形成的四聚体高级结构中，两个同源亚基通过Glu42、Thr242、Arg244参与形成的盐桥组成紧密的二聚体，二聚体中亚基的紧密结合面为该酶的活性提供了刚性构架，使两个亚基之间形成活性位点，是酶活产生的关键。另外，B4 b-strand上的Ser93也在二聚体的形成上发挥了作用。两组二聚体再以相对较弱的结合形成四聚体，在二聚体结合为四聚体的时，Ser80与Cys89被认为发挥着关键作用。在腺苷蛋氨酸合成酶的四聚体活性结构中的每个亚基包含9个α-螺旋、11个β-折叠股、5个310螺旋，形成三个结构域，分别为1～12位与129～233位残基组成的N端区，13～101位与234～268位残基组成的中心区，以及108～128位与234～383位残基组成的C端区，参见附图3与图4。His14、Lys165、Lys245、Lys265、Glu8、Glu42、Asp16、Asp118、Cys239、Asp271等氨基酸残基被认为是参与生物活性的关键位点，这些位点与酶促时协同作用的Mg2+等二价金属离子、K+等单价金属离子、磷酸根离子以及反应底物的结合有关。

利用固定化酶技术，开发适宜的工艺进行腺苷蛋氨酸的酶促制备，能够大幅提升重组腺苷蛋氨酸合成酶的利用效率，降低生产成本。在此基础上，进一步提升固定化腺苷蛋氨酸合成酶的酶活保留率、催化效率、连接稳定性、使用寿命等性能指标，能够进一步降低腺苷蛋氨酸的生产成本，具有显著的实用性与经济价值，也具有更高的开发难度，需要攻克诸多技术难题。

与载体官能团成键密度过高，会使酶分子的柔性降低；与载体连接时的方向性不佳，酶活中心被遮蔽，这些原因均会造成固定化后一部分酶分子活性的丧失或减弱。酶活保留率这一指标即是反映经固定化处理后，酶活性损失的整体情况。催化效率用来表示固定化酶对反应底物的利用效率也即转化率，直接关乎到酶促合成的生产成本。连接稳定性是指酶分子与载体连接的牢固程度，用来反映固定化酶在使用过程中的脱落情况，是影响固定化酶使用寿命的重要因素。重组酶的表达量，则是指经工程菌的发酵及诱导表达后，能够获得的重组酶占全部菌体蛋白的百分比。这些主要技术指标之间存在一定的互斥性，想要同时实现这些主要指标的提升，以进一步提升腺苷蛋氨酸固定化酶的使用性能，进一步大幅降低腺苷蛋氨酸的生产成本，具备较高的技术难度。针对氨基型固定化酶载体，顾及均衡性的腺苷蛋氨酸合成酶的基因工程改造，是一个有可能实现上述性能突破的技术途径，而基于理性设计的腺苷蛋氨酸合成酶的分子改造研究也尚未见有报道。

发明内容

本发明针对氨基型固定化酶载体以及MetK基因编码的大肠杆菌腺苷蛋氨酸合成酶的结构特征，通过理性设计、定向改造与大量实验筛选工作，提供了一种经突变改造的腺苷蛋氨酸合成酶。相较原始酶，该突变后的腺苷蛋氨酸合成酶，在配合氨基酶载体固定化使用时具有更高的酶活性保留、更好的催化效率与稳定性，具有更长的使用寿命，性能更优。并且不对其重组表达量带来负面影响，在大肠杆菌工程菌中目的蛋白的表达量达到了30％以上的水平。

本发明旨在通过突变改造，增加酶分子与经戊二醛活化的氨基型载体结合的定向性，提高固定化连接后的酶活保留；增加重组腺苷蛋氨酸合成酶与载体的连接强度，使其在使用及存放过程中不易脱落，进而增加固定化酶的使用寿命；保证连接位点及数量的合理性，使酶分子的空间柔性不受影响，保证催化效率。通过对原始腺苷蛋氨酸合成酶的构象与序列解析，针对性设计以及多轮次的实验筛选，本发明突变位点的选择避开了腺苷蛋氨酸合成酶活性相关区域以及亚基结合相关区域所在的N端序列及中心序列。增加C端非活性区域的Lys残基丰度，增大该局部区域与酶载体的连接概率，酶活中心及其附近序列上的Lys残基与载体的结合概率也会随之减低，进而增加固定化时酶分子的定向性，提高固定化后的酶活保留。在C端区域中，突变操作倾向于末端序列，以使固定化后酶分子的空间柔性受到的影响较小。突变位点的设计与考察主要集中于氨基酸侧链多分布于螺旋外侧且柔性更好的310螺旋结构以及多位于蛋白分子表面的环区，以提高突变的Lys残基侧链的暴露性，使更易于与戊二醛活化后的氨基酶载体成键结合，以实现本发明的优化改造之意图。另外，突变改造时参考众多文献中报道的蛋白质工程化改造时突变Lys的实例经验，尽可能使突变改造不对重组酶的表达效率造成负面影响。综上，在酶活保留、固定化稳定性、催化效率、重组蛋白表达量等因素之间寻求最优平衡点，以确认改造突变位点的位置与数量，最终通过实验筛选获得最优改造方案。

具体地说，本发明提供了一种工程化突变改造的腺苷蛋氨酸合成酶。其氨基酸序列由序列为SEQ ID NO.1的大肠杆菌腺苷蛋氨酸合成酶改造而来，其改造方法为将第305位氨基酸V、第325位氨基酸Q、第343位氨基酸Q、第347位氨基酸L、第360位氨基酸H中的一个或多个突变改造为氨基酸K。

优选地，改造的腺苷蛋氨酸合成酶将SEQ ID NO.1氨基酸序列中的第305位氨基酸V、第325位氨基酸Q、第343位氨基酸Q、第347位氨基酸L、第360位氨基酸H中的3～4个突变改造为氨基酸K。

例如，一种突变改造的腺苷蛋氨酸合成酶，其序列为：

MAKHLFTSESVSEGHPDKIADQISDAVLDAILEQDPKARVACETYVKTGMVLVGGEITTSAWVDIEEITRNTVREIGYVHSDMGFDANSCAVLSAIGKQSPDINQGVDRADPLEQGAGDQGLMFGYATNETDVLMPAPITYAHRLVQRQAEVRKNGTLPWLRPDAKSQVTFQYDDGKIVGIDAVVLSTQHSEEIDQKSLQEAVMEEIIKPILPAEWLTSATKFFINPTGRFVIGGPMGDCGLTGRKIIVDTYGGMARHGGGAFSGKDPSKVDRSAAYAARYVAKNIVAAGLADRCEIQVSYAIGKAEPTSIMVETFGTEKVPSEKLTLLVREFFDLRPYGLIQMLDKLHPIYKETAAYGKFGREHFPWEKTDKAQLLRDAAGLK(SEQ ID NO.2)

一种突变改造的腺苷蛋氨酸合成酶，其序列也可以为：

MAKHLFTSESVSEGHPDKIADQISDAVLDAILEQDPKARVACETYVKTGMVLVGGEITTSAWVDIEEITRNTVREIGYVHSDMGFDANSCAVLSAIGKQSPDINQGVDRADPLEQGAGDQGLMFGYATNETDVLMPAPITYAHRLVQRQAEVRKNGTLPWLRPDAKSQVTFQYDDGKIVGIDAVVLSTQHSEEIDQKSLQEAVMEEIIKPILPAEWLTSATKFFINPTGRFVIGGPMGDCGLTGRKIIVDTYGGMARHGGGAFSGKDPSKVDRSAAYAARYVAKNIVAAGLADRCEIQVSYAIGVAEPTSIMVETFGTEKVPSEQLTLLVREFFDLRPYGLIKMLDKLHPIYKETAAYGKFGREHFPWEKTDKAQLLRDAAGLK(SEQ ID NO.3)

应理解，本发明的范围包括上述5个位点突变1～5个氨基酸残基的所有组合构成的技术方案，限于篇幅在此不再一一列述。

有益效果：本发明提供的经突变改造的重组腺苷蛋氨酸合成酶，在配合氨基酶载体进行固定化使用时，能够显著提高固定化后的酶活保留率、底物催化效率、连接稳定性以及使用寿命。相较经相同载体固定化的原始序列的腺苷蛋氨酸合成酶，其酶活保留与催化效率均能够提升30％以上，使用寿命能够提升1倍以上。催化效率的提升也能够减少反应底物的用量，经改造的重组腺苷蛋氨酸合成酶的发酵表达量也能够达到30％以上。整体上，大幅降低了腺苷蛋氨酸酶促制备的成本，提高了腺苷蛋氨酸生产过程控制的稳定性、升级了其工业化生产水平。

附图说明

图1S-腺苷-L-蛋氨酸的分子结构

图2伯氨基载体的结构示意图

图3大肠杆菌源腺苷蛋氨酸合成酶的结构图

图4大肠杆菌源腺苷蛋氨酸合成酶的序列与结构对应图

图5实施例1中腺苷蛋氨酸合成酶大肠杆菌工程菌制备过程中制得的重组载体pBV220-metK-SI032的结构

图6实施例1中腺苷蛋氨酸合成酶工程菌制备过程中的目的基因序列检测确认

图7实施例1中发酵及诱导后所得含改造酶工程菌的电泳表达量检测

图8测试例中酶促产物腺苷蛋氨酸含量检测的HPLC典型色谱图

图9实施例1与参比例1反应动力学曲线比对

图10腺苷蛋氨酸合成酶固定化反应示意图

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均视为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特别说明，均可从商业途径得到。

实施例一SEQ ID NO.2序列腺苷蛋氨酸合成酶的制备及固定化酶促应用

1.主要材料

细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)、质粒小提试剂盒(DP103)购自TIANGEN公司；克隆载体pBV220购自北京碧橙蓝生物科技有限责任公司；DH5α感受态、pEASY-BluntSimple Cloning Vector购自北京全式金生物技术有限公司；限制性内切酶EcoR I和SalI、T4DNA连接酶购自宝生物工程(大连)有限公司；Pfu高保真DNA聚合酶购自TIANGEN公司；LB培养基所用蛋白胨、酵母粉购自OXOID公司；Agar购自JAPAN公司；戊二醛、七水合硫酸镁、硫酸钾、氯化铵、葡萄糖等购自国药集团化学试剂公司；三磷酸腺苷二钠购自杭州美亚药业股份有限公司；L-蛋氨酸购自无锡必康生物工程有限公司。

2.主要设备

电泳仪和紫外投射仪：北京六一；台式离心机：BECKMAN COULTER公司；恒温摇床：INNOVA公司；PCR扩增仪：TECHNE公司；发酵罐：上海国强、江苏镇江东方；酶促系统：青岛海越。

3.表达SEQ ID NO.2序列腺苷蛋氨酸合成酶的工程菌株的构建

①.根据SEQ ID NO.2的氨基酸序列(参见序列表)，参照大肠杆菌密码子使用偏好性数据，设计并合成改造的腺苷蛋氨酸合成酶核苷酸序列，全长1152bp，上下游分别加入EcoR I酶切位点与Sal I酶切位点，编号为metK-SI032，其序列信息参见序列表中的Sequence NO.2。

将合成的目的基因metK-SI032经PCR扩增后，与pEASY-Blunt Simple CloningVector混合，放入PCR仪中，37℃反应15min。再加入到DH5α感受态细胞中，轻轻混合，在冰浴中放置30分钟。42℃水浴中热激45秒，之后，加入无菌的LB培养基，置于37℃，200rpm振荡培养1小时，完成转化。于含100μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂培养基37℃培养过夜，再于含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养10h，即得含有经改造的腺苷蛋氨酸合成酶基因重组质粒的菌株，加入等体积甘油冷冻保存。

②.根据质粒小提试剂盒说明书，培养上述菌株后提取pEASY-Blunt-metK-SI032质粒。以EcoR I限制性内切酶与Sal I限制性内切酶对pEASY-Blunt-metK-SI032质粒进行酶切，电泳鉴定metK-SI032基因片段。再以EcoR I限制性内切酶与Sal I限制性内切酶对pBV220质粒进行酶切。

将经过双酶切的质粒pBV220与回收的metK-SI032基因均匀混合，加入10×T4 DNA连接酶缓冲液1μL，T4 DNA连接酶(350U/μl)1μL，混匀，于16℃保温12h以上，得到重组表达载体pBV220-metK-SI032，其结构图如附图5所示。测序分析测得目的基因序列与理论结果完全相一致，其目的基因序列如图6所示。

取重组表达载体pBV220-metK-SI032加到冰浴上融化的DH5α感受态细胞中，轻轻混合，在冰浴中放置30分钟；42℃水浴中热激45秒。再加入500μL无菌的LB培养基，混匀后置于37℃，200rpm培养1小时，完成转化。取已转化菌液，涂布于含梯度浓度氨苄青霉素的各LB琼脂培养基，倒置培养过夜。挑取各平板上的单菌落，筛选腺苷蛋氨酸合成酶表达量最高的阳性转化子，即为表达经改造的序列为SEQ ID NO.2的腺苷蛋氨酸合成酶的重组pBV220-metK-SI032/DH5α工程菌。

4.SEQ ID NO.2序列腺苷蛋氨酸合成酶的制备

①.以灭菌后的LB培养基，于30～37℃进行pBV220-metK-SI032/DH5α工程菌的一级种子液与二级种子液扩增培养，培养至OD

按照Na

②.将发酵所得含腺苷蛋氨酸合成酶的菌体，按一定比例混匀于pH值7.4的TE缓冲液中。使用高压均质机以65～90Mpa的压力进行破碎。再使用连续流管式离心机以14000rpm的转速澄清。加入硫酸铵静置盐析后，使用连续流管式离心机以14000rpm的转速澄清，得到联酶用酶液。

取已清洗的伯氨基载体，按质量比为1:10加入纯化水中，开启搅拌，设置温度23℃，加入50％戊二醛至终浓度为0.5～0.8％，在15～25℃控温搅拌的条件下活化6～12h，之后以纯化水进行洗涤，去除残存的戊二醛。将清洗后的已活化酶载体装载于层析柱或类似功能柱中，将所得酶液以0.5～1.0cm/min的线性流速上样至该柱床中，循环输料直至联酶完毕。之后，以纯化水进行清洗，再以0.15～0.30％的乙二胺浸泡3h，进行洗涤与封端，最后以纯化水冲洗至pH值5.0～7.5。

5.利用固定化合成酶制备腺苷蛋氨酸

将固定化酶装载于可温控酶促柱中，按照三磷酸腺苷二钠0.018～0.030mol/L、L-蛋氨酸0.06～0.09mol/L、EDTA-Na

实施例二SEQ ID NO.3序列腺苷蛋氨酸合成酶的制备及固定化酶促应用

该突变的腺苷蛋氨酸合成酶氨基酸序列参见序列表中的SEQ ID NO.3，其对应的核苷酸序列信息参见序列表中的Sequence NO.3。