一种野生芽孢杆菌催化芳香醛合成芳香醇的方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体而言，涉及一种野生芽孢杆菌Bacillussp.CCZU11-1，CGMCC No.9297催化芳香醛合成芳香醇的方法及其应用。

背景技术

生物质作为一种可再生资源，在生物精炼技术改进方面具有巨大的潜力。大多数生物质都是作为燃烧材料，会导致空气的污染和全球变暖。生物质中的木质素解聚的主要常见单体化合物为丁香醛、香草醛、对羟基苯甲醛等芳香醛。多项研究发现，芳香醛经过还原反应得到的芳香醇具有很大的价值。

例如，对羟基苯甲醇是加利车霉素缀合物中的合成试剂，用于治疗急性髓细胞性白血病。香草醇可用作食品添加剂、镇静剂，此外还有促进胆汁分泌、抗惊厥的作用。水杨醇是合成抗炎和防治肝炎等药物的重要中间体。其衍生物乙酰水杨酸,是阿斯匹林的活性化学成分。茴香醇可用作为食品添加剂。枯茗醇具有优雅的花香和轻微的皮革气味,可用于调制多种香型的香精,并可用作柠檬香韵改良。苯甲醇由于沸点高，不易挥发，疏水性强等特点，可用作环氧树脂稀释剂。

目前，芳香醇通常通过化学合成来实现。然而化学合成工艺通常反应条件苛刻，处理工艺复杂，违反绿色化学的原理，化学法合成芳香醇的过程中用到高温高压，强酸或强碱以及金属催化剂，会对环差生污染。例如，传统的合成对羟基苯甲醇利用惰性气体和氢气在高温下进行(CN202010282714.1)；Yang等人以双活性位点Ni-NiIn作为催化剂加氢气催化糠醛合成糠醇，这种方法制备的催化剂需要高温高压的条件(K.Yang,Y.Li.Fuel，2022)。

生物催化法高效环保，反应条件温和，基本没有副产物的生产。与酶催化相比，全细胞催化，细胞内具有完整的多酶体系，无需酶纯化即可实现酶的级联反应，操作简便，生产成本更低。目前研究使用含羰基还原酶的重组菌株能够将300mM的糠醛(He et al.GreenChemistry,2023)和250mM的5-羟基甲糠醛(Xia et al.Enzyme and MicrobialTechnology，2020)以较高的产率还原为对应的醇类产物。但重组菌普遍存在对底物浓度的耐受度不高的问题，从而限制了其在工业上的应用和发展。因而有必要改变所使用的全细胞催化剂的类型，开发一种能够还原高浓度的芳香醛合成芳香醇的全细胞生物催化工艺，这是很有意义和潜力的。

发明内容

本发明目的是提供一种野生芽孢杆菌生物催化芳香醛合成芳香醇的方法及该芳香醇的应用。高效绿色的生物还原工艺，有利于芳香性产品的高附加值应用，实现对生物质资源的充分利用。

本发明提供的一种野生芽孢杆催化芳香醛还原合成芳香醇的方法，具体的，该野生芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌Bacillus sp.CCZU11-1，其保藏号为CGMCC No.9297，该菌株已在中国专利公开号105018368A中公开。

本发明的芳香醛指来源于芳香性及其衍生的醛类化合物，包括丁香醛、水杨醛、茴香醛、枯茗醛、对羟基苯甲醛、苯甲醛、对氯苯甲醛、5-氯水杨醛、香兰素甲醚、乙基香兰素、邻香草醛、2-羟基-4-甲氧基苯甲醛、4-硝基苯甲醛、2-羟基-5-甲氧基苯甲醛、2-羟基-6-甲氧基苯甲醛、异香兰素、香草醛、糠醛、5-羟甲基糠醛、苯乙醛、苯丙醛中的任意一种。

本发明提供的生物催化合成芳香醇的方法，具体所述应用的方法为：在缓冲溶液中加入芳香醛，助溶剂，共底物和芽孢杆菌全细胞，在25～45℃、pH6～8、180rpm条件下，进行反应，反应时间为0.5～24h，待反应结束，反应液使用乙酸乙酯萃取，分层，取出有机相旋蒸，获得芳香醇。

其中，所述反应体系中，芽孢杆菌全细胞的制备方法为，将芽孢杆菌Bacillussp.CCZU11-1。CGMCC No.9297在摇瓶培养基中进行扩增培养120～150h，培养温度为25～45℃，液体培养基组分和含量如下：蛋白胨20～80g/L，酵母膏20～40g/L，KH

其中，所述反应体系中，底物芳香醛的浓度为50～1500mM，优选500～1200mM。

其中，所述反应体系中，芽孢杆菌全细胞催化剂用量为5～100g/L，优选为50g/L。

其中，所述反应体系中，共底物与芳香醛的摩尔比为0.25～3:1,；优选1.5～3；1；共底物为葡萄糖、异丙醇、甲酸、乙醇中的一种，优选为葡萄糖。

其中，所述反应体系中，助溶剂的体积浓度为1～8％，优选2～5％；助溶剂为二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺的一种，优选助溶剂为二甲基亚砜。

其中，所述反应体系中，缓冲溶液为浓度为100mM的磷酸盐缓冲液，pH为6～8，优选的pH为6.5～7.5；更优选pH为6.5。

进一步地，所述反应体系中还可以包括辅酶，辅酶与芳香醛的摩尔比为0.01～3:1；优选1～3:1；辅酶为NAD

进一步地，本发明的芽孢杆菌催化芳香醛与呋喃醛类化合物和还原后的芳香醇结构如下：

本发明的野生芽孢杆菌催化芳香醛合成芳香醇的方法，其芳香醇类化合物的产率均在85％以上。所制备的糠醇、对羟基苯甲醇具有抗氧化活性，可用于抗氧化。可以加入到医药工业(防止药品的氧化降解，保证药品的质量和疗效)、橡胶工业(防止橡胶制品的老化和劣化，延长橡胶制品的使用寿命)、金属加工工业(防止金属的氧化腐蚀，保护金属的表面光洁度和使用寿命)，能有效抑制其在运输、储藏、销售过程中的氧化降解，保证质量和稳定性。

本发明的有益效果：

本发明首次提供一种野生芽孢杆菌催化芳香醛类合成芳香醇的方法，在高浓度的醛类化合物的还原转化过程中都具有较高的选择性与转化率。采用全细胞催化合成工艺，操作简便，反应条件温和，生产成本低。

附图说明：

图1为实施例1催化合成对羟基苯甲醇的温度优化(a)；实施例2催化合成对羟基苯甲醇的pH优化(b)；实施例3催化合成对羟基苯甲醇的葡萄糖浓度优化(c)；实施例4催化合成对羟基苯甲醇的NAD

图2为实施例6制备的对羟基苯甲醇的产物浓度-时间曲线；

图3为实施例6制备的对羟基苯甲醇的核磁氢谱图；

图4为实施例6制备的对羟基苯甲醇的核磁碳谱图；

图5为对羟基苯甲醇标品的高效液相色谱图；

图6为对羟基苯甲醛标品的高效液相色谱图；

图7为实施例5反应后的高效液相色谱图；

图8为实施例8糠醇的DPPH自由基清除结果；

图9实施例8对羟基苯甲醇的DPPH自由基清除结果。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施作进一步说明，本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，但本发明的实施和保护不限于以下实施例。以下实施例中所用的原料均为已知化合物，可以由商业途径获得。

实施例1

在1L的锥形瓶中加入250mL培养基蛋白胨5g，酵母膏5g，KH

在100mL的pH 6.5、100mM PBS缓冲液中，按终浓度计算，加入50g/L的实施例1方法制备的芽孢杆菌Bacillus sp.CCZU11-1全细胞，1200mM的对羟基苯甲醛溶液，1800mM的葡萄糖，2400μM的NAD

实施例2

全细胞催化对羟基苯甲醛生产对羟基苯甲醇的最适催化pH优化

在100mL的不同pH(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)、100mM PBS缓冲液中，按终浓度计算，加入50g/L的实施例1方法制备的芽孢杆菌Bacillus sp.CCZU11-1全细胞，1200mM对羟基苯甲醛溶液，1800mM的葡萄糖，2400μM的NAD

实施例3

全细胞催化对羟基苯甲醛生产对羟基苯甲醇的最适葡萄糖浓度的优化

在100mL的pH 6.5、100mM PBS缓冲液中，按终浓度计算，加入50g/L的实施例1方法制备的芽孢杆菌Bacillus sp.CCZU11-1全细胞，1200mM对羟基苯甲醛溶液，0、300、600、1200、1800、2400、3000、3600mM的葡萄糖，2400μM的NAD

实施例4

全细胞催化对羟基苯甲醛生产对羟基苯甲醇的最适NAD

在100mL的pH 6.5、100mM PBS缓冲液中，按终浓度计算，加入50g/L的实施例1方法制备的芽孢杆菌Bacillus sp.CCZU11-1全细胞，1200mM对羟基苯甲醛溶液，1800mM的葡萄糖，0、600、1200、1800、2400、3000、3600μM的NAD

实施例5

全细胞催化对羟基苯甲醛生产对羟基苯甲醇

在100mL的pH 6.5、100mM PBS缓冲液中，按终浓度计算，加入50g/L的实施例1方法制备的芽孢杆菌Bacillus sp.CCZU11-1全细胞，1200mM的对羟基苯甲醛溶液，1800mM的葡萄糖，2400μM的NAD

对羟基苯甲醛和对羟基苯甲醇含量的检测方法：使用Agilent 1260高效液相色谱仪，色谱柱为C18(4.6×250mm)，流速为0.8mL/min，流动相由溶剂A(纯水)和溶剂B(纯乙腈)组成。使用以下梯度洗脱程序：0分钟，80％溶剂A+20％溶剂B；21分钟，0％溶剂A+100％溶剂B；26分钟，80％溶剂A+20％溶剂B；33分钟，80％溶剂A+20％溶剂B。通过测量220nm处的吸光度来监测底物对羟基苯甲醛和产物对羟基苯甲醇。

样品处理方法：生物催化反应结束后，取1mL转化液于8000rpm,离心5min，然后取100μL离心得到的上清液并加入900μL甲醇用以稀释，然后用0.22μm的有机滤膜过滤，取滤液用高效液相色谱法定量检测底物对羟基苯甲醛和产物对羟基苯甲醇，结果见图5-6。

根据计算公式：

实施例6

全细胞催化对羟基苯甲醛生产对羟基苯甲醇的反应时间进程

在100mL的pH 6.5、100mM PBS缓冲液中，以反应终浓度计算，加入50g/L的实施例1方法制备的芽孢杆菌Bacillus sp.CCZU11-1全细胞，500、800、1000、1200、1500mM的对羟基苯甲醛溶液，葡萄糖与底物的摩尔比为1.5:1(mol:mol)，NAD

表1底物对羟基苯甲醛的浓度对生物催化生产对羟基苯甲醇的影响

产物对羟基苯甲醇的核磁氢谱，见图3；核磁碳谱，见图4。

实施例7

芽孢杆菌Bacillus sp.CCZU11-1全细胞催化合成芳香醇的底物谱

在实施例6的优选反应条件下，将21种底物，以pH6.5、100mM的PBS缓冲液为反应介质，以反应终浓度计算,1200mM的底物，1800mM的葡萄糖，2400μM的NAD

表2全细胞催化芳香醛生产芳香醇产率测定

实施例8

向25mL无水乙醇中加入1mg DPPH，得到浓度为0.04mg/mL的DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)溶液。配制浓度为2、4、6、8、10mg/mL制备得到的糠醇、对羟基苯甲醇溶液。将100μL不同浓度的样品溶液加入到96孔板中，再加入100μL DPPH溶液，避光放置30min，使用酶标仪在517nm下测吸光度。100μL无水乙醇+100μL的DPPH溶液，在517nm下的吸光值记为A

最后得到糠醇的清除率分别为62％，对羟基苯甲醇的清除率76％。从图8-9可以看出，芳香醇具有较好的自由基清除能力，其在抗氧化方面拥有较大潜力。

实施例9

通过Schaal烘箱法，分别将糠醇、对羟基苯甲醇、香草醇及二丁基羟基甲苯(BHT)0.8g/kg溶于50g天然香薰精油中，敞口置于62±1℃烘箱中贮藏10天，之后测定各组油脂过氧化值和丙二醛含量；另外同样采用Schaal烘箱法，准确称量50g相同的天然香薰精油中，敞口置于62±1℃烘箱中贮藏10天，同样测定油脂过氧化值和丙二醛含量。

表3对天然香薰精油的抗氧化效果比较

由表3可见，与空白组相比，三种芳香醇的抗氧化剂组与BHT组的抗氧化值和丙二醛值较低，天然香薰精油在三种芳香醇的保护下，第10天的抗氧化值分别为0.426g/100g、0.265g/100g、0.325g/100g，香草醇与对羟基苯甲醇组优于BHT组，糠醇组也较为接近，相对于没有抗氧化剂的空白组第10天的抗氧化值为2.782g/100g，分别降低其抗氧化值为2.356g/100g、2.517g/100g和2.457g/100g，其保护率分别为84.69％、90.47％和88.32％；天然香薰精油在三种芳香醇的保护下，第10天的丙二醛值分别为0.982mg/kg、0.621mg/kg、0.826mg/kg，香草醇与对羟基苯甲醇组优于BHT组，糠醇组则较为接近，相对于没有抗氧化剂的空白组第10天的丙二醛值为5.670mg/kg，分别降低其丙二醛值为4.688mg/kg、5.049mg/kg和4.844mg/kg，其保护率分别为82.68％、89.04％和86.50％。可以看出，三种芳香醇能够有效的减缓天然香薰精油的氧化酸败作用。

以上所述仅是本发明的优选公开实施例，应当指出，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明原理的前提下，都可以做出改动和修饰，这些改动和修饰也应视为本发明的保护范围。