一株具有广谱抑菌活性的链霉菌F-04及其应用

技术领域：

本发明涉及微生物及其应用技术领域，特别涉及一株具有广谱抑菌活性的链霉菌F-04及其应用。

背景技术：

核桃是胡桃科胡桃属植物，为全球著名的四大坚果之一。我国的核桃种植面积和产量均稳居全球第一，也是全球核桃消费量最高的国家。核桃腐烂病主要是由无性类真菌金黄壳囊孢(Cytospora chrysosperma)引起的真菌性病害。一般在管理粗放，土层瘠薄，排水不良，肥水不足的核桃园发病较重，树体因遭受冻害及盐害而树势衰弱也易感染此病。

核桃腐烂病在我国各核桃产区均有发生，总体上北方核桃园病害发生情况要重于南方。新疆核桃产区主要集中在阿克苏地区、和田地区及喀什地区，腐烂病病株率平均为27.15％。但由于管理水平的差异，各地区各果园之间发病情况亦不相同，发病重的果园病株率可达94％以上，对核桃产业健康发展构成严重威胁。

陈小飞等人(2022)从新疆不同核桃产区采集到核桃腐烂病样本236份，共分离到真菌115株，经鉴定111株为金黄壳囊孢(Cytospora chrysosperma)，1株为Cytosporatritici，3株为隐球壳菌(Cryptosphaeriapullmanensis)，分别占分离真菌总数的96.5％、0.9％和2.6％。

核桃生产上主要通过加强农艺措施管理、喷施化学农药等手段防治核桃腐烂病，普遍存在防治效果不理想、农药残留和环境污染风险高等问题。利用病原菌的拮抗菌进行生物防治，正成为越来越被推崇的替代方案。

目前，已有较多针对核桃腐烂病致病真菌的拮抗菌筛选研究。马荣等(2015)从带病枝条中分离获得一株短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)XJAU-117菌株，研究表明其对核桃腐烂病菌的抑制率高达85％。现有中国专利文件CN 111153742A公开了一种土壤改良型生物有机液体肥及其在盐碱地核桃种植中的应用，通过利用短小芽孢杆菌发酵液30％、地衣芽孢杆菌发酵液25％、棘孢木霉菌发酵液20％、黄麻链霉菌发酵液15％和细黄链霉菌发酵液10％与有机肥混合料进行腐熟，并与黄腐酸钾、复合氨基酸和微生物修复剂相融合，制备的土壤改良型有机液体肥施用后对盐碱地种植核桃具有增产增收、显著增强树势、驱虫的作用，核桃品质显著提升。但目前尚未有针对核桃腐烂病防治的生防制剂产品。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一株具有广谱抑菌活性的链霉菌菌株F-04及其应用，从新疆核桃园土壤中分离筛选的德干链霉菌F-04，能够用于对核桃腐烂病的防治。

为达到上述目的，本发明提供一株具有广谱抑菌活性的德干链霉菌(Streptomyces deccanensis)F-04，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.29519。

本发明还提供所述德干链霉菌F-04在防治核桃腐烂病中的应用。

本发明还提供所述德干链霉菌F-04在拮抗植物致病菌中的应用，所述植物致病菌包括核桃腐烂病另一种致病菌(Cytospora nivea)、杏腐烂病菌(Cytospora leucostoma)、苹果腐烂病菌(Valsa mali)、香梨腐烂病菌(Cytospora ambiens)、棉花枯萎病(Fusariumoxysporum)、棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)、沙枣腐烂病菌(Cytosporachrysosperma)、核桃褐斑病菌(Alternaria alternata)。

本发明提供一种生防菌剂，其活性成分为本发明所述德干链霉菌F-04的菌饼、德干链霉菌F-04的菌悬液、德干链霉菌F-04的发酵液和德干链霉菌F-04的无菌发酵滤液中的一种或几种。

所述德干链霉菌F-04菌悬液的制备方法：挑取菌株单菌落接种于液体高氏一号培养基中，30℃、200r/min培养3d。

所述德干链霉菌F-04发酵液的制备方法：取100uL德干链霉菌F-04菌悬液于12,000rpm室温离心2min，吸取上清液转接于100mL的液体高氏一号培养基中，30℃、200r/min培养3d后得到发酵液。

所述德干链霉菌F-04无菌发酵滤液的制备方法：吸取1ml德干链霉菌F-04发酵液到液体高氏一号培养基中，30℃，200r/min振荡培养3d，将发酵液于4℃，12000rpm离心20min后取上清液，经0.22μm微孔滤膜过滤获得无菌发酵滤液。

所述生防菌剂可直接采用德干链霉菌F-04的菌饼、菌悬液、发酵液、无菌发酵滤液中的一种或几种进行应用，也可将其作为活性成分，再辅以载体以及其他助剂(如稳定剂、抗氧化剂等)等，制成更稳定或便于携带和运输的各种类型的制剂(如固体的颗粒制剂、液体的悬浮剂以及气体的喷雾剂等)，以便更好的在实际生产中进行应用。

本发明还提供了所述生防菌剂在果树防病促生中的应用。

本发明与现有技术相比，提供了一株具有广谱抑菌活性的的德干链霉菌(Streptomyces deccanensis)F-04，对防治核桃腐烂病效果显著，防治效果达到80％以上；并对多种植物致病菌具有抑制作用，抑菌谱广；该德干链霉菌F-04对核桃和小麦有明显的促生长效果；且德干链霉菌F-04活性成分的热稳定性和紫外线稳定性好，可在高温、强紫外线的自然环境下应用；所述生防菌剂制作简单且成本低，无毒、无害、无环境污染，有利于安全有效的控制植物病害。

附图说明：

图1为菌株F-04形态特征图，其中A为菌株F-04在PDA平板上30℃下培养3d的形态，B为菌株F-04在PDA平板上30℃下培养10d的形态，C为显微镜下的菌株F-04菌丝，D为显微镜下的F-04孢子。

图2为依据16S rDNA基因序列构建的菌株F-04的系统发育树。

图3为德干链霉菌F-04对核桃腐烂病病原菌(C.chrysosperma)的抑菌试验结果，其中A为不接种德干链霉菌F-04的空白对照，B为德干链霉菌F-04距划线接种的处理，C为德干链霉菌F-04等距菌饼接种的处理。

图4为德干链霉菌F-04对核桃腐烂病病原菌(C.chrysosperma)菌丝生长的影响试验结果，其中A为不接种德干链霉菌F-04的空白对照，B为接种德干链霉菌F-04的对峙处理。

图5为德干链霉菌F-04对核桃腐烂病病原的防治效果试验结果，其中A为不涂刷德干链霉菌F-04的空白对照，B为涂刷德干链霉菌F-04的防控处理。

图6为德干链霉菌F-04对8种植物致病菌的抑菌试验结果。

图7为德干链霉菌F-04活性成分的热稳定性测试结果，其中，A为不同温度处理下的C.chrysosperma菌落直径；B为德干链霉菌F-04活性成分对C.chrysosperma菌丝生长的抑制率，其中CK为阳性对照。

图8为德干链霉菌F-04活性成分的紫外光照射稳定性测试结果，其中A为紫外光照射不同时长处理下的C.chrysosperma菌落直径；B为德干链霉菌F-04对C.chrysosperma菌丝生长的抑制率，其中CK为阳性对照。

图9为德干链霉菌F-04对核桃和小麦的促生试验结果，其中A为移栽生长30d后的液体高氏一号培养基对照组的核桃幼苗，B为移栽生长30d后的无菌发酵滤液处理组的核桃幼苗；C、D、E均为移栽生长15d后的小麦幼苗，其中CK为液体高氏一号培养基对照组的小麦幼苗，1、2、3、4和5是用无菌发酵滤液处理组的小麦幼苗。

具体实施方式：

下面通过具体实施例并结合附图对本发明作进一步详细说明。

本发明所用的高氏一号培养基、PDA培养基均为本领域常用培养基。

高氏一号培养基配方为：可溶性淀粉20g、氯化钠0.5g、硝酸钾1g、磷酸氢二钾0.5g、硫酸镁0.5g、硫酸亚铁0.01g、琼脂20g、蒸馏水1000ml、pH7～7.5。相应的高氏一号液体培养基中，不含琼脂。

PDA培养基配方为：土豆200g、葡萄糖20g、琼脂18～20g，蒸馏水1000ml，自然pH。相应的PDA液体培养基中，不含琼脂。

实施例1：德干链霉菌(Streptomyces deccanensis)F-04的分离与鉴定

本实施例以核桃树腐烂病菌(Cytospora chrysosperma和Cytospora nivea)为靶标菌，从新疆核桃园土壤中分离筛选拮抗菌，并进行菌株鉴定，具体步骤如下：

1、拮抗菌的分离

采集新疆核桃园土壤，经风干后筛滤保存，制得风干土样；风干土样经无菌水混悬、稀释后，采用常规梯度稀释涂布分离法，用高氏一号培养基分别在30℃下培养，挑取菌落形态差异明显的单菌落，在高氏一号培养基上纯化保存。

2、拮抗菌的筛选

采用平板对峙法筛选对核桃树腐烂病菌(Cytospora chrysosperma和Cytosporanivea)具有潜在抑菌效果的拮抗菌，具体步骤如下:

将保存的单菌落活化培养后，等距离(距离病原菌2.5cm左右)划线至已接种核桃树腐烂病病原菌的PDA平板上，以不接种候选拮抗菌为空白对照，每个处理3个重复；26℃恒温培养，待对照菌丝即将长满时，测量各处理病原菌菌落直径，按照下列公式计算抑菌率：

抑菌率＝(对照平板菌落直径－处理平板菌落直径)/对照平板菌落直径×100％；

筛选出一株抑菌率达80％以上的拮抗菌株，编号为F-04。

3、拮抗菌的鉴定

(1)参照《常见细菌系统鉴定手册》，观察拮抗菌菌体形态及菌落培养形态，测定拮抗细菌的需氧特征、NaCl耐受度、有机磷、无机磷、纤维素分解、V-Р试验、甲基红试验、H

形态观察结果表明：菌株F-04在PDA琼脂平板上30℃培养3天，菌落呈单个或成双排列，较少呈链状排列；菌株F-04在PDA琼脂平板上30℃培养10天，形成较大、圆形、凸起、灰白色菌落；菌株F-04菌丝生长缓慢，菌丝紧密螺旋生长，孢子为球形(图1)。

生理生化指标测定结果(如表1所示)表明，菌株F-04可利用分解无机磷、蛋白酶、铁载体、明胶、多糖、M.R、蔗糖、精氨酸、酯酶、氧化酶、柠檬酸盐、0％～6％NaCl、最适pH7.0～7.5；不能利用有机磷、纤维素、淀粉、几丁质、脓青素、7％NaCl。

表1菌株F-04生理生化测定

注：“+”表示反应呈阳性；“-”表示反应呈阴性。

(2)对菌株F-04进行16S rDNA测序，测序结果如SEQ ID NO:1所示；将测序结果与NCBI数据库进行同源比对、构建系统发育树分析(图2)，并结合形态学特征(图1)、生理生化特性(表1)，最终鉴定菌株F-04属于德干链霉菌Streptomyces deccanensis，将其命名为德干链霉菌(Streptomyces deccanensis)F-04。

此菌株于2024年01月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.29519。

所述德干链霉菌(Streptomyces deccanensis)F-04的rDNA序列为：TTCGGTGTGGGCTTAGTAGGTGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTTCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATACGACACTCTCGGGCATCCGATGAGTGTGGAAAGCTCCGGCGGTGAAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCGAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTCTGTCGCGTCGGATGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCATTCGATACGGGCAGACTAGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATTCCACGTCGTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAACGGCCAGAGATGGTCGCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTCTGTGTTGCCAGCATGCCCTTCGGGGTGATGGGGACTCACAGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCAGGTACAATGAGCTGCGAAGCCGTGAGGCGGAGCGAATCTCAAAAAGCCTGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTTGCTA GTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTGTCCGGACCTAGTACACTCCGCCCTTCACATCTCGAAACACGGTAAC(SEQ ID NO:1)。

实施例2：

本实施例涉及德干链霉菌F-04菌悬液、发酵液和无菌发酵滤液的制备方法，具体如下：

1、德干链霉菌F-04菌悬液的制备方法为：挑取德干链霉菌F-04菌株单菌落接种于液体高氏一号培养基中，30℃、200r/min培养3d，即为菌悬液。

2、德干链霉菌F-04发酵液的制备方法为：取100uL上述德干链霉菌F-04菌悬液于12,000rpm室温离心2min，取上清液转接于100mL的液体高氏一号培养基中，30℃、200r/min培养3d，即为发酵液。

3、德干链霉菌F-04无菌发酵滤液的制备方法：吸取1ml上述德干链霉菌F-04发酵液到液体高氏一号培养基中，30℃，200r/min振荡培养3d后，于12000rpm 4℃离心20min，取上清液再经0.22μm微孔滤膜过滤，滤液即为无菌发酵滤液。

实施例3：

本实施例涉及德干链霉菌F-04对核桃腐烂病菌的抑菌效果验证试验。

1、平板对峙法观察德干链霉菌F-04对核桃腐烂病病原菌——金黄壳囊孢(C.chrysosperma)的抑菌效果

在PDA平板中央接种一枚C.chrysosperma菌饼，以不接种德干链霉菌F-04的为空白对照，2个处理组分别设等距划线接种德干链霉菌F-04和菌饼接种德干链霉菌F-04的处理。各试验平板于26℃恒温培养。待对照组菌丝即将长满时，观察处理组德干链霉菌F-04菌株与C.chrysosperma菌饼之间的抑菌带宽度。结果如图3所示。

从图3可以看出，空白对照组病原菌菌丝长满时，两处理组的病原菌菌丝向外扩展缓慢，说明德干链霉菌F-04对核桃腐烂病病原菌C.chrysosperma的抑菌效果显著。

2、德干链霉菌F-04的无菌发酵滤液对核桃腐烂病病原菌——金黄壳囊孢(C.chrysosperma)菌丝形态的影响试验

取20mL冷却到50℃的PDA培养基与5mL德干链霉菌F-04无菌发酵滤液混合均匀；在载玻片上倒上一层混合液，待其凝固后用刀片在带有混合液的载玻片的中央截去宽度为1cm左右培养基；用接种针挑取培养3d的C.chrysosperma菌丝，将其置于截面处，盖上盖玻片；在铺有两层湿润滤纸的培养皿中26℃恒温培养3d后，通过显微镜观察病原菌菌丝形态。按上述步骤，用不混合德干链霉菌F-04无菌发酵滤液的PDA培养基培养病原菌为空白对照，观察菌丝形态。结果如图4所示。

从图4可以看出，空白对照平板中的C.chrysosperma菌丝形态完整，菌丝细长、均匀且表面光滑，菌丝顶端呈尖锐状，结构完整(图4A)；而经德干链霉菌F-04处理平板中的C.chrysosperma菌丝形态出现严重畸变现象，菌丝断裂、萎缩、扭曲(图4B)，出现菌丝体膨大结构，表明德干链霉菌F-04可破坏核桃腐烂病病原菌C.chrysosperma的菌丝形态。

3、不同浓度的德干链霉菌F-04无菌发酵滤液对核桃腐烂病病原菌C.chrysosperma菌丝生长的抑制影响试验，具体步骤如下：

将无菌发酵滤液和融化好的PDA培养基混合，分别配置成无菌发酵滤液含量为0％、3％、6％、9％、12％、15％的培养基平板，其中0％为空白对照组，其他为处理组；在平板中央接种一个培养3d的C.chrysosperma菌饼(直径5mm)，试验设3次重复；各平板26℃下培养3d后，测量病原菌菌落直径，按照下列公式计算抑菌率，结果如表2所示。

抑制率(％)＝[(空白对照组菌落直径－处理组菌落直径)/空白对照组菌落直径]×100

表2结果表明，不同浓度德干链霉菌F-04无菌发酵滤液对C.chrysosperma菌丝生长均具有显著的抑制效果，且随着浓度升高，其抑制效果越明显，最高抑制率达到91.20％。

表2不同浓度梯度F-04无菌发酵滤液对C.chrysosperma菌丝生长影响

注：表中列出各数据为平均值±标准差，不同小写字母代表经Duncan氏族新复极差法检验P<0.05水平差异显著。下同。

实施例4：

本实施例涉及德干链霉菌F-04对核桃腐烂病的防治效果验证试验，具体步骤如下：

1、德干链霉菌F-04无菌发酵滤液对核桃枝条的损伤检测

①枝条处理：采集健康状况和粗细程度均匀的1年生核桃枝条，剪成10-15cm左右的枝段，经自来水冲洗干净后，用0.6％(w/w)次氯酸钠水溶液消毒30min后，再用无菌水清洗5次直至无次氯酸钠溶液气味，室温自然晾干，用融化的石蜡封住枝条两端用于保湿，静置晾干备用；

②造伤接种处理

将处理好的枝条用灭菌打孔器(孔径5mm)打孔造伤，设2个处理：对照组：在伤口处滴加50uL高氏一号液体培养基并接种核桃树腐烂病菌C.chrysosperma；处理组：在枝条的伤口处滴加50uL德干链霉菌F-04无菌发酵滤液。试验设3个重复。

各枝条在自然条件下保湿培养15d后，观察核桃枝条的伤口扩展情况，并按下列公式测算病斑面积，结果如表3所示。

病斑面积(cm

从表3可以看出：处理组平均病斑面积为0.62cm

表3德干链霉菌F-04对离体枝条损伤的检测结果

2、德干链霉菌F-04无菌发酵滤液对核桃树腐烂病的离体防效测定

①枝条处理：采集健康状况和粗细程度均匀的1年生核桃枝条，剪成10-15cm左右的枝段，经自来水冲洗干净后，用0.6％(w/w)次氯酸钠水溶液消毒30min后，再用无菌水清洗5次直至无次氯酸钠溶液气味，室温自然晾干，用融化的石蜡封住枝条两端用于保湿，静置晾干备用；

②造伤接种处理

将处理好的枝条用灭菌打孔器(孔径5mm)打孔造伤，设2个处理：对照组(CK)：用毛笔蘸取适量高氏一号液体培养基涂刷枝条3次(每次自然晾干后再进行下一次涂刷)；处理组：用毛笔蘸取适量德干链霉菌F-04无菌发酵滤液涂刷枝条3次(每次自然晾干后再进行下一次涂刷)。每处理涂刷10个枝条；试验设5个重复。

涂刷完成的枝条整体晾干后，在枝条的打孔造伤处接种核桃树腐烂病菌菌饼，每个枝条1个接种点。枝条在26℃条件下保湿培养15d后，观察核桃树腐烂病的发生情况，按下列公式测算病斑面积并计算防治效果，结果如表4和图5所示。

病斑面积(cm

防治效果(％)＝[(对照组病斑面积-处理组病斑面积)/对照组病斑面积]×100

从表4和图5可以看出，先在离体枝条上涂刷德干链霉菌F-04无菌发酵滤液再接种病原菌C.chrysosperma的处理组，病斑扩展较小，平均病斑面积为0.79cm

表4德干链霉菌F-04对核桃树腐烂病的离体枝条防治效果

实施例5：

本实施例涉及德干链霉菌F-04对8种病原菌的拮抗活性测定，

8种靶标病原菌为：核桃腐烂病菌(Cytospora nivea)、杏腐烂病菌(Cytosporaleucostoma)、苹果腐烂病菌(Valsa mali)、香梨腐烂病菌(Cytospora ambiens)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)、沙枣腐烂病菌(Cytospora chrysosperma)、核桃褐斑病菌(Alternaria alternata)。

将5mL的德干链霉菌F-04无菌发酵滤液与20mL冷却到50℃的PDA培养基混合倒入平板，制成抑菌测试平板；以不加德干链霉菌F-04无菌发酵滤液的PDA平板作为空白对照。

将直径5mm的上述靶标病原菌菌饼分别接入平板中央。每处理3个重复。各平板于26℃恒温培养，待对照平板菌丝即将长满时，测量各平板中靶标病原菌的菌落直径，按下列公式计算抑菌率：

抑菌率(％)＝[(对照平板菌落直径－测试平板菌落直径)/对照平板菌落直径]×100。结果如表5和图6所示。

从表5可以看出，菌株F-04对8种病原菌菌丝都有不同程度的抑制作用，而且抑制率均高于70％以上，对其中7种病原菌抑制率达80％以上。从图6可以看出，各病原菌靠近菌株F-04一侧的菌丝生长受到严重的限制，菌落边缘逐渐稀疏，菌落的颜色也发生一些变化。以上说明菌株F-04的抑制效果具有一定的广谱性，可用于多种植物病害的生物防治。

表5德干链霉菌F-04对8种供试靶标病原菌的抑菌率

实施例6：

本实施例涉及德干链霉菌F-04活性成分的稳定性测试实验，具体步骤如下：

1、热稳定性测试

将5个装有实施例2制备的10mL德干链霉菌F-04无菌发酵滤液的50mL离心管，分别置于55℃、65℃、75℃、85℃、95℃温度条件下水浴处理30min后取出，待无菌发酵滤液冷却至室温后，与融化的PDA培养基以1:10体积比混合倒平板，以室温放置的无菌发酵滤液为阳性对照(CK)，未添加无菌发酵滤液的PDA空白培养基为空白对照；

在各处理组(阳性对照和55℃、65℃、75℃、85℃、95℃温度处理组)及空白对照组平板的中央接种1枚直径5mm的新鲜核桃腐烂病病原菌C.chrysosperma菌饼；每个处理重复5次，26℃下恒温培养，待空白对照平板菌丝即将长满时，测量各平板中C.chrysosperma的菌落直径，按下列公式计算抑制率：

抑制率(％)＝[(空白对照组菌落直径－处理组菌落直径)/空白对照组菌落直径]×100，结果如图7所示。

从图7可以看出，德干链霉菌F-04无菌发酵滤液经5个温度的高温处理后，抑制率虽随温度升高而下降，但各处理组对C.chrysosperma菌丝生长的抑制率仍保持在80％以上，说明德干链霉菌F-04活性成分热稳定性好。

2、紫外光照射稳定性测试

将装有实施例2制备的10mL德干链霉菌F-04无菌发酵滤液的小三角瓶分别放置于紫外灯光下照射20min、30min、40min、50min、60min后，与融化的PDA培养基以1:10体积比混合倒板，以未经紫外照射的德干链霉菌F-04无菌发酵滤液为阳性对照(CK)，未添加德干链霉菌F-04无菌发酵滤液的PDA空白培养基为空白对照。在各处理组(阳性对照和紫外灯光下照射20min、30min、40min、50min、60min处理组)和空白对照组平板的中央接种1枚直径5mm的新鲜核桃腐烂病病原菌C.chrysosperma菌饼；每个处理重复5次，26℃下恒温培养，待空白对照平板菌丝即将长满时，测量各平板中C.chrysosperma的菌落直径，按下列公式计算抑制率，结果如图8所示。

抑制率(％)＝[(空白对照组菌落直径－处理组菌落直径)/空白对照菌落直径]×100

从图8可以看出，德干链霉菌F-04无菌发酵滤液分别经5个不同时长的紫外光照射处理后，抑制率虽随处理时长的升高而下降，但各处理对C.chrysosperma菌丝生长的抑制率仍保持在90％以上，说明德干链霉菌F-04活性成分抗紫外辐射稳定性好。

实施例7：

本实施例涉及德干链霉菌F-04促生效果测试。

1、德干链霉菌F-04对核桃和小麦穴盘苗生长的促生效果测试，具体步骤如下：

(1)准备供试植物材料：取核桃种子和小麦种子，经“75％乙醇表面消毒30s→无菌水漂洗3次”杀菌处理后，再经30℃温水浸种4-5h后，于28℃催芽。种子发芽后，播种于穴盘(32孔，6cm×4.5cm)中，播种深度l cm，每穴2-3粒种子。播种基质为蛭石:珍珠岩:泥炭:土壤体积比为1:1:1:1。

(2)穴盘苗促生处理：待幼苗长出2片子叶后，开始浇灌德干链霉菌F-04无菌发酵滤液稀释液(每L稀释液中含无菌发酵滤液150ml)，以同浓度液体高氏一号培养基稀释液浇灌为对照。每次每穴浇灌10ml、每5d浇灌一次。

(3)盆栽苗促生处理：

分别待核桃幼苗生长20d长出2片真叶、小麦幼苗生长8d长出2片真叶后，选取最适浓度的穴盘盆栽核桃和小麦幼苗移栽到塔里木大学节水灌溉试验田(花盆)，浇灌3次德干链霉菌F-04无菌发酵滤液稀释液(每升稀释液中含无菌发酵滤液150ml)，以同浓度液体高氏一号培养基稀释液浇灌为对照。每次每穴浇灌10ml、每5d浇灌一次。

待小麦幼苗移栽生长15d、核桃幼苗移栽生长30d后，分别随机选择5株幼苗测量干重、苗高、主根长、须根数等生物学指标分析生防菌珠F-04的促生作用，结果如表6-7和图9所示。

表6菌株F-04无菌发酵滤液对核桃促生性状指标

表7菌株F-04无菌发酵滤液对小麦促生性状指标

从图9及表6和7可以看出，德干链霉菌F-04无菌发酵滤液处理对核桃幼苗的主根长、须根数、叶片大小、干重等农艺指标有显著促进作用，对小麦幼苗的苗高、主根长等农艺指标有显著促进作用。