一种基于脱氧核酶联合CRISPR/Cas12a生物传感系统及其应用

技术领域

本发明属于分析检测技术领域，涉及一种基于脱氧核酶联合CRISPR/Cas12a新型生物传感系统及其在检测食源性致病菌大肠杆菌中的应用。

背景技术

近年来，食物中毒事件屡屡发生，食品安全问题正在敲响警钟，食源性疾病正严重损害着人类的生命健康。据世界卫生组织对全球食源性疾病负担的估算，全球每年有近10％的人口因食用受到污染的食品而患病，其中约有42万人因此死亡。在我国，近年来食源性疾病的发生情况也不容乐观，出现比例呈上升态势，约每7人中就有1人曾患过食源性疾病。因此，食源性疾病正是我们目前不可忽视的严峻挑战。多数的食源性疾病是由致病微生物引起的，其中，食源性致病细菌是致病微生物中污染食物的主力军。致病菌及其毒素可通过空气、土壤、水、患者的手或排泄物污染食品，直接或间接导致食用者发生食物中毒和人畜共患的传染病。

功能核酸作为细菌生物标志物和完整细菌细胞的识别元件，已经得到了越来越多的关注与研究。功能核酸被定义为一类具有靶向结合或催化功能的核酸分子，包括天然存在的核酶、核糖开关和人工合成的脱氧核酶和核酸适配体。1994年，当Breaker和Joyce报道了第一个催化DNA分子时，脱氧核酶(DNAzymes)领域诞生了。在所有的脱氧核酶中，催化RNA裂解的脱氧核酶(RNA-cleaving DNAzymes，RCDs)是迄今为止最大的一类催化DNA分子，应用最为广泛。微生物响应型RCDs也逐渐被发现，这些RCDs可以被微生物中极为复杂的靶标激活，其靶分子通常为病原微生物细胞表面的分子，细胞的特异性蛋白裂解物，或全细胞。李应福教授课题组在2011年发表的一项研究中率先提出了基于细胞特异性蛋白裂解物建立的RNA裂解荧光DNAzymes(RNAcleaving fluorescent DNAzymes，RFDs)的体外筛选程序，并命名为RFD-EC1。用于选择RNA切割荧光DNA酶的文库利用了具有核糖核苷酸的序列，两侧是荧光基团和淬灭基团，可以被大肠杆菌中存在的靶标特异性激活。裂解反应将荧光团和淬灭剂分离，从而产生可用于生物传感器开发的荧光信号。

新兴的CRISPR/Cas技术在病原菌检测、遗传疾病筛查、精准医疗等众多领域有很大的应用潜力。近年来，研究人员发现Cas12蛋白的酶切活性被激活后，除了对靶标核酸进行剪切外，还具有强大的非特异性核酸序列附带剪切活性，可实现10

目前，现有免扩增CRISPR生物传感技术仅能实现纳摩尔到亚皮摩尔级靶标核酸的检测，难以满足实际需求。为提高灵敏度，大多联合等温扩增技术预扩增后，再进行检测，但是扩增过程可能会引入非特异性扩增，造成假阳性。并且核酸扩增和靶标检测是两个独立的步骤，需要将扩增产物转移到检测系统中，在此过程中，很容易产生气溶胶和其他形式的污染。此外，基于Cas12a的病原菌检测方法高度依赖于特定的PAM序列，因此，crRNA的设计受到严重限制，其灵活性大大降低。为此，发展新的高灵敏检测平台，实现CRISPR/Cas生物传感技术免扩增现场快速定量检测病原菌是其实用化的关键。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种基于脱氧核酶联合CRISPR/Cas12a生物传感系统及其应用，本发明选择对靶标具有特异性识别能力的脱氧核酶作为分子识别元件，结合CRISPR/Cas12a系统作为信号放大元件，并以荧光信号输出的方式，构建一类新型核酸生物传感器，用于即时检测致病细菌中的大肠杆菌。

本发明目的是通过以下方式实现：

本发明提供一种基于脱氧核酶联合CRISPR/Cas12a生物传感系统，所述生物传感系统包括Cas12a蛋白、环状crRNA、RNA裂解的脱氧核酶的底部部分FS1、RNA裂解的脱氧核酶的脱氧核酶部分5’short、靶标、FQ-ssDNA探针。

进一步地，所述的环状crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

进一步地，RNA裂解的脱氧核酶的底部部分FS1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

进一步地，RNA裂解的脱氧核酶的脱氧核酶部分5’short的核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示。

进一步地，所述的靶标作为Cas12a-crRNA识别的目标分子，包括TS-7-2和5’FAMTS-7-2，TS-7-2的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

进一步地，所述的FQ-ssDNA探针的两端分别修饰FAM(荧光基团)和Dabcyl(猝灭基团)，ssDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

进一步地，底部部分FS1含RNA切割位点，可在靶标存在下发生断裂，与5’short经碱基互补配对后形成RCD，无需纯化，可直接用于后续的RCD-Cas12a检测实验。

进一步地，所述的生物传感系统包括4×筛选缓冲液、10×NEBuffer

进一步地，所述的10×NEBuffer

进一步地，所述的4×筛选缓冲液的组成为：200mM HEPES，600mM NaCl，60mMMgCl

本发明另一方面提供所述的生物传感系统在检测食品中的大肠杆菌中的应用。

本发明还提供利用所述的生物传感系统检测食品中的大肠杆菌的方法，包括以下步骤：

(1)将RNA裂解的脱氧核酶的底部部分FS1、RNA裂解的脱氧核酶的脱氧核酶部分5’short、4×筛选缓冲液和无菌无酶水混匀，70-100℃下加热1-5min，室温放置5-30min；

(2)加入待检测样品溶液，混匀，然后加入10×NEBuffer

进一步地，步骤(1)中所述的底部部分FS1的浓度为1-5μM，脱氧核酶部分5’short的浓度为1-5μM，反应体系的体积为20-100μL。

进一步地，步骤(2)中所述的待检测样品溶液的体积为10-50μL。

进一步地，步骤(2)中所述的Cas12a的浓度为100-200nM，crRNA浓度为100-200nM，靶标的浓度为50-100nM，FQ-ssDNA探针的浓度为100-500nM，反应体系的体积为100-200μL。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1.本发明的检测方法采用反式结构RCD-EC1，将底部部分FS1和脱氧核酶部分5’short结合形成反式结构RCD，用于靶标CIM-EC的识别检测，将反式结构RCD-EC1与CRISPR/Cas12a系统联合，实现对食源性致病菌大肠杆菌的检测，无需合成，耗时短，从而降低检测成本和劳动力。

2.本发明的检测方法采用一锅法检测系统，简单快速，准确灵敏，能同时定性和定量分析食源性致病菌中的大肠杆菌。

3.本发明方法具有高通量检测的优势，利用酶标仪96孔板，具有一次性对多个样本同时进行检测的潜力，提高了对临床样本的检测可能性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例，下面将对实施例涉及的附图进行简单地介绍。

图1实施例1中的基于RCD-EC1的CRISPR/Cas12a系统检测大肠杆菌方法的技术路线图。

图2实施例2中所述ssDNA1～7对Cas12a系统顺式裂解活性的调控作用的凝胶成像图。

图3实施例2中所述ssDNA1～7对于调控Cas12a反式裂解活性的荧光动力学表征。

图4实施例2中70nt-A

图5实施例4中所述反式结构的RCD可成功被激活示意图；其中，a为反式结构RCD工作原理图，b为反式结构的RCD被大肠杆菌靶标(CIM-EC)成功激活的凝胶电泳成像图。

图6实施例5中所述底物FS1对Cas12a系统顺式裂解活性的调控作用的凝胶成像图(a)和荧光动力学表征(b)。

图7实施例6中所述基于RCD-EC1的CRISPR/Cas12a检测系统一锅法反应和分开反应的凝胶成像图(a)和荧光动力学表征(b)。

图8实施例6中所述基于RCD-EC1的CRISPR/Cas12a生物传感器对于检测不同菌属的选择性(a)和不同浓度大肠杆菌的灵敏度(b)。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。本实施例包括探究不同长度DNA序列对Cas12a系统的调控作用、细菌培养及CIM的制备、反式结构RCD的激活验证、RCD-EC1联合CRISPR/Cas12a检测系统的可行性分析、RCD-EC1联合CRISPR/Cas12a检测系统的特异性表征、RCD-EC1联合CRISPR/Cas12a检测系统的灵敏度表征、构建基于RCD-EC1联合CRISPR/Cas12a系统检测食源性致病菌的新型生物传感方法。

表1本发明中使用的寡核苷酸序列

注：(1)上述核酸序列均由上海生工生物技术公司合成并纯化；(2)F＝

fluorescein-labeled dT,Q＝DABCYL-labeled dT,rA＝adenineribonucleotide，An为n个A碱基重复。

表2本发明中使用的试剂名称和来源

注：所有试剂均为分析纯，所用水均为超纯水(～18.2MΩ·cm)。

表3本发明中使用的仪器与型号

下述实施例中的Cas12a反应缓冲液(10×NEBuffer

下述实施例中的4×筛选缓冲液(Selection buffer，SB)：200mM HEPES，600mMNaCl，60mM MgCl

下述实施例中的1×筛选缓冲液(Selection buffer,SB)：50mM HEPES，150mMNaCl，15mM MgCl

下述实施例中的EDTA溶液(pH 8.0，0.5M)：称量46.5g乙二胺四乙酸二钠盐，溶于220mL超纯水中，加入NaOH调pH至8.0，并使用超纯水将溶液定容至250mL，混匀，4℃保存。

下述实施例中的10×TBE缓冲液：称量108.0g Tris-base，55.0g硼酸，20mL 0.5MEDTA溶液，加入900mL超纯水溶解，并使用超纯水将溶液定容至1L，混匀，4℃保存。

下述实施例中的10％dPAGE：称取420.4g尿素，加入100mL 10×TBE缓冲液，250mL40％29:1丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺溶液，加入超纯水搅拌直至所有尿素溶解，并使用超纯水将溶液定容至1L，混匀，4℃保存。

下述实施例中的10％ APS溶液：称取5.0g APS溶于45mL超纯水中，最后使用超纯水将溶液定容至50mL，混匀，4℃保存。

下述实施例中的LB培养基(每100mL)：加入0.5g酵母粉，1g NaCl，1g蛋白胨，使用超纯水定容至100mL，121℃高压蒸汽灭菌15min。

实施例1基于RCD-EC1联合Cas12a系统构建大肠杆菌检测方法

本发明的技术路线如图1所示，主要包括以下方面：

(1)通过设定不同长度、不同浓度的DNA序列探究其对CRISPR/Cas12a系统顺式裂解和反式裂解的调控作用，进行Cas12a酶促动力学分析，以此初步构建基RCD-EC1的CRISPR/Cas12a生物传感系统的检测方法；

(2)进行反式结构的催化RNA裂解的脱氧核酶(RNA-cleaving DNAzyme，RCD)的激活验证，以确保DNAzyme可被大肠杆菌靶标成功激活，发挥其分子识别作用；

(3)探究基于RCD-EC1的CRISPR/Cas12a生物传感系统对于检测大肠杆菌的可行性，并进行条件优化；

(4)对优化之后的生物传感检测方法进行特异性表征和灵敏度表征分析，探究其对于不同菌属的CIMs的选择性以及不同浓度CIM-EC的特异性，验证其可行性，并应用于临床样本的检测，与培养法结果对比，验证其实际应用性能。

实施例2探究DNA序列对Cas12a系统的调控作用

2.1探究DNA序列对Cas12a系统顺式裂解的调控

于EP管中加入2μL 10×NEBuffer

使用10％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(10％dPAGE)进行DNA条带分析，10％dPAGE体系各成分见表4。具体操作步骤为：将1.5mm制胶条、1.5mm梳子和制胶玻璃板用无水乙醇清洗并晾干，按照玻璃板-胶条-玻璃板的安装方式固定。按表4的体系配制制胶液，混匀后迅速灌入固定好的制胶板中，插入梳子。等待胶完全凝固，拔出梳子并用超纯水冲洗上样孔。将制好的凝胶固定在垂直电泳仪上，加入50mL1×TBE缓冲溶液浸泡。将20μL上述反应的DNA溶液与等量的2×Loading buffer充分混匀并离心，90℃加热1min后上样。设置电流为30mA。

表4变性聚丙烯酰胺凝胶电泳体系

实验结果如图2所示，不同长度的DNA序列对Cas12a系统的顺式裂解具有调控作用，随着DNA序列长度的增加，同等浓度的不同序列，序列更长时，抑制效果更著。

2.2探究DNA序列对Cas12a系统反式裂解的调控

于EP管中加入10μL 10×NEBuffer

对照实验：除加入0.75μL 10μM靶标TS-7-2外，其余步骤与上述相同。

实验结果如图3所示，观察发现12nt～30nt的序列，随着浓度的增加，抑制效果不明显，当40nt DNA(S4)开始抑制效果愈加显著，5μM即可完全抑制CRISPR/Cas12a的反式裂解能力，与顺式裂解反应相一致。并且，当序列长度增加至70nt时，1μM即可达到最佳的抑制效果，因为我们认定不同长度的DNA序列对于CRISPR/Cas12a系统的顺式裂解和反式裂解具有调控作用，并且具有浓度依赖性和长度依赖性。

2.3探究70nt的DNA序列对于CRISPR/Cas12a系统调控作用的通用性

(1)顺式裂解：于EP管中加入2μL 10×NEBuffer

(2)反式裂解：于EP管中加入10μL 10×NEBuffer

对照实验：除加入0.75μL 10μM靶标TS-7-2外，其余步骤与上述相同。

实验结果如图4所示。结果表明：70nt的DNA序列对于顺式裂解和反式裂解均有调控作用，并且70nt-T

实施例3细菌培养及CIM的制备

3.1细菌培养

配制30mL LB培养基，溶解于50mL锥形瓶中，121℃高压蒸汽灭菌15min，置于生物安全柜中紫外杀菌备用。接种10μL冻存的大肠杆菌菌液到锥形瓶中，37℃、200rpm培养复苏。细菌复苏之后再次接种(10μL)至新的30mL LB培养基中二次复苏。将二次复苏的大肠杆菌转接至新的30mL LB培养基中，培养至OD

3.2CIMs的制备

取1mL菌液(OD

制取CIMs包括大肠杆菌BL21(CIM-EC)、铜绿假单胞(CIM-PA)、鲍曼不动杆菌(CIM-AB)、伴放线防线杆菌(CIM-AA)、金黄色葡萄球菌(CIM-SA)和蜡样芽孢杆菌(CIM-BC)。

实施例4反式结构RCD的活性验证

于EP管中加入2.5μM FS1、50μM 5’short、5μL 4×SB，加入无菌无酶水补齐至20μL，充分混匀并离心，90℃加热2min，室温放置10min，加入10μL CIM-EC，迅速吸打混匀，并室温孵育60min。反应结束后，并用10％dPAGE进行条带分析。

对照实验：除加入10μL CIM-EC外，其余步骤与上述相同。

实验结果如图5所示，证明反式作用的RCD可被大肠杆菌CIM(CIM-EC)激活。

实施例5反式结构RCD的条件优化

(1)顺式裂解：于EP管中加入2μL 10×NEBuffer

(2)反式裂解：于EP管中加入10μL 10×NEBuffer

对照实验：除加入0.75μL 10μM靶标TS-7-2外，其余步骤与上述相同。

实验结果如图6所示，在顺式裂解实验中，5μM能达到86％的抑制效果，而对于反式裂解活性，2.5μM即可达到100％的抑制效果，这可能是CRISPR-crRNA二元复合体在靶标存在下开启的反式裂解是多次周转，伴随多次裂解的缘故。因此，确定反应体系中底物FS1浓度为2.5μM。

实施例6基于RCD-EC1的CRISPR/Cas12a新型生物传感检测方法分析

6.1基于RCD-EC1的CRISPR/Cas12a检测系统优化

一锅法：于EP管中加入2.5μM FS1、2.5μM 5’short、12.5μL 4×SB，加入无菌无酶水补齐至50μL，充分混匀并离心，90℃加热2min，室温放置10min，加入50μL不同菌属的CIMs后迅速吸打混匀。继续加入10μL 10×NEBuffer

两步法：于EP管中加入2.5μM FS1、2.5μM 5’short、12.5μL 4×SB，加入无菌无酶水补齐至50μL，充分混匀并离心，90℃加热2min，室温放置10min，加入50μL不同菌属的CIMs后迅速吸打混匀，室温孵育60min。反应结束后继续加入10μL 10×NEBuffer

对照实验：除加入50μL CIMs外，其余步骤与上述相同。

实验结果如图7所示，凝胶电泳成像图和实时荧光响应均显示一锅法比两步反应效果更佳，因此后续的实验均采用一锅法进行。

6.2基于RCD-EC1的CRISPR/Cas12a检测系统的选择性

于EP管中加入2.5μM FS1、2.5μM 5’short、12.5μL 4×SB，加入无菌无酶水补齐至50μL，充分混匀并离心，90℃加热2min，室温放置10min，加入12.5μL不同菌属的CIMs后迅速吸打混匀。继续加入10μL 10×NEBuffer

对照实验：除加入CIMs外，其余步骤与上述相同。

实验结果如图8a所示，分别检测了RCD-CRISPR/Cas12a生物传感器对含大肠杆菌在内的6种不同细菌产生的CIMs的响应，仅大肠杆菌的CIM能够激活DNAzyme引发切割，这表明本发明中的生物传感器选择性良好。

6.3基于RCD-EC1的CRISPR/Cas12a检测系统的灵敏度

首先用1×SB对CIM-EC进行梯度稀释，分别制得大肠杆菌终浓度为1、10

于EP管中2.5μM FS1、2.5μM 5’short、12.5μL 4×SB，加入无菌无酶水补齐至50μL，充分混匀并离心，90℃加热2min，室温放置10min，加入50μL不同浓度的CIM-ECs后迅速吸打混匀。继续加入10μL 10×NEBuffer

对照实验：除加入50μL CIM-EC外，其余步骤与上述相同。

实验结果如图8b所示，本发明中的生物传感器可在120min内检测到低至5×10

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。