一种提升重组解脂耶氏酵母天麻素产量的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是指一种提升重组解脂耶氏酵母天麻素产量的方法。

背景技术

天麻素，也称4-羟甲基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷，是我国著名中药材天麻的主要生物活性成分，具有较好的镇静和安眠作用，能缓解神经衰弱、失眠、头痛等症状，被广泛用于临床治疗。同时，天麻素还具有改善记忆、抗炎、抗氧化等功能，具有良好的市场和应用前景。目前，工业上天麻素的生产方法主要有化学合成法和植物提取法。化学合成法是以葡萄糖、对甲酚、醋酸酐等为前体通过一系列化学反应合成天麻素，然而该方法存在环境污染严重、难纯化、成本高等问题。植物提取法是从天麻根茎中萃取获得天麻素，但是天麻根茎中天麻素含量极低(小于0.7％)，且植物提取法具有不可持续、资源有限、受季节等环境因素影响大等缺陷，同时当前的农业育种和种植技术也不足以增加天麻的供应。

微生物由于生长迅速，培养条件简单，具备强大的生产能力，能够利用可再生的资源高效转化生产高价值化学品和各种天然产物。此外，经过理性设计的工程菌株能合成单一目标产物，减少了多种结构类似物的合成，可以避免植物提取过程中目标产物分离纯化困难的问题，同时能够减少有机溶剂的使用，降低纯化过程对环境的污染。大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、解脂耶氏酵母等多种微生物已被开发利用，通过基因编辑技术被改造成重要化合物的生产底盘。相比于植物提取法和化学合成法，微生物法合成天麻素不占用耕地，降低了气候变化对生产的影响，可实现目标产物的持续供应，同时还减少了对环境的破坏和资源的浪费。因此，构建微生物细胞工厂生产天麻素是一种绿色、可持续的新方法。

目前，微生物合成天麻素是由糖基转移酶(UGT)转移葡萄糖基到底物对羟基苯甲醇的4-OH位置上形成的，其中UDP-葡萄糖(尿苷二磷酸葡萄糖)是糖基供体，酵母中的UDP-葡萄糖前体供应在葡萄糖苷的生物合成中起着至关重要的作用。对UDP-葡萄糖合成的代谢流进行调控，以提高微生物转化对羟基苯甲醇产天麻素产量，对于天麻素的高效生产具有重要的意义，但是，UDP-葡萄糖合成天麻素过程中发现存在降解为对羟基苯甲醇的问题，对天麻素产量有较大影响。因此，亟需对天麻素降解的关键基因进行挖掘，从而进一步提升UDP-葡萄糖合成天麻素的产量。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种提升重组解脂耶氏酵母天麻素产量的方法。本发明挖掘解脂耶氏酵母中天麻素降解相关基因，对解脂耶氏酵母中的20种葡萄糖苷酶进行了表征，探究敲除不同的葡萄糖苷酶基因对天麻素产量的影响，发现敲除葡萄糖苷酶基因YALI0A19074g和YALI0B14289g后天麻素大量积累。本发明还构建了一株对天麻素降解通路解除的重组解脂耶氏酵母菌株YliGT6，对解脂耶氏酵母出发菌株进行构建天麻素代谢通路，增强UDP-葡萄糖供给等操作，最后敲除葡萄糖苷酶基因YALI0A19074g和YALI0B14289g。

本发明的第一个目的是提供一种高产天麻素的重组解脂耶氏酵母的构建方法，包括以下步骤：

步骤S1、将天麻素合成通路基因UGT、CAR、Ubic和PAR整合至出发菌株的YALI0E18568g位点，UGT的核苷酸序列见NCBI Sequence ID:NP_001307116.1，CAR的核苷酸序列见NCBI Sequence ID:XP_955820.1，Ubic的核苷酸序列见NCBI Sequence ID:SMH61768.1，PAR的核苷酸序列见NCBI-GeneID:2908335；

步骤S2、将解除反馈抑制的3-脱氧-7-磷酸庚糖酸合酶DAHP基因EcaroG

步骤S3、将天麻素合成通路基因UGT、CAR、Ubic和PAR整合至出发菌株的YALI0A16379g位点；

步骤S4、将天麻素合成通路基因UGT、CAR、Ubic和PAR整合至出发菌株的YALI0C08701g位点；

步骤S5、将UDP-葡萄糖供给相关基因PGM2、UGP1和AK9整合至出发菌株的YALI0B10153g位点，PGM2的核苷酸序列见NCBI Sequence ID:XP_503444，UGP1的核苷酸序列见NCBI Sequence ID:XP_499685，AK9的核苷酸序列见NCBI Sequence ID:XP_505197；

步骤S6、敲除或沉默出发菌株的葡萄糖苷酶编码基因YALI0A19074g和YALI0B14289g。

进一步地，出发菌株为解耶氏酵母po1f。

进一步地，出发菌株敲除Ku70基因。

本发明的第二个目的是提供一种高产天麻素的重组解脂耶氏酵母，由上述方法制备得到。

本发明的第三个目的是提供一种包含上述重组解脂耶氏酵母的微生物制剂。

本发明的第四个目的是提供一种产天麻素的方法，将上述重组解脂耶氏酵母或上述微生物制剂加入发酵体系中。

进一步的，发酵时间为96-120小时。

进一步地，发酵培养基为YPD培养基。

本发明的第五个目的是提供一种提升重组解脂耶氏酵母天麻素产量的方法，在产天麻素的重组解脂耶氏酵母中敲除或沉默葡萄糖苷酶编码基因YALI0A19074g和YALI0B14289g。

进一步地，重组解脂耶氏酵母敲除Ku70基因。

优选地，重组解脂耶氏酵母在Ku70基因位点表达糖基转移酶编码基因UGT。

本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：

本发明通过挖掘解脂耶氏酵母中天麻素降解相关基因，对解脂耶氏酵母中的20种葡萄糖苷酶进行了表征，发现敲除葡萄糖苷酶基因YALI0A19074g和YALI0B14289g后天麻素大量积累。本发明还构建了一株对天麻素降解通路的重组解脂耶氏酵母菌株YliGT6，对解脂耶氏酵母出发菌株进行构建天麻素代谢通路，增强UDP-葡萄糖供给等操作，最后敲除葡萄糖苷酶基因YALI0A19074g和YALI0B14289g，该重组菌株具有优化的UDP-葡萄糖流向天麻素的合成途径，天麻素滴度提高到6.0g/L。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中

图1是本发明实施例1中质粒pUrloxp的图谱；

图2是本发明实施例3中敲除内源葡萄糖苷酶后天麻素降解情况的表征；

图3是本发明实施例1中质粒pUrloxp-YALI0A19074g的图谱；

图4是本发明实施例1中质粒pUrloxp-YALI0B14289g的图谱；

图5是本发明实施例4中重组菌株YliGT5和YliGT6的发酵上清液天麻素HPLC色谱图；

图6是本发明实施例4中重组菌株YliGT5和YliGT6的天麻素发酵产量。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

OD

天麻素检测：样品在测定前需要进行处理，首先经12000rpm离心10min后，取上清1mL，然后将其过水系滤膜(孔径为0.22μm)，去除杂质，进行液相检测。高效液相色谱(HPLC)检测参数、色谱柱、检测条件为：岛津LC-40，UV-VIS检测器，ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱(4.6×100mm，3.5μm，Agilent)；流动相为10％甲醇(v/v)；流速0.7mL/min；紫外检测器，检测波长为225nm；进样量设置为10μL；柱温设置为35℃。将天麻素标准品配置5个梯度浓度，并检测所对应的响应值，获得浓度与吸光值的标准曲线，相关系数R

培养基：种子培养基包括10g/L酵母粉、20g/L蛋白胨、80g/L无水葡萄糖。发酵培养基包括10g/L酵母粉、20g/L蛋白胨、80g/L无水葡萄糖、10ml/L微量金属元素。微量金属元素包括4.0g/L FeSO

实施例1：重组质粒的构建

(1)使用Avr II和Sal I限制性内切酶将实验室保藏的质粒pUrloxp(序列如SEQID NO.1所示，图谱如图1所示)线性化为载体；以解脂耶氏酵母基因组为模板，Glu1-DwF/Glu1-DwR和Glu1-UpF/Glu1-UpR为引物，扩增获得带有同源臂的Glu1片段；随后利用

表1敲除的糖苷酶信息

(2)按照步骤(1)方法，以解脂耶氏酵母基因组为模板和表2中的引物，扩增获得带有糖苷酶基因的同源臂Glu1_Up、Glu1_Dw、Glu2_Up、Glu2_Dw、Glu3_Up、Glu3_Dw、Glu4_Up、Glu4_Dw、Glu5_Up、Glu5_Dw、Glu6_Up、Glu6_Dw、Glu7_Up、Glu7_Dw、Glu8_Up、Glu8_Dw、Glu9_Up、Glu9_Dw、Glu10_Up、Glu10_Dw、Glu11_Up、Glu11_Dw、Glu12_Up、Glu12_Dw、Glu13_Up、Glu13_Dw、Glu14_Up、Glu14_Dw、Glu15_Up、Glu15_Dw、Glu16_Up、Glu16_Dw、Glu17_Up、Glu17_Dw、Glu18_Up、Glu18_Dw、Glu19_Up、Glu19_Dw、Glu20_Up和Glu20_Dw片段；使用AvrII和Sal I限制性内切酶将实验室保藏的质粒pUrloxp线性化为载体，利用

表2引物序列

实施例2：重组菌株的构建

(1)以解脂耶氏酵母po1f为原始菌株，将po1f菌株在2mL的YPD培养基中培养至指数生长期(16-24h)，收集1mL的发酵液中的po1f菌体，离心弃上清后，加入含90μL的50％体积的PEG4000溶液，5μL醋酸锂(2M)，5μL的单链DNA(鲑鱼精子)和5μL的糖苷酶敲除框(由AvrII酶切实施例1(2)中获得的重组质粒Purloxp-ylGlu1-20得到)，混匀后在37℃下孵育1h后，涂布尿嘧啶缺陷型平板(CSM-URA)，筛选得到得到敲除糖苷酶的重组工程菌YliGLD1-YliGLD20。

表3葡萄糖苷酶与对应重组菌株

实施例3：葡萄糖苷酶的表征

(1)挑取实施例2中得到的重组解脂耶氏酵母YliGLD1-YliGLD20，接种于种子培养基，在温度为30℃、转速为220rpm的条件下培养48h，得到重组解脂耶氏酵母种子液；

(2)将步骤(1)得到的重组解脂耶氏酵母种子液以1体积％的接种量接种至YPD发酵培养基中(含1g/L的天麻素)，在温度为30℃，转速为220rpm的条件下进行发酵培养120h，发酵结束后通过天麻素测定方法检测发酵液中天麻素的含量。结果如图2所示，敲除葡萄糖苷酶YALI0A19074p(Glu6，敲除框序列如SEQ ID NO.2所示，质粒如图3所示)和YALI0B14289p(Glu9，敲除框序列如SEQ ID NO.3所示，质粒如图4所示)后天麻素为明显降解，说明这两种葡萄糖苷酶参与了天麻素的降解。

实施例4：天麻素降解优化菌株的构建

以Y.lipolytica菌株po1k为出发菌株，参照Gao S.,Tong Y.,Zhu L,etal.Iterative integration of multiple-copy pathway genes in Yarrowialipolytica for heterologousβ-carotene production[J]。文献提到的方法敲除Ku70基因，得到衍生菌株po1fk，之后依次进行以下步骤：

(1)将UGT(NCBI Sequence ID:NP_001307116.1)、CAR(NCBI Sequence ID:XP_955820.1)、Ubic(NCBI Sequence ID:SMH61768.1)、PAR(NCBI-GeneID:2908335)基因过表达整合至菌株po1fk的YALI0E18568g位点，得到重组菌株YliGT1；

(2)在重组菌株YliGT1的基础上，过表达DAHP酶关键调控基因EcaroG

(3)在重组菌株YliGT2的基础上，将上述UGT、CAR、Ubic和PAR基因过表达整合至YALI0A16379g位点，得到重组菌株YliGT3；

(4)在重组菌株YliGT3的基础上，将上述UGT、CAR、Ubic和PAR基因过表达整合至YALI0C08701g位点，得到重组菌株YliGT4；

(5)在重组菌株YliGT4的基础上，将增强UDP-葡萄糖供给的三基因ylPGM、ylUGP1和ylAK9整合至YALI0B10153g位点，得到重组菌菌株YliGT5，ylPGM2的核苷酸序列见NCBISequence ID:XP_503444，ylUGP1的核苷酸序列见NCBI Sequence ID:XP_499685，ylAK9的核苷酸序列见NCBI Sequence ID:XP_505197；

(6)在重组菌株YliGT5的基础上，将上述葡萄糖苷酶YALI0A19074p(Glu6，敲除框序列如SEQ ID NO.2所示，质粒如图3所示)和YALI0B14289p(Glu9，敲除框序列如SEQ IDNO.3所示，质粒如图4所示)进行敲除，得到重组菌株YliGT6；

实施例5：天麻素发酵生产

(1)挑取实施例4中得到的重组解脂耶氏酵母，接种于种子培养基，在温度为30℃、转速为220rpm的条件下培养48h，得到重组解脂耶氏酵母种子液；

(2)将步骤(1)得到的重组解脂耶氏酵母种子液YliGT5以1体积％的接种量接种至发酵培养基中，在温度为30℃，转速为220rpm的条件下进行发酵培养120h，发酵结束后通过天麻素测定方法检测发酵液中天麻素的含量，结果如图5所示。

(3)按照实施例1、2的构建方法，获得敲除YliGT5中的Glu6和Glu9基因，得到重组菌株YliGT6；

(4)按照上述方法得到发酵液，发酵结束后通过天麻素测定方法检测重组菌株YliGT6发酵液中天麻素的含量。结果如图6所示，敲除葡萄糖苷酶YALI0A19074p(Glu6)和YALI0B14289p(Glu9)后，消除了天麻素的降解，并进一步将天麻素滴度提高到6.0g/L。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。