一种用于检测膀胱癌的试剂组合、试剂盒及其用途

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，具体地，属于膀胱癌检测领域，更具体地，涉及膀胱癌基因标志物的甲基化水平的检测。

背景技术

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，也是全身十大常见肿瘤之一，占我国泌尿生殖系肿瘤发病率的第一位。在我国，近80％的膀胱癌被诊断为非肌层浸润性膀胱癌(non-muscle-invasive bladder cancer，NMIBC)，行经尿道膀胱肿瘤切除术后预后较好，但其中70％的患者术后会出现肿瘤复发，15％的患者分期和分级会发生进展；其余患者被诊断为肌层浸润性膀胱癌 (muscle-invasive bladder cancer，MIBC)，易发生远处转移，具有较高的死亡风险。因此，膀胱癌患者术后通常需要多次复查和膀胱灌注治疗，费用昂贵。目前，膀胱癌的术前诊断和术后复发监测主要依赖有创的膀胱镜检查，不但给患者带来疼痛，还可能导致尿路损伤和感染等，患者依从性较差。寻找无创、准确、稳定、有效的膀胱癌分子标志物对膀胱癌进行早期筛查、诊断和复发检测具有重要意义。肿瘤标志物检测是近年发展起来的用于检测疾病的方法，而寻找准确、稳定、有效的膀胱癌分子标志物对膀胱癌进行早期诊断、早期治疗具有重要意义。

而随着科学界对肿瘤的认识逐渐深入，越来越多的研究证实细胞表观遗传水平的改变是肿瘤发生与发展的关键事件。DNA甲基化、组蛋白修饰及miRNA 表达异常均属于表观遗传学改变，而肿瘤发生的核心环节也与DNA异常甲基化相关。DNA甲基化检测稳定性好，易于检测且其异常程度常与癌症的进展相关，是最具肿瘤早筛潜力的标志物。

因此，本领域需求一种基于DNA甲基化检测的兼具高灵敏度高特异性的膀胱癌诊断产品，在膀胱癌的早期阶段即能进行检出。

发明内容

本发明从UCSC Xena网站的TCGA数据集(https://tcga.xenahubs.net)和美国国立生物技术信息中心(NCBI)的GEO数据库中共收集到413例癌组织、 231例癌旁组织或正常对照组织和656例健康全血甲基化数据。以膀胱癌和对照数据进行差异分析，通过大量研究，申请人发现某些甲基化位点的甲基化水平与膀胱癌有着密切的联系。

第一方面，本发明提供一种用于检测膀胱癌的试剂组合，所述试剂组合包括用于以下甲基化位点的检测试剂：cg13314394。

使用本发明的试剂组合，在组织样本中，均能以至少0.9524的特异性和 0.8305的灵敏度以及0.9396的曲线下面积对膀胱癌进行预测。而在尿液游离 DNA样本中，所有试剂组合均能以至少0.9048的特异性和0.8389的灵敏度以及0.9478的曲线下面积对膀胱癌进行预测，本发明试剂组合以较少的标志物就能够在临床上以高灵敏度和好特异性对膀胱癌进行检测，成本和时间均得到节约；在临床上，在膀胱癌恶变的早期阶段就能灵敏和特异性地检出。

在一些具体的实施方案中，所述试剂组合进一步包括用于检测以下任意至少一个的甲基化水平的检测试剂：

SPATS2、PARP4、cg00206063，以及cg03278514。

所述试剂组合进一步包括用于检测以下任意至少两个的甲基化水平的检测试剂：

SPATS2、PARP4、cg00206063，以及cg03278514。

所述试剂组合进一步包括用于检测以下任意至少三个的甲基化水平的检测试剂：

SPATS2、PARP4、cg00206063，以及cg03278514。

所述试剂组合进一步包括用于检测以下四个甲基化水平的检测试剂：

SPATS2、PARP4、cg00206063，以及cg03278514。

在一些具体的实施方案中，所述甲基化水平的检测试剂可以是检测整个基因平均甲基化水平的检测试剂。

在一些具体的实施方案中，所述甲基化水平的检测试剂也可以是检测一个基因片段的平均甲基化水平的检测试剂。

在一些具体的实施方案中，所述甲基化水平的检测试剂也可以是检测一个基因启动子区域或其片段的平均甲基化水平的检测试剂。

在一些具体的实施方案中，所述甲基化水平的检测试剂还可以是检测基因的一个或多个甲基化位点的检测试剂。

在一些具体的实施方案中，所述试剂组合进一步包括用于检测SPATS2基因甲基化位点cg06712013的甲基化水平的检测试剂。

在一些具体的实施方案中，所述试剂组合进一步包括用于检测PARP4基因甲基化位点cg20765408的甲基化水平的检测试剂。

在一个具体的实施方案中，所述试剂组合包括用于检测以下甲基化水平的检测试剂：cg13314394、cg00206063、cg06712013、cg20765408和cg03278514。

使用上述方案的试剂组合，能够以更高的灵敏度和更好的特异性对膀胱癌进行检测；在临床上，在膀胱癌恶变的早期阶段就能灵敏和特异性地检出。

在一些实施方案中，使用本发明的检测试剂，可以对样本中所存在的相应基因的甲基化水平进行检测。

在本发明中，“样本”为选自个体的生物样本。具体地，例如，选自细胞系、组织学切片、组织活检/石蜡包埋的组织、体液、粪便、结肠流出物、尿液、血浆、血清、全血、分离的血细胞、从血液中分离的细胞，或其组合。

优选地，本发明的“样本”为尿液，即尿液中的游离DNA。

尿液中的游离DNA能用作检测肿瘤，具有对病人伤害小，特异性好等特点。但是由于其在尿液中的含量极低，因此，在用于癌症检测时普遍存在灵敏度较低的问题。使用本发明的检测试剂，能够使用尿液中的游离DNA作为样本进行检测，具有较高的灵敏度和特异性。

在本发明中，“检测试剂”指的是对样本中的基因的甲基化水平进行检测的试剂。其中，所述甲基化水平是通过扩增-测序、芯片、甲基化荧光定量PCR 的方式测量。

在一些具体的实施方案中，检测试剂包括但不限于核酸引物、测序Tag序列，用于通过扩增-测序测量甲基化水平。

在一个具体的实施方案中，所述扩增-测序是通过将样本中的核酸进行重亚硫酸盐处理，随后构建预文库，再构建终文库，最后进行测序评价的方法进行的。

在一些具体的实施方案中，检测试剂包括但不限于芯片，所述芯片是甲基化芯片，所述甲基化芯片具有与甲基化区域特异性结合的探针。所述芯片可以是包括但不限于例如安捷伦的Human CpG Island Microarrays和Human DNA Methylation Microarrays、Illumina的Infinium HumanMethylation27 BeadChip、 Infinium HumanMethylation450BeadChip和GoldenGate Methylation Assay以及 Roche NimbleGen的Human DNAMethylation 2.1M Deluxe Promoter Array、 Human DNA Methylation Array等，用于通过芯片测量甲基化水平。

在一些具体的实施方案中，检测试剂包括但不限于核酸引物以及核酸探针，用于通过甲基化荧光定量PCR测量甲基化水平。

进一步地，所述检测试剂还包括内标引物以及内标探针。

在一些具体的实施方案中，上述试剂组合还可以包括其余的试剂，具体地，例如，各种对样本进行前处理或者预处理所需要的试剂。例如，提取样本核酸的样本释放剂，纯化样本核酸的纯化剂，转化所用的重亚硫酸盐或亚硫酸氢盐等。

进一步地，上述试剂组合还包括提取尿液游离DNA的试剂。

第二方面，本发明提供了上述试剂组合在制备用于检测膀胱癌的试剂盒中的用途。

在一个具体的实施方案中，上述试剂组合在制备用于检测膀胱癌的试剂盒中的用途，其中，所述试剂组合为以下甲基化位点的检测试剂：cg13314394。

进一步地，本发明提供了上述试剂组合在制备使用尿液游离DNA检测膀胱癌的试剂盒中的用途。

第三方面，本发明提供了一种用于检测膀胱癌的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的试剂组合。

进一步地，所述试剂盒还包括但不限于提取核酸的试剂、纯化核酸的试剂、重亚硫酸盐、T4多聚核苷酸激酶、T4连接酶中的至少一种。

进一步地，所述提取核酸的试剂是提取组织DNA的试剂和尿液游离DNA 的试剂。

进一步地，所述提取核酸的试剂是提取尿液游离DNA的试剂。

附图说明

图1～3为单基因及其组合甲基化水平在组织中鉴别癌与非癌的ROC图；

图4～6为单基因及其组合甲基化水平在尿液中鉴别癌与非癌的ROC图。

具体实施方式

下文将结合具体实施方案和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方案和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

实施例1、甲基化基因的筛选

本发明从UCSC Xena网站的TCGA数据集(https://tcga.xenahubs.net)和美国国立生物技术信息中心(NCBI)的GEO数据库中共收集到413例癌组织、 231例癌旁组织或正常对照组织和656例健康全血甲基化数据。以膀胱癌和对照数据进行差异分析，对差异位点进行物理位置和基因信息注释，为保证筛选片段具有一致的甲基化水平，甲基化基因片段的筛选需要同时符合以下几点要求：1)要求所选基因片段具有不少于2个的相邻位点具有一致的甲基化水平；2)以膀胱癌和癌旁组织或正常对照组织进行差异分析，挑选膀胱癌样品中一致性高差异高甲基化的基因片段作为候选靶基因；3)以膀胱癌和健康样本全血甲基化检测数据进行差异分析，挑选膀胱癌差异高甲基化的基因片段；4)最后再从中进行逐个甲基化位点的分析，从而得出候选甲基化位点。

实施例2、临床样本的基因甲基化水平检测

收集样本的尿液各10ml，用于检测分析DNA甲基化标记物在样本中的甲基化水平。实验过程如下所述：

1、样本制备

本发明的样本制备是通过VAHTS Free-Circulating DNA Maxi Kit提取4ml 尿液上清，45μL洗脱液洗脱。提取的游离核酸需满足以下质控条件：提取的核酸总量大于20ng。

2、文库制备

本发明将质控合格的全部游离核酸采用EZ DNA Methylation-Lightning TM Kit进行重亚硫酸盐处理。随后，重亚硫酸盐处理后的样本DNA采用单链建库方法构建预文库，预文库质检合格后通过液态芯片杂交捕获富集目标区域而完成终文库的构建。

预文库构建步骤：1)磷酸化：T4多聚核苷酸激酶将重亚硫酸盐处理后的 DNA的5端磷酸化；2)SS1连接：T4 DNA Ligase(Rapid)将SS1接头连接在磷酸化的DNA的5端；3)核酸纯化：使用2倍体积的Agencourt AMPure XP system去除剩余的接头；4)SS2连接：T4 DNALigase(Rapid)将SS2接头连接在磷酸化的DNA的3端；5)核酸纯化：使用2倍体积的Agencourt AMPure XP system去除剩余的接头；6)扩增：采用NEBNext Q5U Master Mix以及 primer1.0(通用引物)和Bacard序列扩增上一步的核酸；7)核酸纯化：使用 1.2倍体积的Agencourt AMPure XP system去引物二聚体和多余的引物；8)质检：纯化处理后的预文库采用

芯片(Twist Bioscience)杂交捕获步骤：1)芯片杂交：将质检合格混合好的1.5ug的文库预先真空浓缩成粉末状再和Panel、Hybridization Mix、Blocker Solution、Universal Blockers、Hybridization Enhancer试剂混匀，放置在PCR仪中70度孵育16小时过夜(热盖温度为85度)；2)磁珠捕获：预先使用Streptavidin Binding Buffer将捕获磁珠洗涤3次，将杂交完成的产物加入捕获磁珠中，孵育 30分钟，Wash Buffer I清洗一次，WashBuffer 2清洗3次，最后42μl超纯水洗脱；3)扩增：采用KAPA HiFi HotStart ReadyMix以及通用引物扩增捕获后的文库；4)纯化：采用1倍体积的Agencourt AMPure XP system去引物二聚体和多余的引物。

纯化处理后的文库采用

3、测序

将文库总量、扩增产物的片段大小分布和引物二聚体比例质检均合格的待测文库，按照1:1的物质的量进行混合，使用

4、膀胱癌分类模型的建立和评价

对于测序得到的原始fastq数据，对原始数据过滤后使用bismark甲基化分析软件对芯片捕获片段进行甲基化分析，获得候选基因甲基化水平。利用候选基因片段甲基化水平，针对膀胱癌和对照样品进行差异分析和模型构建。

实施例3、本发明试剂组合测试样本的检测结果

收集了63例原发性膀胱癌患者、23例膀胱炎患者组织样本和118例膀胱癌患者的尿液10ml以及60例膀胱患者和健康人尿液10ml，用于检测分析候选基因片段甲基化标记物在样本尿液中的甲基化水平。检测结果如表1和图1～6 所示。

表1

1为cg13314394、2为cg00206063、3为cg06712013、4为cg20765408和 5为cg03278514。

从表1中可以看出，在组织样本中，所有试剂组合均能以至少0.9524的特异性和0.8305的灵敏度以及0.9396的曲线下面积对膀胱癌进行预测。而在尿液游离DNA样本中，所有试剂组合均能以至少0.9048的特异性和0.8389的灵敏度以及0.9478的曲线下面积对膀胱癌进行预测。因此，本发明的试剂组合具有对膀胱癌很好的预测效果，特别地，在使用尿液游离DNA作为样本时，具有优异的特异性和灵敏度。

对比例1

为了考察cg13314394位点附近其他甲基化位点能否统一作为检测膀胱癌的标志物，选取了cg13314394位点上下游甲基化位点。同样按照上述实施例的方法进行检测，检测结果如下表2所示。

表2、对比位点在膀胱癌分类模型中的预测性能

6为cg07200122、7为cg05554320。

从表2中可以看出，cg13314394位点上下游甲基化位点在组织样本中的最高AUC为0.760，在游离DNA样本中的最高AUC为0.522，低于本发明的 cg13314394位点的AUC。

对比例2

为了考察cg13314394位点能否作为检测膀胱癌的标志物，进一步选取了本领域知晓的与膀胱癌密切相关的甲基化位点cg16732616和cg04974290。同样按照上述实施例的方法进行检测，检测结果如下表3所示。

表3、对比位点及其组合膀胱癌分类模型中的预测性能

8为cg16732616、9为cg04974290。

从表3中可以看出，对比位点单个位点在组织样本中的最高AUC为0.848，单个位点在游离DNA样本中的最高AUC为0.751；对比位点组合在组织样本中的最高AUC为0.851，组合在游离DNA样本中的最高AUC为0.862，低于本发明的cg00206063位点的AUC。