调节CdLAC15表达水平的物质在调节木质素聚合度中的应用

技术领域

本申请涉及植物基因工程技术领域，尤其是涉及调节CdLAC15表达水平的物质在调节木质素聚合度中的应用。

背景技术

油茶是我国特有的木本油料作物，在长江中下游地区广泛分布，有着极为悠久的栽培历史。我国最南端分布的高州油茶(Camellia drupifera)相比普通油茶(Camelliaoleifera)，具有果实大、种仁含油率高、活性成分丰富等优点，是比普通油茶更适合广东地区的本土油茶物种。油茶果皮在生产上常作为废弃物被丢弃或焚烧，其经济价值远不及种仁，但高州油茶的果皮显著厚于普通油茶，且厚实的果皮在果实生长期间会耗费更多能量，制约种仁及油脂的积累。因此迫切需要解析高州油茶果皮增厚的调控机理，从而指导改善高州油茶的果皮厚度等育种工作。

成熟期的油茶果皮具有木质纤维化的特性，主要成分包含木质素、纤维素和半纤维素，其中木质素含量约占40％。在植物的生长发育过程中，植物细胞壁不断积累木质素，细胞逐渐木质化。在此过程中，由木质素单体在多种不同酶的作用下转化形成木质素聚合物，从而完成木质素的合成。根据单体成分的不同，木质素可以分为由紫丁香基丙烷结构单体聚合而成的紫丁香基木质素(syringyl lignin，S-木质素)；由愈创木基丙烷结构单体聚合而成的愈创木基木质素(guaiacyl lignin，G-木质素)和由对-羟基苯基丙烷结构单体聚合而成的对-羟基苯基木质素(hydroxy-phenyl lignin，H-木质素)。其中，木质素单体的聚合是油茶果皮最终形成木质素的关键步骤。因此，有必要通过调控高州油茶果皮木质素的聚合度来实现果皮厚度的调节。

发明内容

本申请旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本申请提出一种调节CdLAC15表达水平的物质在调节木质素聚合度中的应用。

本申请的第一方面，提供调节CdLAC15表达水平和/或活性的物质在调节目的植物的木质素聚合度中的应用。

在本申请的一些实施方式中，上调CdLAC15表达水平和/或活性的所述物质提高所述目的植物的木质素聚合程度，下调CdLAC15表达水平和/或活性的所述物质降低所述目的植物的木质素聚合程度。

在本申请的一些实施方式中，所述上调CdLAC15表达水平和/或活性的所述物质包括A1)～A5)中的任一种；

A1)特异性敲入或敲高CdLAC15的编码基因的物质；

A2)特异性提高CdLAC15的mRNA水平的物质；

A3)特异性提高CdLAC15蛋白的表达水平的物质；

A4)特异性提高CdLAC15蛋白的活性的物质；

A5)包含A1)～A4)中任一种的载体。

在本申请的一些实施方式中，所述下调CdLAC15表达水平和/或活性的所述物质包括B1)～B5)中的任一种：

B1)特异性敲低或敲除CdLAC15的编码基因的物质；

B2)特异性抑制CdLAC15的mRNA水平的物质；

B3)特异性抑制CdLAC15蛋白的表达水平的物质；

B4)特异性抑制CdLAC15蛋白的活性的物质；

B5)包含B1)～B4)中任一种的载体。

在本申请的一些实施方式中，特异性敲入或敲高CdLAC15的编码基因的物质包括CRISPR/Cas、ZFN、TALEN、Cre-LoxP基因编辑系统中的至少一种。

在本申请的一些实施方式中，特异性敲低或敲除CdLAC15的编码基因的物质包括CRISPR/Cas、ZFN、TALEN、Cre-LoxP基因编辑系统中的至少一种。

在本申请的一些实施方式中，特异性抑制CdLAC15的mRNA水平的物质包括反义核酸序列、siRNA、shRNA、dsRNA、miRNA中的至少一种。

在本申请的一些实施方式中，载体为无机载体、有机载体、无机-有机复合载体中的任一种。

在本申请的一些实施方式中，载体为慢病毒、腺病毒、腺相关病毒中的至少一种。

在本申请的一些实施方式中，所述目的植物包括被子植物。

在本申请的一些实施方式中，所述目的植物包括木兰纲植物。

在本申请的一些实施方式中，所述目的植物包括木兰纲植物。

在本申请的一些实施方式中，所述目的植物包括杜鹃花目植物、十字花目植物中的至少一种。

在本申请的一些实施方式中，所述目的植物包括山茶科植物、十字花科植物中的至少一种。

在本申请的一些实施方式中，所述目的植物包括山茶属植物、拟南芥属植物中的至少一种。

在本申请的一些实施方式中，所述目的植物包括高州油茶、普通油茶、拟南芥中的至少一种。

在本申请的一些实施方式中，所述物质调节所述目的植物的果皮、叶片、茎中的至少一种组织的木质素聚合程度。

根据本申请实施例的应用，至少具有如下有益效果：

本申请实施例中发现高州油茶CdLAC15基因的表达能够调控木质素的聚合度。当在作为模式植物的野生型拟南芥中过表达该基因时，能够使拟南芥的果皮、叶片、茎等组织在总木质素含量无显著差异的情况下，增加木质素的聚合度。因此，可以通过调节CdLAC15基因的表达水平的试剂来调节植物的果皮等部位的木质素聚合度，在育种等方面具有重要的应用价值。

本申请的第二方面，提供一种调整目的植物的果皮厚度的方法，包括在所述目的植物中调节CdLAC15表达水平和/或活性。

在本申请的一些实施方式中，包括在所述目的植物中上调或下调CdLAC15表达水平和/或活性。其中，上调CdLAC15表达水平和/或活性的物质可以增加目的植物的果皮厚度，下调CdLAC15表达水平和/或活性的物质可以减少目的植物的果皮厚度。

在本申请的一些实施方式中，所述上调CdLAC15表达水平和/或活性的所述物质包括A1)～A5)中的任一种；

A1)特异性敲入或敲高CdLAC15的编码基因的物质；

A2)特异性提高CdLAC15的mRNA水平的物质；

A3)特异性提高CdLAC15蛋白的表达水平的物质；

A4)特异性提高CdLAC15蛋白的活性的物质；

A5)包含A1)～A4)中任一种的载体。

在本申请的一些实施方式中，所述下调CdLAC15表达水平和/或活性的所述物质包括B1)～B5)中的任一种：

B1)特异性敲低或敲除CdLAC15的编码基因的物质；

B2)特异性抑制CdLAC15的mRNA水平的物质；

B3)特异性抑制CdLAC15蛋白的表达水平的物质；

B4)特异性抑制CdLAC15蛋白的活性的物质；

B5)包含B1)～B4)中任一种的载体。

在本申请的一些实施方式中，特异性敲入或敲高CdLAC15的编码基因的物质包括CRISPR/Cas、ZFN、TALEN、Cre-LoxP基因编辑系统中的至少一种。

在本申请的一些实施方式中，特异性敲低或敲除CdLAC15的编码基因的物质包括CRISPR/Cas、ZFN、TALEN、Cre-LoxP基因编辑系统中的至少一种。

在本申请的一些实施方式中，特异性抑制CdLAC15的mRNA水平的物质包括反义核酸序列、siRNA、shRNA、dsRNA、miRNA中的至少一种。

在本申请的一些实施方式中，特异性抑制CdLAC15蛋白的活性的物质包括CdLAC15抗体。

在本申请的一些实施方式中，载体为无机载体、有机载体、无机-有机复合载体中的任一种。

在本申请的一些实施方式中，载体为慢病毒、腺病毒、腺相关病毒中的至少一种。

在本申请的一些实施方式中，所述目的植物包括被子植物。

在本申请的一些实施方式中，所述目的植物包括木兰纲植物。

在本申请的一些实施方式中，所述目的植物包括木兰纲植物。

在本申请的一些实施方式中，所述目的植物包括杜鹃花目植物、十字花目植物中的至少一种。

在本申请的一些实施方式中，所述目的植物包括山茶科植物、十字花科植物中的至少一种。

在本申请的一些实施方式中，所述目的植物包括山茶属植物、拟南芥属植物中的至少一种。

在本申请的一些实施方式中，所述目的植物包括高州油茶、普通油茶、拟南芥中的至少一种。

本申请的第三方面，还提供一种植物育种方法，包括按照前述的方法调整目的植物的果皮厚度。

本申请的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本申请的实践了解到。

附图说明

图1是高州油茶与小果油茶(Camellia oleifera Abel.)不同时期的果皮对比。其中，第一行和第三行为高州油茶G255的果实切开后果皮两侧的照片，第二行和第四行为小果油茶YTZ13的果实切开后果皮两侧的照片。

图2是高州油茶与小果油茶的果皮总木质素在不同发育时期的含量。其中，Co为小果油茶，Cd为高州油茶，从左到右分别是成熟期(ripening)、小果期(fruitlet)和膨大期(enlargement)的含量比较。

图3是高州油茶与小果油茶的LAC15基因在成熟期的相对表达量。

图4是高州油茶与小果油茶果皮的木质素GPC聚合度峰图。

图5是高州油茶与小果油茶的果皮木质素聚合度对比，从左到右分别为不同时期不同油茶的木质素聚合物的数均分子量(Mn)、不同时期不同油茶的聚合后的木质素聚合物的重均分子量(Mw)以及不同时期不同油茶的木质素聚合度(Mw/Mn)。

图6是CdLAC15基因克隆电泳图。其中，左侧M为Marker，右侧两个泳道为LAC15-2300的两个重复。

图7是CdLAC15-2300-CpYGFP大肠杆菌菌液PCR检测结果图。其中，M为Marker，泳道1为阴性对照，泳道2～8分别为LAC15-2300-CpYGFP阳性转化子的电泳结果，目的基因片段大小为1710bp。

图8是CdLAC15-2300-CpYGFP转化实验过程图。其中，A为卡那T0筛选T1的结果，B为筛出阳性苗的结果，C为阳性苗移栽的结果，D为阳性苗鉴定及收种子。

图9是CdLAC15-2300-CpYGFP基因T1阳性株系PCR鉴定结果图。其中，M为Marker，泳道1～2分别为阴性对照和阳性对照，泳道3～11是LAC15-2300-CpYGFP阳性苗，目的条带大小为1164bp。

图10是转基因CdLAC15基因在拟南芥T3代株系与野生型qRT-PCR检测的表达量对比图。

图11是CdLAC15基因在野生型、突变体、过表达转基因拟南芥中的表型对比。

图12是野生型拟南芥WT和过表达拟南芥OE-LAC15的成熟期果皮总木质素含量,P＝0.16差异不显著。

图13是野生型拟南芥WT和过表达拟南芥OE-LAC15的成熟期木质素聚合度对比。

具体实施方式

以下将结合实施例对本申请的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本申请的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本申请的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本申请的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本申请保护的范围。

下面详细描述本申请的实施例，描述的实施例是示例性的，仅用于解释本申请，而不能理解为对本申请的限制。

在本申请的描述中，若干的含义是一个以上，多个的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数，约的含义是指在本数±20％、10％、8％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.2％、0.1％等的范围内。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。

本申请的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

下述实施例中所选取的油茶材料为高州油茶G255和小果油茶YTZ13，两者的果实成熟后，果皮厚度具有显著差异(图1)，种植于韶关市国有小坑林场，管理措施为正常林地管理。取样方式为选择长势均一、新鲜无损伤的3个果实现场分离果皮与种仁，将果皮切碎分装到离心管中，立即投入液氮中暂存。

本申请实施例使用的试剂与耗材如下：

Prime Script

其他药品：琼脂糖Agarose Regula(5260，TaKaRa)、Star Stain Red核酸染料10,000×(E109-01，GenStar)、乙醇(ACS:64-17-5)、氯仿(ACS:67-66-3)、甲醇(ACS:67-56-1)、丙酮(ACS:67-64-1)、醋酸(ACS:64-19-7)、醋酸钠(ACS:127-09-3)、叠氮化钠(ACS:26628-22-8)、α-淀粉酶(ACS:9000-85-5)、普鲁兰酶(ACS:9075-68-7)。

培养基：胰蛋白胨(LP0042，OXOID)、酵母提取物(LP0021，OXOID)和NaCl(沪试)。

主要仪器：PCR扩增仪Bio-RadC1000、荧光定量PCR仪ViiA7(Thermo FisherScientific)、DYCP-32B型琼脂糖水平电泳仪(中号)(北京六一，北京)、Alpha凝胶成像系统Alpha Imager HP(Protein Simple，美国)。

实施例1：高州油茶与小果油茶果实数据采集

高州油茶与小果油茶植物材料分6个时间段进行采集、切面、拍照，结果如图1所示，对应时间为：2021年3月30日(记为A)、2021年5月30日(B)、2021年7月1日(C)、2021年7月30日(D)、2021年9月12日(E)、2021年10月10日(F)。

实施例2：高州油茶与小果油茶的果皮总木质素含量测定

1.细胞壁的提取与分离

称取适量植物干粉；加入1mL 70％的乙醇彻底旋涡，10000rpm离心10min，弃上清液；加入1mL氯仿/甲醇(1:1v/v)溶液彻底旋涡，10000rpm离心10min，离心弃上清液；加入1mL丙酮彻底旋涡，真空抽干丙酮；加入1.5mL 0.1M pH 5.0的醋酸钠缓冲液，80℃加热20min；加入10μL 0.01％的叠氮化钠、淀粉酶和普鲁兰酶，37℃孵育过夜；100℃加热终止反应，10000rpm离心10min，弃上清液，加蒸馏水清洗沉淀；加入1mL丙酮彻底旋涡，真空抽干丙酮；残渣于40℃烘干。

2.总木质素的解离与测定

称取约2mg细胞壁材料，加入100μL乙酰溴(25％)溶液，37℃加热6h。加入100μL的2M氢氧化钠和100μL 0.5M盐酸羟胺，涡旋混匀，用乙酸定容到2mL。10000rpm离心10min后吸取上清液于280nm下测定吸光值，并根据标准曲线换算为对应的总木质素含量(％)：

ABS：吸光值；Coeff：吸光系数，单位L/(g·cm)；Weight：质量，单位mg；0.539cm：光程。

其中，百分比木质素含量值乘以10即为木质素含量(μg/mg细胞壁材料)。

实验结果如图2所示。

实施例3：高州油茶与小果油茶的果皮组织LAC15基因在成熟期的表达量测定

高州油茶G255和小果油茶YTZ13的果实成熟后，果皮厚度具有显著差异。而木质素合成与果皮增厚有密切关系，相关木质素合成关键基因在厚果皮中具有较高的表达量。本发明实施例4所选取了厚果皮的高州油茶G255和薄果皮的小果油茶YTZ13，提取成熟期的果皮的RNA，并用qRT-PCR对表达量进行检测。检测结果如图3所示，图中结果表明，该基因在高州油茶成熟期的果皮中qRT-PCR检测到的表达量均显著高于小果油茶。由此，该调控木质素合成的基因可能和油茶果皮厚度形成有关。

LAC15基因在高州油茶与小果油茶两个材料成熟期表达量差异分析的具体步骤如下：

1磨样

取约100mg样品至冷冻研钵中，加入液氮研磨至粉末状，转移至装有1mL RNAisoPlus的1.5mL离心管中，振荡混匀后室温静置约5min。

2RNA的提取

1)每1mL RNAiso Plus加入0.2mL氯仿，振荡混匀15s后室温静置约3min，4℃，12000rpm，离心15min。

2)沉淀：转移水相至新的1.5mL离心管中，每1mL RNAiso Plus加入0.5mL异丙醇，混匀后室温静置10min，4℃，12000rpm，离心10min。

3)洗涤：弃上清，每加入1mL 75％的乙醇，混匀后4℃，7500rpm，离心5min。

4)溶解：弃上清，空气干燥RNA沉淀约5min，加入适量的DEPC处理水溶解RNA沉淀。

5)测定浓度和纯度：用分光光度计测定RNA浓度。

3反转录cDNA的合成

按照下表1的组分在冰上配制RT反应液。为了保证反应液配制的准确性，减少分装造成的误差，应按照比实际用量稍大的体积配制反应液，最后加入RNA样品。

按37℃,15min；85℃，5sec的程序进行反转录，-20℃保存备用。

4荧光定量PCR检测

1)利用NCBI在线网站，设计CdLAC15基因的特异性引物，用油茶GAPDH基因作为内参基因。

引物如下：

LAC15-RT-F：CCACCGCTATTTCCACACCT(SEQ ID NO.1)；

LAC15-RT-R：AGCATGTACGGTTGGGATGG(SEQ ID NO.2)；

GAPDH-RT-F：AAGGAGGCTTCGGAGGGTAG(SEQ ID NO.3)；

GAPDH-RT-R：ATGCTGGACCTGCAATCACC(SEQ ID NO.4)。

2)荧光定量PCR体系的配置：

将Mix在4℃下融解，轻柔地上下颠倒混匀并进行短暂离心。冰上按照下表配制反应液：

将反应管进行短暂离心，确保所有反应液在反应孔底部。采用三步法程序进行反应：95℃5min；95℃，10sec，60℃，30sec，40个循环；上述反应结束后，从60℃～95℃过程中进行熔解曲线分析。将数据导出，使用2

实施例4：高州油茶与小果油茶的果皮木质素聚合度测定

分别对高州油茶和小果油茶不同时期的样本中木质素的聚合度利用凝胶渗透色谱(GPC)检测，使用Waters Breeze(Waters，America)系统检测，配备Waters 2414探测器。洗脱液为HPLC级THF，流速为1mL min

实施例5：油茶CdLAC15基因的生物信息学分析

从转录组数据中获取LAC15基因的CDS序列和编码的氨基酸序列，其开放阅读框为1713bp，编码570个氨基酸，将该基因命名为CdLAC15，并对其功能进行研究。

CdLAC15的开放阅读框序列为：

ATGTGGTTTGGGAAGAAGAGTTTGATCTTGTGTCTTTTGGGGTACTTACTGTTTGATGGCATTGGCATCGTCCATTGCCAAGCTTGGATTCGCCGACATCGATTTGTTGTGAAAGAAGCTCCTTACACAAGACTCTGCAGTACAAAGAAGATTTTGACAGTGAATGGGAAATTTCCAGGACCAACTCTCTATGCTCACAAAGAAGAGACTCTAATTGTTGATGTTTACAATAGAGGAAAATATAACATCACTATCCACTGGCATGGAGTGAAAATGCCTAGGTATCCATGGTCAGATGGTCCTGAATATATCACACAGTGCGCGATCAAACCGGGAGGAAAGTTCAGCCAAAAAGTAATATGTTCCGCAGAGGAAGGGACCCTATGGTGGCATGCCCACAGCGATTGGTCACGAGCTACCGTCCACGGTGCTATTATAGTCTATCCTAAACATGGCACTGTCTATCCTTTCCCTAAGCCCTATGCTGAAGTGCCCATCGTATTAGGAGAGTGGTGGAAGCAAGATGTGATGAAGGTCCTCGAGGAATTTGTTAGAACTGGAGGAACCCCAAATGACTCAGATGCTTTCACCATCAATGGTCAGCCTGGTGATTTATATCCATGCTCCAAGCCTGGAACATTCAAGCTAACCGTGGAACATGGCAAGACCTATCTCCTCCGCATAATCAACGCCGCTATGAACGAAATCCTCTTCCTCTCCATCGCCAAACACAAACTCACTGTGGTCGGAGCCGATGCTAGCTACACCAAGCCCTTAAAAACAAAGTACATCACAATCTCCCCTGGCCAAACCATTGATGCCTTATTTCACGCCAACCGCCACCATGGCCGCTACTACATTGCCGCCCGAGCCTACTCTGCGGGCAACATACCCTTCGATAACACCACCACCACCGCAATAATCCAATATGCCGGAAAAAAATCCACAGCCACTTCACCACCGCTATTTCCACACCTCCCGTACCATAATGACACACGTGCCATGGTGAATTTCACCGGCAGCCTAAGAAGCTTGGGTAGCAAGGACCATCCGGTCAATGTTCCATTAAAAATCACCACCCCTATGATCTCAACCGTCTTGCTCAACACCCTTCCGTGCCATCCCAACCGTACATGCTTGGGACCGAATGGGACCCGATTGGCTGCGAGCATGAACAACTTAAGTTGGGTGAACCCATCCCTTGATATCCTCCAAGCTTACTATTATCACATTAAGGGCGTGTTTGGGGATCGATTTCCGAACTTTCCACCATATGTGTTTAATTTTACGGCTGATTATTTTCCGATGGAGTTGGAGATACCGAAGAAAACCAGACAGGTGAAGATTTTGAAGTATAATTCAACCGTGGAGGTGGTTTTTCAAGGGACTAATTTGGTGGCTGGGATTGATCATCCTATTCATTTACACGGGCATAGTTTTTATGTTGTTGGGTGGGGATTTGGGAACTATGACAAATTTAAGGATCCATTGACATACAACCTTGTTGACCCTCCTCTCCTTAACACTGTTGCTGTACCAAGAAATGGCTGGATCACCATCAGATTCAAGGCTAACAATCCTGGAGTTTGGTTCCTTCATTGCCATTTTGAGCGCCACCTGATGTGGGGGATGGAGACAGTGTTCATAGTGAAAAATGGCAAGCACCACAACGCTACTATGCTCCCACCTCCACCAGATATGCCCCCTTGTTGA(SEQ ID NO.5)。

CdLAC15编码的氨基酸序列为：

MWFGKKSLILCLLGYLLFDGIGIVHCQAWIRRHRFVVKEAPYTRLCSTKKILTVNGKFPGPTLYAHKEETLIVDVYNRGKYNITIHWHGVKMPRYPWSDGPEYITQCAIKPGGKFSQKVICSAEEGTLWWHAHSDWSRATVHGAIIVYPKHGTVYPFPKPYAEVPIVLGEWWKQDVM KVLEEFVRTGGTPNDSDAFTINGQPGDLYPCSKPGTFKLTVEHGKTYLLRIINAAMNEILFLSIAKHKLTVVGADASYTKPLKTKYITISPGQTIDALFHANRHHGRYYIAARAYSAGNIPFDNTTTTAIIQYAGKKSTATSPPLFPHLPYHNDTRAMVNFTGSLRSLGSKDHPVNVPLKITTPMISTVLLNTLPCHPNRTCLGPNGTRLAASMNNLSWVNPSLDILQAYYYHIKGVFGDRFPNFPPYVFNFTADYFPMELEIPKKTRQVKILKYNSTVEVVFQGTNLVAGIDHPIHLHGHSFYVVGWGFGNYDKFKDPLTYNLVDPPLLNTVAVPRNGWITIRFKANNPGVWFLHCHFERHLMWGMETVFIVKNGKHHNATMLPPPPDMPPC(SEQ ID NO.6)。

实施例6：CdLAC15基因的克隆和过表达载体的构建

1.基因引物的设计

采用NCBI在线网站设计引物，用PCR的方法从高州油茶的果皮中扩增，所用cDNA为上述步骤中高州油茶成熟期果皮的样品。为了扩增基因的编码区全长，并加上特定酶切位点，根据CdLAC15的CDS序列，分别在起始密码子和终止密码子处设计含有适合酶切位点的引物。所用的载体为PCAMBIA2300-CpYGFP，所用的酶切位点为KpNI和SaII双酶切，以PCAMBIA2300-CpYGFP骨架引物上游接头添加序列为：GAACACGGGGGACGAGCTCGGTACC(KpNI)；下游接头添加序列为：TTTTGAAGGTTGTCATGGTGTCGAC(SaII)。

CdLAC15载体引物序列如下：

LAC15-2300-CpYGFP-F：GAACACGGGGGACGAGCTCGGTACCATGTGGTTTGGGAAGAAGAGTTTGATC(SEQ ID NO.7)；

LAC15-2300-CpYGFP-R：TTTTGAAGGTTGTCATGGTGTCGACACAAGGGGGCATAT CTGGTGG(SEQ ID NO.8)。

2.基因克隆的PCR反应体系、程序

1)PCR反应体系。按照下表加入引物、模板在内的各组分，振荡混匀，瞬时离心。

2)PCR反应程序：98℃3min；98℃10s，68℃1min，35个循环；72℃5min。

3.PCR产物的检测

取2μL PCR产物，加入3μL 6×Loading Buffer，混匀，1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图6所示，扩展条带大小为1713bp左右。

4.PCR产物的胶回收

采用胶回收试剂盒对产物进行回收纯化，步骤如下：

1)DNA电泳结束后，将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下(尽量切除多余部分)放入干净的离心管中，称取重量。

2)先向空的吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)加入500μL平衡液BL，12000rpm(～13400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

3)向胶块中加入等倍体积溶液PN(如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100μL，则加入100μL PN溶液)，50℃水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可继续放置几分钟或再补加一些溶胶液，直至胶块完全溶解(若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块)。

4)将上一步所得溶液加入到一个吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)，室温放置2min，12000rpm(～13400×g)离心30～60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。

5)向吸附柱CA2中加入600μL漂洗液PW(使用前先检查是否已加入无水乙醇)，静置2～5min，12000rpm(～13400×g)离心30～60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。

6)重复操作步骤5。

7)将吸附柱CA2放回收集管中，12000rpm(～13400×g)离心2min，尽量除尽漂洗液。将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。

8)将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30μL适量洗脱缓冲液EB，室温放置2min。12000rpm(～13400×g)离心2min收集DNA溶液到离心管中，保存产物在-20℃。

实施例7：LAC15-2300-CpYGFP植物表达载体的构建

1.骨架载体酶切体系按照下表加入各组分，振荡混匀，瞬时离心；

孵育程序：37℃20min；80℃15min。酶切反应完成后，电泳检测，胶回收大片段。

2.同源重组体系：

1)按照下表加入各组分，振荡混匀，瞬时离心；

2)孵育程序：50℃20min。

3)同源重组反应完成后，将反应液加入100μL感受态细胞中，热激转化。

4)涂布于卡那霉素固体LB平板上，37℃过夜培养。

3.大肠杆菌菌液PCR阳性克隆检测及测序

1)从转化平板上挑取白色菌落，放入含有Kan的液体LB培养基中，37℃恒温摇床培养8h。

2)菌落PCR按照下表加入各组分，振荡混匀，瞬时离心；

3)PCR扩增程序如下：

95℃3min；95℃30s，58℃30s，72℃2min，30个循环；72℃5min。

4)PCR反应完成后，电泳检测验证阳性克隆，结果如图7所示。

5)将验证正确的单克隆进行测序，每个序列测3个重复。

实施例8：农杆菌介导的拟南芥的转化

1.拟南芥培养

将从1/2MS平板中移裁的哥伦比亚野生型拟南芥，种植在人工气候室，长至盛花期将已经结的果荚剪去，并保证拟南芥根部营养土的湿度。

2.农杆菌蘸花法转化拟南芥

1)活化农杆菌。

2)以1：50接种到100mL LB培养基中，28℃，200rpm培养至OD600＝1.2～1.6。

3)4000rpm离心15min，收集菌体。

4)重悬于渗透缓冲液(1/2MS培养基+5％蔗糖，121℃灭菌20min，加入终浓度为0.03％ SilwettL-77，振荡混匀)，以重悬渗透液为对照，调节OD600＝0.4～0.6；

5)将拟南芥倒置于装有渗透缓冲液的合适大小的容器上侵染30s，用塑料薄膜覆盖整个托盘并适留通气孔后，在弱光下培养，24h后取下薄膜，于室温中继续培养。

6)约30日后成熟，收获转基因的T0代种子。

实施例9：转基因拟南芥植株的表型鉴定

1)将收获的转基因种子用含有0.2％的Triton X-100浸泡10min。

2)用10％的次氯酸钠表面消毒10～12min。

3)灭菌水冲洗5～6次，每次约2min。

4)用水将转基因种子置于含50mg/L Kan的MS平板上，4℃暗培养3天。

5)抗性筛选的种子在22℃，16h光照/8h黑夜光周期培养。

6)两周后，阳性植株在抗生素平板上生长良好，而阴性植物则不萌发或不久死亡，取平板上生长良好的拟南芥种植于基质中，待拟南芥长出7～8片真叶时，取最底端叶片提取DNA用于PCR检测，结果参考图9。检测时所用引物为LAC15-2300-CpYGFP-F和LAC15-2300-CpYGFP-R。

7)每一代的植株都要进行阳性株系的检测，直至繁殖至T3代，获得纯合转基因拟南芥株系。T3代株系做qRT-PCR检测，荧光定量验证的过程如下:

提取RNA，反转录成cDNA，CdLAC15荧光定量的引物：

LAC15-RT-F：CCACCGCTATTTCCACACCT(SEQ ID NO.1)；

LAC15-RT-R：AGCATGTACGGTTGGGATGG(SEQ ID NO.2)。

冰上配置qRT-PCR反应体系，进行荧光定量PCR反应。结果如图10所示，从图中的荧光定量验证结果可以看出，CdLAC15基因在转基因株系中转录水平极显著高于非转基因拟南芥。

8)将转基因T3代植株与非转基因植株进行消毒培养于1/2MS培养基上，4℃春化两天后，10天左右拟南芥幼苗长出真叶即移到小花盆里生长，同等条件下种植栽培。结果如图11所示，表型观察发现过表达转基因拟南芥与野生型的拟南芥有形态差异。

实施例10：拟南芥的果皮总木质素含量及木质素聚合度测定

方法同实施例4，检测结果如图12和图13所示。野生型拟南芥的果皮中总木质素含量为252.98±15.41μg/mL，过表达LAC15基因后的拟南芥OE_LAC15中总木质素含量为277.50±13.20μg/mL，两者总木质素含量无显著差异(P＝0.16)，但木质素聚合度提高了一倍左右，两者差异具有显著性。上述结果表明，通过CdLAC15的过表达可以在不影响总木质素含量的情况下，提高木质素聚合度。

上面结合实施例对本申请作了详细说明，但是本申请不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。