利用CRISPR创制水稻HSMS1雄性不育系及其应用

技术领域

本发明涉及植物生物技术育种技术领域，尤其涉及利用CRISPR创制水稻HSMS1雄性不育系及其应用。

背景技术

水稻是世界上最重要的粮食作物之一。随着人口的增长和生活品质的提升，据预计到2050年水稻的年产量要提高1-2倍才能满足人类发展的需求。杂交水稻是父母本杂交后获得的子一代，其产量往往比常规稻亲本提高15％以上，抗性和适应性也远胜于亲本。因此，应用和推广杂交水稻是提高水稻产量的一个重要途径。雄性不育系是杂交水稻育制种技术的关键节点。雄性不育系是指雄配子发育异常而丧失生育能力，雌配子发育正常的植物株系。它只能作为母本接受父本的花粉，自交不能结实。目前杂交水稻生产上应用的雄性不育系有核质互作型和光温敏型两种。

核质互作型雄性不育系的不育基因在细胞质中，细胞核中没有育性恢复基因。当细胞核中有育性恢复基因的恢复系与其配组杂交时可以生产可育的子一代杂交种，当细胞核中没有育性恢复基因而细胞质中也没有不育基因的保持系与其杂交时可以繁殖不育系种子。由于需要不育系、保持系和恢复系三系配套，这种杂交水稻育制种技术常被称为“三系法”。一些控制核质互作型不育及相应育性恢复的基因已经被克隆(Chen and Liu，2014，Male sterility and fertility restoration in crops，Annu Rev Plant Biol，65：579-606)。核质互作型不育系是杂交水稻育制种中第一种大规模应用的不育系，为杂交水稻产业的建立和发展奠定了材料基础。然而由于核质互作型不育系的组配受到恢复系基因型的限制，导致只有约5％的种质资源能被利用。而细胞质的不育基因有导致米质差、特定病虫害流行的潜在风险。

光温敏型雄性不育系是一种育性受光温环境调控的不育系。在一定的光温条件下这种不育系保持不育，可用于组配杂交。当条件改变时不育系恢复育性，可用于不育系繁殖。由于光温敏雄性不育系实现了不育系和保持系的合二为一，只需要父本与其配组生产子一代杂交种，因此相应的育制种技术常被称为“两系法”。调控光温敏雄性不育的基因在细胞核中，目前已经克隆的基因包括PMS3、TMS5、CSA和TMS10(Chen and Liu，2014，Malesterility and fertility restoration in crops，Annu Rev Plant Biol，65:579-606；Zhou H，et al，2014，RNase ZS1 processes UbL40 mRNAs and controlsthermosensitive genic male sterility in rice，Nature Communications，5:4884-4892)。与核质互作型不育系相比，光温敏型不育系繁殖程序简单，配组因恢复基因广泛存在而更自由。光温敏不育系的大规模应用极大地巩固和推动了杂交水稻产业发展。然而，由于该型不育系的育性受光温环境影响，也导致制种风险高，制种地域受到限制。

环境敏感型细胞核雄性不育是由于水稻某些适应外界环境变化的相关基因突变，导致其在某些特殊环境中无法适应环境变化而产生雄性不育。利用这种随着环境改变育性也随着改变的特性，两系法不受恢保关系的限制，相比于三系法更加简单、配组自由，是中国独创的水稻杂种优势利用途径。但当环境条件波动较大时，环境敏感型细胞核雄性不育系的育性易受到影响，制种存在一定的风险，在一定程度上限制了两系法的大范围应用。

CRISPR/Cas9(Clustered,Regularly Interspaced,Short PalindromicRepeatsassociated Endonuclease 9)基因编辑技术由于具有成本低廉、操作简易和突变诱导率高等特点，被越来越广泛地应用于植物基因功能研究，作物遗传改良和育种等多个方面，应用前景十分广阔。

发明内容

本发明提供湿度相关的雄性不育基因HSMS1及其突变体hsms1在创制水稻雄性不育系中的应用。

第一方面，本发明提供湿度相关的雄性不育基因HSMS1在控制水稻雄性生殖发育中的应用，所述湿度相关的雄性不育基因HSMS1编码蛋白的氨基酸序列为以下任一：

1)所述氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

2)所述氨基酸序列为将SEQ ID NO.2经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有调控植物雄性育性活性的氨基酸序列。

在本发明所提供的应用中，所述湿度相关的雄性不育基因HSMS1的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

第二方面，本发明提供一种创制水稻雄性不育系的方法，在水稻植株中抑制HSMS1基因编码蛋白的活性和/或抑制HSMS1基因的表达；所述HSMS1基因编码蛋白的氨基酸序列为以下任一：

1)所述氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

2)所述氨基酸序列为将SEQ ID NO.2经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有调控植物雄性育性活性的氨基酸序列；

优选地，利用CRISPR/Cas9基因编辑来抑制HSMS1基因的表达和/或活性。

第三方面，本发明提供一种HSMS1基因表达抑制剂，所述HSMS1基因表达抑制剂选自CRISPR/Cas9、shRNA、siRNA、dsRNA、miRNA、cDNA、反义RNA/DNA、低分子化合物、肽、抗体中的至少一种。

第四方面，本发明提供一种适用于CRISPR/Cas9系统对植物HSMS1基因进行定向敲除的靶位点，所述靶位点包括：如SEQ ID NO.3所示的靶位点：CCTCCACCTGCT GCTTCTCA。

第五方面，本发明提供一种CRISPR/Cas9系统打靶载体，含有特异性靶向上述靶位点的sgRNA。

本发明利用CRISPR/Cas9技术挖掘鉴定水稻雄性不育候选基因和创制雄性不育材料，可以快速丰富水稻普通核雄性不育基因和不育材料资源，从而促进水稻不育化育种和制种的推广和应用，最终可以有效解决水稻种业行业长期面临缺乏稳定的水稻不育系和突破性大品种的瓶颈问题。

第六方面，本发明提供HSMS1突变基因，所述HSMS1突变基因为：野生型HSMS1外显子任意碱基突变造成氨基酸变异和/或蛋白功能异常从而造成雄性不育表型的核苷酸突变类型。

第七方面，本发明提供了突变体hsms1，所述突变体hsms1为野生型HSMS1基因自起始密码子ATG开始第62位碱基至第71位碱基TCACGGCCTC的缺失；

优选地，所述突变体hsms1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

第八方面，本发明提供一种获得HSMS1雄性不育系的方法，包括：以上述方法获得的水稻雄性不育系或含有上述突变体hsms1的水稻雄性不育系作为亲本，与目标材料进行杂交，获得的F1代与目标材料进行回交，从而使回交后代获得与所述水稻雄性不育系相同的性状和基因突变，作为HSMS1雄性不育系。

根据本领域技术人员的理解，本发明还提供了上述的HSMS1基因表达抑制剂或上述的靶位点或上述的CRISPR/Cas9系统打靶载体或上述的HSMS1突变基因或上述的突变体hsms1在以下任一项中的应用：

(1)在调控水稻雄性育性性状中的应用；

(2)在水稻杂交育种和制种中的应用；

(3)水稻不育系的选育或种质资源改良中的应用。

本发明的有益效果在于：

湿度相关的雄性不育基因HSMS1(LOC_Os05g05920)及其编码的蛋白调控水稻雄性生殖发育是之前没有报道过的。本发明利用CRISPR/Cas9方法突变湿度相关的雄性不育基因HSMS1(LOC_Os05g05920)，发现了湿度相关的雄性不育基因HSMS1(LOC_Os05g05920)对水稻花药发育的调控功能。利用CRISPR/Cas9基因编辑的方法和编辑后获得的雄性不育突变体，可以创制水稻雄性不育系，从而可以应用于水稻杂交育种和制种。

附图说明

为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1中HSMS1基因的表达模式图。

图2为本发明实施例2中HSMS1基因的结构和靶标位置图。

图3为本发明实施例2中定点突变靶位点模式图。

图4为本发明实施例2中T0代水稻潮霉素检测琼脂糖凝胶电泳图。

图5为本发明实施例2中T0代水稻突变峰图和序列比对图；其中上图为T0代水稻突变峰图，下图为序列比对图。

图6为本发明实施例3中T0代水稻突变体花药形态及花粉碘染图。

图7为本发明实施例3中T0代和T1水稻突变体穗子转育碘染图。

图8为本发明实施例3中T0代野生型和突变体穗子。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1水稻HSMS1基因序列和表达模式分析

在Ensembl Plants库(http://plants.ensembl.org/index.html)中，查询到水稻HSMS 1(LOC_Os05g05920)基因，在粳稻中的核苷酸序列见SEQ ID NO.1所示，其编码蛋白包含320个氨基酸，序列如SEQ ID NO.2所示。

由于HSMS1基因在水稻中的实际功能还没有公开的研究资料，为了研究该基因的功能，本发明首先利用基因表达数据库分析了该基因在水稻不同组织部位的表达模式(图1)，表达分析结果显示HSMS1基因在水稻花药特异表达，显示其可能参与水稻花药发育过程。

实施例2水稻HSMS1基因的功能以及利用CRISPR/Cas9方法创制水稻雄性不育系

为了明确水稻HSMS1基因的功能，本发明采用CRISPR/Cas9基因编辑方法定点突变HSMS1基因序列，敲除该基因在水稻中的功能。本发明选取水稻常规稻中花11作为基因编辑的受体材料。本发明分别选取基因编码区自起始密码子ATG开始第45位碱基至第64位碱基的SEQ ID NO.3所示序列作为CRISPR/Cas9基因编辑的靶标区域(简称B1)(见图2)。

1、HSMS1的CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建

本发明的基因编辑载体为pEGCas9Pubi-B-HSMS1(载体图谱见图3)，该载体的基础载体为pEGCas9Pubi-B。本发明通过在引物上设计靶点然后通过PCR获得MT-sgR NA进而通过一步克隆法连接到基础载体中，具体的构建流程如下：

靶标gRNA的设计。将HSMS1(LOC_Os05g05920)的基因序列输入https://zlab.bio/guide-design-resources进行靶标设计，PAM序列设定为NGG。本发明选择的靶标区域的DNA序列如SEQ ID NO.3所示。

通过重叠PCR和巢式PCR扩增sgRNA表达盒。合成包含上述sgRNA靶点序列的引物对，并将上述引物对退火，然后与经过Bsa I酶切的双元载体pEGCas9Pubi-B(参见Ma X，Zhang Q，Zhu Q.et al.ARobust CRISPR/Cas9 System for Convenient，H igh-Efficiency Multiplex Genome Editing in Monocotand Dicot Plants，MolPlant.2015,8(8):1274-1284，载体pEGCas9Pubi-B由海南大学龙湍老师惠赠)连接，得到重组载体pEGCas9Pubi-HSMS1。将重组载体pEGCas9Pubi-sgRNA转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆测序，具体步骤参考文献“Xing,H.L.,Dong,L.,Wang,Z.P.,Zhang,H.Y.,Han,C.Y.,Liu,B.,Wang,X.C.,and Chen,Q.J.(2014).ACRISPR/Cas9toolki t for multiplexgenome editing in plants.BMC plant biology 14:327.”中的方法进行测序验证。

2、农杆菌介导的水稻遗传转化

将上述构建的pEGCas9Pubi-HSMS1载体通过热激法转入农杆菌EHA105中，PCR进行鉴定后加甘油于-80℃保存菌液。以新鲜剥离的1.5mm左右的水稻杂交种中花11的幼胚作为受体材料，将剥离的水稻胚放入含有1.8mL悬浮液的2mL塑料离心管中，放置时间不超过1小时，每个离心管中大约放入100个幼胚；吸去悬浮液，并用新的悬浮液将幼胚清洗2遍，管底保留少量可没过幼胚的悬浮液，然后43℃热激2分钟，之后再冰浴1分钟，用移液枪吸尽管底残留的洗液，并加入1.0mL的农杆菌侵染液，轻摇30秒，然后黑暗静置8分钟。

接下来将离心管中的幼胚和侵染液倒入共培养基上，晃匀后用移液枪吸出多余的侵染液，所有幼胚的盾片朝上，于23℃黑暗共培养3天。共培养结束后，用无菌的镊子将幼胚转移至恢复培养基，于28℃培养7-14天，中间过程需留意及时去掉幼胚上长出的幼芽。恢复培养结束后将幼胚放至含1.5mg/L Bialaphos筛选培养基上筛选培养3轮，每轮筛选2周，然后转到2mg/L Bialaphos筛选培养基上筛选培养2轮，每轮筛选2周。将抗性愈伤组织转至扩繁培养基，28℃，暗培养2周。随后将扩繁好的抗性愈伤组织转移至诱导培养基，于28℃黑暗环境下培养2周。然后转到分化培养基中，25℃，5000lx，光照培养2周。培养结束后将分化出的苗簇分离出单个幼苗放置于生根培养基中，25℃，5000lx，光照培养直到生根；将小苗转入小营养钵中生长，生长成活后移栽于温室中，3-4个月后收获后代种子。

3、T

为确定T

本发明首先采用CTAB法提取水稻叶片DNA，具体方法如下：DNA提取方法参照传统CTAB法(Rogers and Bendich,1985)进行，略有改进。取3cm水稻叶片放入已灭菌2mL的离心管中，加入6mm钢珠，使用细胞破碎仪进行组织破碎，之后进行C TAB法提取，提取样品最后加入200μL的灭菌水(ddH

阳性检测引物：Hn；产物大小：561bp；引物序列如下：

Hn-F(SEQ ID NO.5):5’CTTAGCCAGACGAGCGGGTTC 3；’

Hn-R(SEQ ID NO.6):5’GCTTCTGCGGGCGATTTGT 3；’

阳性检测结果如图4所示，阴性对照H

PCR使用Biomiga的2×PCR预混合液(含Mg

对突变体hsms1核苷酸序列进行比对分析发现(图5)，与未编辑的WT相比，突变后的hsms1自起始密码子ATG开始第62位碱基至第71位TCACGGCCTC碱基的缺失，序列如SEQ IDNO.4所示。突变体编码的核苷酸缺失使得氨基酸发生移码并导致氨基酸翻译提前终止。

实施例3突变体hsms1的表型分析

本实施例提供hsms1突变体的雄穗、花药和花粉活力的观察，结果表明：在营养生长和雌穗的发育方面，hsms1突变体的植株与野生型相比基本无差异；在雄穗发育方面，野生型能够正常抽雄，花药能够正常开裂、散粉，自交后可正常结实，而hsms1突变体虽能正常抽雄，也能正常开花，但是花药干瘪瘦小偏白(图6)；进一步对野生型和突变体的花粉进行I

本实施例对hsms1突变体育性转换进行了鉴定，如下：在突变体hsms1花粉活力检验过程中，本发明发现，突变体花粉受环境影响而育性发生转换，在海南海口2023年3月17日取的突变体花粉碘染发现为完全典败(图7上，左1)，2023年3月30日再次取样同个单株碘染发现部分花粉粒疑似转育(图7上，左2)，2023年4月12日取样碘染发现该单株花粉几乎完全转育(图7上，左3)。随后，收到了该突变体的自交种。

为了验证种子真实性，本发明在T1代继续种植hsms1自交种，基因型检测发现其为纯合突变型，抽穗期2023年8月25日左右取样碘染发现突变体完全败育(图7下，左1)，2023年9月12日取样碘染发现部分花粉已经转育(图7下，左2)，并且也收到了突变体的自交种(图8)，基于此，水稻基因HSMS1为湿度相关的雄性不育基因。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。