一种用于食品辐照消杀的指示病毒的筛选方法

技术领域

本发明涉及卫生防护技术领域，尤其涉及一种用于食品辐照消杀的指示病毒的筛选方法。

背景技术

针对目前常用的消毒方式，化学消毒容易导致食品中消毒化学试剂残留，紫外线消毒只局限于食品包装表面消毒，且容易受到包装整齐度及货物摆放方式的影响。辐照灭菌由于射线的穿透力强，无疑是一种适用于大量货物病毒消毒的有效方式。

自上世纪以来国际社会就广泛利用辐照这一杀菌作用对食品进行杀菌，提高食品保藏期，与在食品中添加防腐剂、加热处理等传统食品保藏加工技术相比，辐照加工技术作为一种冷加工物理灭菌技术，可以彻底杀灭病原微生物，而且没有化学残留，可以最大限度的保持食品的营养及品质，从而达到食品抑芽、除虫、消毒、灭菌等目的。此外，对于进口冷链食品，电离辐射这种冷杀菌技术可以避免冷链食品热量增高，防止产品解冻降低其货架期。大量研究已经证明电离辐射具有灭活病毒的能力，但病毒种类、宿主细胞种类等因素均会对灭活病毒的剂量产生影响。目前几种病毒灭活剂量最低仅0.5kGy，而有的病毒高达25kGy都无法使其灭活。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种用于食品辐照消杀的指示病毒的筛选方法，筛选出的指示病毒可为实际生产过程RNA有囊膜类病毒的去除/灭活的有效性作出定量评估，并可用于冷链食品辐照过程中的生物辐照指示剂。

为达到以上目的，本发明采用的技术方案是：

一种用于食品辐照消杀的指示病毒的筛选方法，包括如下步骤：

通过病毒结构学分析，根据病毒理化性质，筛选出一系列RNA有囊膜的病毒作为样本；

对病毒样本进行不同剂量的辐照处理，获得辐照处理后的不同病毒的病毒滴度与未处理病毒的病毒滴度并比较两者差异，筛选两者差值>4Log10的病毒作为对食品辐照消杀敏感的指示病毒。

进一步地，所述方法还包括：将病毒样本依次进行细胞培养、病毒扩增后再进行辐照处理。

进一步地，所述通过病毒结构学分析，根据病毒理化性质进行筛选，具体为根据病毒大小进行选择易于获得的RNA有囊膜病毒。

近一步地，所述病毒样本选自乙型脑炎病毒、蓝耳病毒、登革病毒、流感病毒(H3N2)、禽流感H9N2、人乙型流感病毒、传染性支气管炎病毒、呼吸道台胞病毒RSV、口泡炎病毒或新城疫病毒。

进一步地，所述辐照处理包括：保持低温条件下，采用0、2、4、7、10、15kGy的γ射线对病毒样本进行照射。

进一步地，所述低温为保持-20℃以下。

进一步地，将辐照处理前后的不同病毒用空斑法或TCID50法测定其病毒滴度。

进一步地，所述方法还包括：获得辐照处理后不同病毒的生长曲线与未处理病毒生长曲线的差异通过不同剂量辐照后评价辐照杀灭病毒的效果。

进一步地，所述方法还包括：利用qPCR方法检测辐照后病毒的核酸变化进行验证辐照杀灭病毒的效果并确定合适的辐照条件。

进一步地，所述利用qPCR方法检测辐照后病毒，具体包括：

1)将辐照后病毒分别感染细胞，收集细胞培养上清及细胞，抽提RNA备用；

2)将RNA样品反转录；

3)采用病毒相应引物及病毒模板DNA或cDNA将样品进行PCR扩增，将PCR产物纯化后连接载体，挑取阳性单克隆进行测序，测序正确的阳性质粒作为绘制标准曲线的标准质粒；测定标准质粒的浓度并稀释进行qPCR反应，根据每个稀释度的标准品的拷贝数及CT值绘制标准曲线；

4)对辐照后的病毒DNA或cDNA进行qPCR扩增，利用标准曲线分析病毒核酸拷贝数的变化；

5)采用qPCR方法计算辐照后的病毒核酸含量，根据病毒载量结果分析合适的辐照条件。

本发明的效果在于：本发明首先选择一类RNA有囊膜病毒作为样本进行辐照，对病毒样本进行不同剂量的辐照处理，获得辐照处理后的不同病毒的病毒滴度与未处理病毒的病毒滴度并比较两者差异，根据差异值评价辐照杀灭病毒的效果，并利用核酸法进行了验证，筛选出对辐照敏感的指示病毒，即辐照消杀的RNA有囊膜类指示病毒。利用本发明的几种RNA有囊膜病毒可确定相似特征病毒灭活的辐照剂量范围，并研究建立病毒辐照灭活工艺有效性控制方法，构建生物指示剂制备方法，利用筛选出的指示病毒可为实际生产过程RNA有囊膜类病毒的去除/灭活的有效性作出定量评估，并可用于冷链食品辐照过程中的生物辐照指示剂。

附图说明

图1-图10为本发明实施例示意的10种病毒样本辐照后的灭活曲线图。

图11为辐照后的口泡炎病毒(左)和传染性支气管炎病毒核酸拷贝数变化示意图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步描述，但本发明的实施方式不限于此。

本发明所述的一种用于食品辐照消杀的指示病毒的筛选方法，通过选择一类RNA有囊膜病毒进行辐照，开展辐照杀伤的剂量选择及指示病毒遴选实验，通过不同剂量辐照后评价辐照杀灭病毒的效果，并筛选出可用于冷链食品加工过程中的辐照消杀指示病毒，解决不同大小的RNA有囊膜的烈性病毒辐照过程中的质控问题。也可为将来可能发生的病毒类疫情提供应急储备。

以下实施例所用的材料与仪器如下：

试剂：EMEM培养基、PBS、DMEM培养基、FBS、干冰，DNA抽提试剂盒、RNA抽提试剂盒、反转录试剂盒、SYBR GREEN I荧光定量PCR试剂盒、质粒抽提试剂盒、凝胶纯化试剂盒、PMD-19T载体试剂盒。

细胞：CRFK细胞、MARC145细胞、Vero细胞、CK细胞

仪器及耗材：荧光定量PCR仪、PCR仪、水浴锅、CO

如无特殊说明，本发明实施例涉及的试剂和仪器均可从市售渠道获得。

实施例1

(1)通过病毒结构学分析，根据病毒理化性质，筛选出了RNA有囊膜的病毒，如表1所示的拟建立的用于辐照消杀的病毒库。

表1

(2)细胞培养：在T75细胞培养瓶中加入10％DMEM完全培养基15ml，于5％CO

(3)病毒扩增：提前一天将细胞按照1:6传至T75细胞培养瓶中，过夜培养，次日待细胞密度达到80-90％可用于扩增病毒。根据感染的MOI计算所需病毒液体积，将原培养瓶中的培养基弃去，用PBS清洗细胞三次后，向培养瓶中加入15ml病毒分离无血清培养基(含2μg/ml TPCK)及相应病毒液，并在培养瓶上标明病毒种类、体积、时间等。并设置细胞对照。连续观察细胞病变情况，待细胞病变程度达到80％作用可以收毒。收毒时，先将病毒液置于-80℃冰箱冻融一次，重悬细胞并将液体转移至50ml离心管中，4℃，8000rpm，离心10min后，去掉细胞碎片，将上清混匀后分装。

(4)辐照灭活:在保持-20度的低温条件下，将病毒液分别用0、2、4、7、10、15kGy的γ射线进行照射，每个病毒三个重复，每孔0.5mL，同时设计未照射组病毒。

将照射前后的不同病毒用空斑法或TCID50法测定其病毒滴度，选择去除/灭活指数>4Log10以上评估辐照灭活病毒效果。图1-10示意了10种病毒辐照后的灭活曲线(辐照灭活率)，表2示意了三种病毒经辐照后感染细胞24小时病毒载量。

表2

根据上述实施方案，10种RNA有囊膜病毒中只有传染性支气管炎病毒、口泡炎病毒2种在10kGy剂量下病毒滴度可降低4log值，因此在冷链食品进行辐照消杀的过程中传染性支气管炎病毒、口泡炎病毒可作为指示病毒。

实施例2

(1)利用qPCR方法检测辐照后病毒的核酸变化

按照实施例1的方法将辐照后的病毒稀释至103、104、105log10/ml分别感染细胞，病毒感染48h后，收集细胞培养上清及细胞，抽提RNA备用。

(2)RNA样品反转录，反转录反应体系及条件如下：

5×HiScript II Select qRT SuperMix 4uL，Random primer 1uL，RNA 15uL(约1ug)，50℃15min，85℃15s，cDNA放入-20℃备用。

qPCR引物名称及序列如表3所示：

表3

(3)荧光定量PCR反应体系及条件

反应体系：qPCRmix：10uL，ddH2O:7.2uL，Primer-F:0.4uL，Primer-R:0.4uL，cDNA或DNA：2uL。

反应条件：95℃预变性30s；95℃变性10s，60℃退火30s，40个循环；熔解曲线：95℃15s，60℃60s，95℃15s。

(4)阳性质粒的构建及标准曲线的绘制

分别利用表3所述引物及病毒模板DNA或cDNA进行PCR扩增，将PCR产物纯化后连接PMD-19T载体，挑取阳性单克隆进行测序，测序正确的阳性质粒作为绘制标准曲线的标准质粒，-20℃保存备用。

测定标准质粒的浓度，并用ddH

(5)辐照后测定病毒核酸

对检测辐照后的病毒DNA或cDNA进行qPCR扩增，利用标准曲线分析病毒核酸拷贝数的变化。图11示意了辐照后的口泡炎病毒(左)和传染性支气管炎病毒核酸拷贝数(右)变化图。

(6)根据病毒载量结果分析合适的辐照条件。

qPCR方法计算辐照后的病毒核酸含量，结果显示，与TCID50结果类似，不同剂量的病毒各个辐照剂量组与mock组差异显著，病毒拷贝数显著降低，当辐照剂量≥10kGy时，病毒拷贝数与阴性对照无明显差异。

因此，根据TCID50法和qPCR法验证，说明传染性支气管炎病毒、口泡炎病毒可作为冷链食品辐照消杀的RNA有囊膜指示病毒。

本领域技术人员应该明白，本发明所述方法并不限于具体实施方式中所述的实施例，上面的具体描述只是为了解释本发明的目的，并非用于限制本发明。本领域技术人员根据本发明的技术方案得出其他的实施方式，同样属于本发明的技术创新范围，本发明的保护范围由权利要求及其等同物限定。