一种食源性蜡样芽孢杆菌致病性和危害的评估方法

技术领域

本发明涉及生物监测技术领域，具体为一种食源性蜡样芽孢杆菌致病性和危害的评估方法。

背景技术

蜡样芽孢杆菌是革兰氏阳性芽孢杆菌，广泛存在于自然环境中，对不良环境有较强的抵抗力，是一种人畜共患的食源性条件致病菌。据国内外报道，几乎所有种类食品中都曾检测到蜡样芽孢杆菌蜡样芽孢杆菌能够产生多种毒素，这些毒素决定了其致病性。食源性致病菌引起的疾病的临床表现基本都包含胃肠道症状——腹泻。众多研究发现，食源性疾病的发生与肠道菌群有很大的关系。肠道微生态是世界相关科学界最为关注的领域，肠道微生物通过彼此与宿主之间的细胞活动影响消化道及机体的健康。

婴幼儿时期免疫系统尚未成熟，胃肠屏障功能较弱，胃肠排空较快，对感染的抵抗能力较差，另外，正常的肠道菌群在婴幼儿时期尚未建立完善，拮抗肠道入侵病原微生物的能力弱，食品中的微生物污染使婴幼儿发生肠道感染的机率增高，日常监督抽样检验仅局限于检出或者未检出某种食源性致病菌，并未对致病菌的致病性及危害做出分析。

因此，本研究通过动物实验拟对检出的蜡样芽孢杆菌可能导致疾病发生的风险和危害进行评估，探索其致病机制，为诊断、预防和控制食源性疾病的暴发提供参考。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种食源性蜡样芽孢杆菌致病性和危害的评估方法，解决了婴幼儿时期免疫系统尚未成熟，胃肠屏障功能较弱，胃肠排空较快，对感染的抵抗能力较差，另外，正常的肠道菌群在婴幼儿时期尚未建立完善，拮抗肠道入侵病原微生物的能力弱，食品中的微生物污染使婴幼儿发生肠道感染的机率增高，日常监督抽样检验仅局限于检出或者未检出某种食源性致病菌，并未对致病菌的致病性及危害做出分析的问题。

(二)技术方案

为实现上述通过动物实验拟对检出的蜡样芽孢杆菌可能导致疾病发生的风险和危害进行评估目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供一种食源性蜡样芽孢杆菌致病性和危害的评估方法，包括以下步骤：

(a)从婴幼儿辅食中分离培养蜡样芽孢杆菌；

(b)测定细菌浓度，稀释菌液获得所需浓度的菌悬液；

(c)将小鼠分为若干组，分别灌胃不同浓度的菌悬液；

(d)每日喂食成品小鼠饲料和水，喂食7天，记录每日饮食、饮水量与体重变化；

(e)摘除眼球，眼眶取血，用于血液生理生化指标测定；

(f)脱颈处死小鼠，酒精消毒后迅速解剖；

(g)摘取盲肠，将盲肠纵向刨开，挤出内含物；

(h)从肠道内含物中提取基因组DNA后，用带有barcode(测序接头)的特异引物扩增16S V3-V4区域。

优选的，步骤(a)中食源性致病菌蜡样芽孢杆菌直接来自于婴幼儿辅食，用分离培养基培养获得。

优选的，步骤(b)中所得菌种经液体培养基培养后，菌液浓度梯度稀释成107、105、103CFU/mL的菌悬液。

优选的，步骤(c)中所述小鼠为八周龄，体重20±2g的小鼠。

优选的，步骤(c)中所述小鼠分为8组，分为高浓度组、中浓度组、低浓度组、空白对照，每组又设置雌雄组。

优选的，步骤(c)中每日每只小鼠灌喂0.2ml菌液，连续灌胃7天，所述步骤(d)中每日记录饮水量、饮食量和体重变化。步骤(e)中摘除眼球前，称量小鼠体重。

优选的，步骤(e)部分血液收集到含有EDTA K2的抗凝管中，用于血液生理指标测定。

优选的，步骤(e)另一部分血液收集到含有促凝剂的血清管中，3000r/min，离心10min后取血清，进行血生化测定。

优选的，步骤(h)从小鼠肠道内含物中提取基因组DNA后，用带有barcode(测序接头)的特异引物扩增16S V3-V4区。PCR产物纯化后，用ABIStepOnePlus Real-Time PCRSystem进行定量，构建测序文库，Illumina上机测序(测序策略PE250)。

优选的，步骤(h)后，通过R语言对OTU物种表中不同组的细菌组成、多样性特征进行可视化作图。

(三)有益效果

与现有技术相比，本发明提供了一种食源性蜡样芽孢杆菌致病性和危害的评估方法，具备以下有益效果：

1、该食源性蜡样芽孢杆菌致病性和危害的评估方法，通过动物实验拟对检出的蜡样芽孢杆菌可能导致疾病发生的风险和危害进行评估，探索其致病机制，为诊断、预防和控制食源性疾病的暴发提供参考。

2、该食源性蜡样芽孢杆菌致病性和危害的评估方法，通过脱颈处死小鼠，酒精消毒后迅速解剖；摘取盲肠，将盲肠纵向刨开，挤出内含物收集小鼠盲肠内含物；从肠道内含物中提取基因组DNA，用带有barcode(测序接头)的特异引物扩增16S V3-V4区。PCR产物纯化后，用ABI StepOnePlus Real-Time PCR System进行定量，构建测序文库，Illumina上机测序(测序策略PE250)，通过R语言对OTU物种表中不同组的细菌组成、多样性特征进行可视化作图。

附图说明

图1为本发明中8个类群丰度均值排名top10门水平的相对丰度；

图2为本发明中8个类群的丰度均值排名top10属水平的相对丰度；

图3为本发明中初始体重与解刨前体重对比；

图4为本发明血液生理生化指标；

图5为本发明拟杆菌门与厚壁菌门比列图。

具体实施方式

下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一：

一种食源性蜡样芽孢杆菌致病性和危害的评估方法，包括以下步骤：

(a)从婴幼儿辅食中分离培养蜡样芽孢杆菌，食源性致病菌蜡样芽孢杆菌直接来自于婴幼儿辅食，用分离培养基培养获得；

(b)测定细菌浓度，稀释菌液获得所需浓度的菌悬液，所得菌种经液体培养基培养后，菌液浓度梯度稀释成107、105、103CFU/mL的菌悬液；

(c)将小鼠分为若干组，分别灌胃不同浓度的菌悬液，小鼠为八周龄，体重20±2g的小鼠，小鼠分为8组，分为高浓度组、中浓度组、低浓度组、空白对照，每组又设置雌雄组，每日每只小鼠灌喂0.2ml菌液，连续灌胃7天；

(d)每日喂食成品小鼠饲料和水，喂食7天，记录每日饮食、饮水量与体重变化，每日记录饮水量、饮食量和体重变化；

(e)摘除眼球，眼眶取血，用于血液生理生化指标测定，摘除眼球前，称量小鼠体重，部分血液收集到含有EDTA K2的抗凝管中，用于血液生理指标测定，另一部分血液收集到含有促凝剂的血清管中，3000r/min，离心10min后取血清，进行血生化测定；

(f)脱颈处死小鼠，酒精消毒后迅速解剖，从小鼠肠道内含物中提取基因组DNA后，用带有barcode(测序接头)的特异引物扩增16S V3-V4区。PCR产物纯化后，用ABIStepOnePlus Real-Time PCR System进行定量，构建测序文库，Illumina上机测序(测序策略PE250)；

(g)摘取盲肠，将盲肠纵向刨开，挤出内含物；

(h)从肠道内含物中提取基因组DNA后，用带有barcode(测序接头)的特异引物扩增16S V3-V4区域，通过R语言对OTU物种表中不同组的细菌组成、多样性特征进行可视化作图。

将蜡样芽孢杆菌从婴幼儿辅食中分离后，用液体培养基培养至悬浊状态；菌液梯度稀释为107、105、103CFU/ml。

选取56只健康的八周龄小鼠，体重20±2g，随机分为8组，分别为蜡样芽孢杆菌低剂量雌雄组(LLF，LLM)、蜡样芽孢杆菌中剂量雌雄组(LMF，LMM)、蜡样芽孢杆菌高剂量雌雄(LHF，LHM)和雌雄对照组(CF，CM)，每组各7只。采用小鼠灌胃器每日每只小鼠灌胃1次菌悬液，用量均为0.2mL/只；对照组每天每只灌胃等量的0.9％氯化钠溶液。试验期间，按常规饲养程序饲养小鼠，试验周期为7d，记录每日饮食量与体重变化。第8天取样，实验前禁食12h，禁水1h。

第八天称量小鼠体重，摘除眼球，眼眶取血。取0.5mL血液到EDTA K2抗凝管内，进行血生理测定。12项血生理指标为：血红蛋白(HGB)、红细胞(RBC)计数、白细胞(WBC)计数、淋巴细胞％(LYM％)、血小板(PLT)数目、平均血小板体积(MPV)、血小板压积(PCT)、红细胞压积(HCT)、平均红细胞体积(MCV)、红细胞平均血红蛋白(MCH)、平均血红蛋白浓度(MCHC)、红细胞体积分布宽度(RDW)。

将剩余0.5mL全血加入到血清管中，3000r/min，离心10min后取血清，进行血生化测定。15项血清生化指标为：总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLOB)、白蛋白/球蛋白(A/G)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、血糖(GLU)、总胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、总胆红素(TBIL)、尿素(UN)、肌酐(CREA)、无机磷(P)、血钙(Ca)。

脱颈处死小鼠，酒精消毒后迅速解剖；摘取盲肠，将盲肠纵向刨开，挤出内含物收集小鼠盲肠内含物；从肠道内含物中提取基因组DNA，用带有barcode(测序接头)的特异引物扩增16S V3-V4区。PCR产物纯化后，用ABI StepOnePlus Real-Time PCR System进行定量，构建测序文库，Illumina上机测序(测序策略PE250)。通过R语言对OTU物种表中不同组的细菌组成、多样性特征进行可视化作图。

如图1和图2，小鼠肠道菌群中最主要的优势菌门是拟杆菌门(Bacteroidota)，厚壁菌门(Firmicutes)，疣微菌门(Verrucomicrobiota)。采用单因素方差分析(one-wayANOVA)检测实验组和对照组在门和属水平上的类群相对丰度差异，具有统计学意义(P<0.05)。

如图5，拟杆菌门与厚壁菌门同为肠道主要菌群之一，二者之间存在一种互相促进的共生关系，可共同促进宿主吸收或储存能量，故消化道内拟杆菌门与厚壁菌门对发酵多糖十分重要。拟杆菌门降低或者厚壁菌门增高均有助于促进肥胖。在灌胃不同剂量蜡样芽孢杆菌后，拟杆菌门(Bacteroidetes)的丰度在3个处理组中均显著增加，而厚壁菌门(Firmicutes)的丰度均有所减少，拟杆菌门与厚壁菌门比例高于对照组。

如图3，实验组体重增长速度明显快于对照组，拟杆菌门与厚壁菌门之间的比率与维持体内平衡有关，该比率的变化可能导致各种疾病，具体来说，当厚壁菌门减少或拟杆菌门相对于厚壁菌门增加时，就会导致慢性炎症和消化系统疾病，如克罗恩病和溃疡性结肠炎。

此外，实验组中乳酸菌属(Lactobacillus)和阿克曼氏菌属(Akkermansia)相对丰度显著减少。在健康条件下，乳酸菌属和阿克曼氏菌属的微生物是肠道群落的重要成员，其数量的缺乏，通常与肠道整体健康状况的恶化有关。乳酸菌可以产生一些特殊的酶系，补充人体消化酶上的不足，帮助分解上消化道未被充分水解吸收的营养物质，有利于人体进一步吸收利用，包括增加人体必需的维生素、氨基酸、微量元素、某些无机盐类(如钙、磷、铁、钴等)的吸收和利用。乳酸菌减少时，会导致消化吸收功能的衰退，影响肠道寿命。肠道中低水平的阿克曼氏菌可能导致黏膜层的变薄，从而导致肠道屏障功能减弱，使肠道内的毒素更容易侵入人体。

如图4，(A)为平均红细胞体积(MCV)，(B)为血小板(PLT)数目，(C)为平均血小板体积(MPV)，(D)为丙氨酸氨基转移酶，(E)为肌酐(CREA)，(F)为血钙。平均红细胞体积(MCV)、血小板(PLT)数目和平均血小板体积(MPV)，是临床上非常重要的三个血项指标。其中，平均红细胞体积偏高会增加血液的黏度。血液流动时会出现摩擦，患者容易出现高血压、糖尿病以及冠心病，还会影响下肢静脉阻塞，严重影响患者的健康。血小板数目偏高以后人体发生血栓性疾病的机会就会增加。MPV增大可作为骨髓造血功能恢复的较早期指症：骨髓造血功能衰竭。实验组平均红细胞体积(MCV)显著高于对照组，雄性实验组中血小板(PLT)数目和平均血小板体积(MPV)偏高。实验组丙氨酸氨基转移酶含量降低，肌酐(CREA)含量升高，血钙含量无明显变化。

综上所述，蜡样芽孢杆菌的入侵破环了肠道的微生态平衡，导致小鼠肠道菌群结构和功能的显著变化，并对机体生理生化及免疫产生了影响。这些发现为全面理解蜡样芽孢杆菌在食物中毒和胃肠炎疾病发生中的致病作用提供了依据，也为食源性疾病临床诊断、预防和治疗提供了技术支撑。

该食源性蜡样芽孢杆菌致病性和危害的评估方法，通过动物实验拟对检出的蜡样芽孢杆菌可能导致疾病发生的风险和危害进行评估，探索其致病机制，为诊断、预防和控制食源性疾病的暴发提供参考，通过脱颈处死小鼠，酒精消毒后迅速解剖；摘取盲肠，将盲肠纵向刨开，挤出内含物收集小鼠盲肠内含物；从肠道内含物中提取基因组DNA，用带有barcode(测序接头)的特异引物扩增16S V3-V4区。PCR产物纯化后，用ABI StepOnePlusReal-Time PCR System进行定量，构建测序文库，Illumina上机测序(测序策略PE250)，通过R语言对OTU物种表中不同组的细菌组成、多样性特征进行可视化作图，解决了婴幼儿时期免疫系统尚未成熟，胃肠屏障功能较弱，胃肠排空较快，对感染的抵抗能力较差，另外，正常的肠道菌群在婴幼儿时期尚未建立完善，拮抗肠道入侵病原微生物的能力弱，食品中的微生物污染使婴幼儿发生肠道感染的机率增高，日常监督抽样检验仅局限于检出或者未检出某种食源性致病菌，并未对致病菌的致病性及危害做出分析的问题。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。