表达HSV-1gD-IL-2-Fc融合基因重组乳酸菌及其用途

技术领域

本发明属于生物制品领域，具体涉及一种表达HSV-1gD-IL-2-Fc融合基因重组乳酸菌及其用途。

背景技术

1型单纯疱疹病毒(HSV-1)是一种常见的疱疹病毒，主要通过呼吸道、皮肤和黏膜密切接触传播，可引起疱疹性口腔炎、疱疹性角膜炎等，还可引起肺炎，尤其是器官移植等免疫力低下的患者，导致肺内病变，引起肺组织纤维化急性加重。HSV-1可在三叉神经节内终生潜伏，病毒能在宿主体内持续存在但宿主本身不表现任何相关的临床症状；潜伏感染的HSV-1病毒可由潜伏状态被再次激活并伴随具感染力的病毒颗粒产生；病毒处于潜伏感染状态时，不表达任何相关的增殖性基因，但在宿主细胞核内会大量积累潜伏相关转录体(Latency-Associated transcripts，LATs)；病毒不表达相关抗原，但宿主体内可检测到病毒基因组的存在。

目前医疗研究对抗HSV-1的疫苗的研究尚未完全成熟，临床除了一些支持治疗外，主要通过服用阿昔洛韦、伐昔洛韦等为代表的核苷(酸)类抗HSV-1药物，以控制症状和复发。然而该类药物不良反应较大，且交叉耐药性逐年递增。为此，我们努力尝试寻找新的治疗方法，来弥补HSV-1的治疗的缺口。

HSV疫苗研究已开展多年，并取得了一定进展，但目前针对HSV的疫苗研究仍停留在体外实验、动物实验和上市前临床试验阶段，全球范围内尚无HSV疫苗经批准上市。且现有的已表达的抗原基因其他形式的融合蛋白通过滴鼻方式不能有效地跨越呼吸道粘膜屏障而转运进入体内，影响其效果发挥。

发明内容

鉴于以上技术问题，本发明提供一种表达HSV-1gD-IL-2-Fc融合基因重组乳酸菌。

本发明第一方面，提供一种表达HSV-1gD-IL-2-Fc融合基因重组乳酸菌，其是将HSV-1gD基因、IL-2基因及IgG Fc片段基因插入到乳酸菌表达载体中并转化乳酸菌获得。

优选地，其具体是按照以下步骤获得：

利用融合PCR将HSV-1gD基因与IL-2基因通过linker1融合，得到gD-IL-2；

利用融合PCR将所述gD-IL-2与IgG Fc基因通过linker2融合，得到融合片段gD-IL-2-Fc；

将所述融合片段gD-IL-2-Fc连接在pUC57载体上获得重组载体pUC57-gD-IL-2-Fc；

以所述重组载体pUC57-gD-IL-2-Fc为模板，扩增HSV-1gD基因、IL-2基因及IgG Fc基因，回收含有HSV-1gD基因、IL-2基因及IgG Fc基因的目标片段；再将含有HSV-1gD基因、IL-2基因及IgG Fc基因的目标片段进行融合PCR扩增得到gD-IL-2-Fc；

将pNZ8148质粒与所述gD-IL-2-Fc分别利用NcoI与KpnI进行双酶切，所得酶切产物连接，获得连接产物；

将所述连接产物电转化至乳酸乳球菌NZ3900感受态细胞，得到表达HSV-1gD-IL-2-Fc融合基因重组乳酸菌；

所述linker1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述linker2的核苷酸序列如SEQID NO:4所示。

优选地，

扩增HSV-1gD基因的引物序列为：F1：

CATG

R1:

扩增IL-2基因的引物序列为：F2:

R2-2:

扩增IgG Fc基因的引物序列为：

F3:

R3：AAT

优选地，融合PCR扩增及扩增HSV-1gD基因、IL-2基因及IgG Fc基因所用扩增反应体系均为：2×PrimeSTAR Premix 25μL、pUC57-gD-IL-2-Fc1μL、上游引物1μL、下游引物3μL、ddH

优选地，融合PCR扩增及扩增HSV-1gD基因、IL-2基因及IgG Fc基因所用扩增条件均为：98℃3min，98℃15sec，58℃15sec，72℃10s，30个循环后72℃延伸10min。

优选地，所述双酶切所用酶切体系为：表达载体或PCR产物10μL、NcoI 1.5μL、KpnI1.5μL、10×Fast digestion 3μL。

本发明第二方面，提供一种所述重组乳酸菌在制备免疫调节产品中的用途。

优选地，所述重组乳酸菌用于制备抗HSV-1的疫苗。

对比现有技术，本发明的有益效果为：

1、将HSV-1包膜蛋白gD与IgG Fc片段融合，借助FcRn模仿IgG跨黏膜屏障的运输途径，解决了跨黏膜传输的关键问题。同时由于gD-IL-2-Fc具有FcγRI结合位点更有利于抗原递呈细胞对其的识别与摄取。

2、融合IL-2作为疫苗佐剂，与单独使用疫苗相比，动物IL-2融合疫苗的抗体滴度更高，并且T滤泡辅助细胞和生发中心B细胞扩增。

3、选用乳酸乳球菌作为外源蛋白的转运载体，可直接口服，避免了因静脉注射疫苗所带来的感染，且疫苗本身的副作用小，乳酸乳球菌本身易于培养易操作低成本，且乳酸乳球菌的某些特殊菌株可以定植于肠道从而提高机体的免疫机能。

附图说明

图1是重组质粒的PCR扩增；M：DNA marker，1：gD-IL-2-Fc，2：gD-IL-2；

图2是重组质粒的酶切鉴定；M：DNA marker，1：gD-IL-2-Fc，2：gD-IL-2；

图3是融合蛋白的SDS-PAGE与Western blot检测；M:Protein marker，1:NegativeControl，2:gD-IL-2，3:gD-IL-2-Fc；

图4是重组乳酸菌对小鼠血清IFN-γ(A)、IL-4(B)、IgG(C)水平的影响；

图5是重组乳酸菌对小鼠免疫功能的影响；A、免疫小鼠血清IgA水平检测，B、免疫小鼠外周血T淋巴细胞的增殖变化，C、免疫小鼠脾脏T淋巴细胞的增殖变化；

图6重组乳酸菌抵抗HSV-1的感染；

图7是重组乳酸菌免疫小鼠攻毒后肺组织HE切片观察。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

HSV-1的gD蛋白一直是HSV-1疫苗或新治疗策略的主要候选者。白细胞介素-2(IL-2)因具有免疫增强剂、抗肿瘤和抗感染的特点，在临床上主要用于治疗和辅助治疗各种恶性肿瘤和感染性疾病。本发明以pNZ8148-gD-IL-2-Fc为融合基因质粒，并采用乳酸乳球菌NZ3900作为外源蛋白转运载体制备得到融合基因重组乳酸菌。其中gD为I型单纯疱疹病毒的主要包膜糖蛋白之一，均采用胞外区基因组，IL-2为免疫佐剂，能够增强机体对抗原的反应性，其中IL-2能同时加强体液免疫和细胞免疫，主要倾向于加强细胞免疫。由于病毒在细胞内复制，体液免疫在病毒感染中作用有限，而IL-2是细胞免疫中居中心地位的细胞因子，这提示其在HSV-1感染中具有重要作用。另有资料显示，细胞因子基因佐剂免疫增强效果优于细胞因子，推测细胞因子基因佐剂被细胞摄取后，表达的细胞因子能够较长时间刺激免疫活性细胞，促进抗原诱导的体液免疫和细胞免疫。同时本发明还融合IgG Fc片段，借助FcRn模仿IgG跨黏膜屏障的运输途径，解决跨黏膜传输的关键问题。

实施例1

HSV-1gD-IL-2-Fc融合基因重组乳酸菌的制备

1、目的基因片段、引物的设计与合成

将HSV-1KOS株糖蛋白gD基因(GenBank：JQ320083.1，如SEQ ID NO:1所示)、linker1(ggcgggggtg ggtccggagg aggtggctcg，如SEQ ID NO:2所示)、小鼠IL-2基因(GenBank：X07256.1，序列如SEQ ID NO:3所示)融合在一起命名为gD-IL-2。

将融合后基因片段gD-IL-2与小鼠IgG2a的重链基因(即IgG Fc基因，登陆号GenBank：V00798.1，如SEQ ID NO:5所示)用linker2(ggatcaggcg ggggtgggtc cggaggaggtggctcgggat ct，如SEQ ID NO:4所示)融合命名为gD-IL-2-Fc。

将融合后基因片段gD-IL-2与gD-IL-2-Fc分别(由金斯瑞生物科技有限公司合成)连接在pUC57载体上获得重组载体，将重组载体分别命名为pUC57-gD-IL-2与pUC57-gD-IL-2-Fc。

2、gD基因、IL-2基因、IgG Fc片段基因扩增

以pUC57-gD-IL-2质粒为模板，引物F1、R1扩增gD，引物F2、R2扩增IL-2；将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定大小正确后，将目标片段切下，用凝胶回收试剂盒(购自北京全式金生物技术有限公司)回收，再将gD与IL-2片段进行融合PCR扩增得到gD-IL-2。

以pUC57-gD-IL-2-Fc质粒为模板，引物F1、R1扩增gD，引物F2、R2-2扩增IL-2，引物F3、R3扩增Fc，将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定大小正确后，将目标片段切下，用凝胶回收试剂盒(购自北京全式金生物技术有限公司)回收，再将gD、IL-2与Fc片段进行融合PCR扩增得到gD-IL-2-Fc。

各引物序列如下：

gD上游引物F1加上了保护性碱基(CATG)、Nco I酶切位点(如下划线所示的序列)和防移码突变碱基(如黑体所示的序列)，6个his标签(如斜体所示)，下游引物R1引入linker1(linker1为如下划线所示的序列)：

F1：CATG

R1:

IL-2上游引物F2引入linker1(如下划线所示的序列)，下游引物R2加上了保护碱基AAT、KpnI酶切位点(如下划线所示的序列)，若融合Fc基因则使用下游引物R2-2，引入linker2(linker2为如下划线所示的序列)，

F2:

R2:AAT

R2-2:

Fc的上游引物F3引入linker2(如下划线所示的序列)，下游引物引物R3加入保护碱基AAT，KpnI酶切位点(如下划线所示的序列)，

F3:

R3：AAT

以上PCR扩增反应体系如表1所示，扩增条件设定为：98℃3min，98℃15sec，58℃15sec，72℃10s，30个循环后72℃延伸10min。

表1基因扩增的反应体系

如图1所示，经过融合PCR之后，得到了与预期大小相符的gD-IL-2与gD-IL-2-Fc，分别为1367bp、2078bp。

3、gD-IL-2、gD-IL-2-Fc基因与载体的酶切连接

上述所得PCR产物用NcoI与KpnI于37℃双酶切3h，pNZ8148也用NcoI与KpnI于37℃双酶切3h，酶切体系如表2所示：

表2表达载体或PCR产物的双酶切体系

酶切后的PCR产物gD-IL-2、gD-IL-2-Fc分别与载体酶切产物连接，和载体pNZ8148产物分别用胶回收试剂盒(购自北京全式金生物技术有限公司)纯化，然后于16℃条件下过夜连接，获得连接产物。连接体系如表3所示：

表3连接体系

4、乳酸菌的电转

1)培养乳酸菌NZ3900(华中农业大学肖运才教授馈赠)，制备乳酸菌感受态细胞

从新鲜培养板上挑取单菌落接种于5mL GM(0.5％葡萄糖)培养液中，30℃培养过夜；取5mL NZ3900转种于50mL GSGM17培养液中30℃过夜培养；再取5mL NZ3900转种于400mL GSGM17培养液中，30℃培养至OD值为0.2～0.3时，4℃、4000r/min离心20min，收集菌体；用400mL溶液I(溶液I由蔗糖与甘油混合而成，且溶液I中蔗糖浓度为0.5mol/L，甘油浓度为100ml/L)洗涤1次；加100mL溶液II(溶液II由蔗糖、甘油及EDTA混合而成，且溶液II中蔗糖浓度为0.5mol/L、甘油浓度为100ml/L、EDTA浓度为0.05mol/L)，充分混匀后于冰上静置15min，4℃、4000r/min离心20min，收集菌体；继续用100mL溶液I洗涤1次，最后用4mL溶液I悬浮细菌，并分装成每管40μL，于-80℃贮存。

2)电转

用上述连接产物电转化乳酸乳球菌NZ3900感受态细胞，将转化产物涂布于Elliker筛选培养基(20g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、4g/L氯化钠、1.5g/L乙酸钠、0.5g/LL(+)抗坏血酸、15g/L琼脂糖、0.5％乳糖、0.004％溴甲酚紫)上。30℃静置培养24h后挑取平板上的单个黄色菌落进行培养，12h后用菌液做PCR鉴定(乳酸菌的鉴定引物，pNZ8148-F：GATTTCGTTCGAAGGAACTAC，如SEQ ID NO:11所示；pNZ8148-R：ATCAATCAAAGCAACACGTGC，SEQID NO:12所示)。菌液PCR鉴定正确后，提取pNZ8148-gD-IL-2与pNZ8148-gD-IL-2-Fc重组质粒，经双酶切和测序鉴定正确后，将所得的重组乳酸乳球菌命名为pNZ8148-gD-IL-2与pNZ8148-gD-IL-2-Fc融合基因重组乳酸菌。

如图2所示，重组质粒双酶切后得到与pNZ8148大小一致的大片段、与gD-IL-2大小一致的小片段及与gD-IL-2-Fc基因大小一致的小片段，其双酶切图谱如图2所示，证明此克隆为阳性克隆。测序结果与预期核苷酸序列完全一致。pNZ8148-gD-IL-2与pNZ8148-gD-IL-2-Fc融合基因重组乳酸菌构建成功。

5、重组乳酸菌菌pNZ8148-gD-IL-2与pNZ8148-gD-IL-2-Fc的表达及鉴定：

将pNZ8148-gD-IL-2与pNZ8148-gD-IL-2-Fc重组菌以1:25体积比接种于M17液体培养基(购自青岛高科园海博生物技术有限公司)中，当浓度OD

如图3所示，经过SDS-PAGE与Western blot实验，重组gD-IL-2与gD-IL-2-Fc蛋白成功得到诱导表达。

实施例2

HSV-1gD-IL-2-Fc融合基因重组乳酸菌的免疫效果评价

制造免疫动物模型

取相同周龄大小的小鼠40只，随机均分为4组，两组为实验组(pNZ8148-gD-IL-2组、pNZ8148-gD-IL-2-Fc组)，另外两组为对照组(PBS组、pNZ8148组)。实验组经nisin诱导20h的pNZ8148-gD-IL-2或pNZ8148-gD-IL-2-Fc重组菌及其培养上清重组乳酸乳球菌灌胃，对照组分别进行野生型乳酸乳球菌、PBS灌胃。免疫程序为：首次免疫(1～3d)、加强免疫(11～13d)、最后1次免疫(21～23d)，每次免疫连续日服3d，每天1次。免疫结束7d后，对免疫小鼠进行麻醉，眼球采血后脱颈处死，将采集的新鲜血液4℃静置12h，4℃、1000r/min离心20min，收集血清，通过双抗体夹心ELISA的方法测定小鼠外周血中IFN-γ、IL-4、IgG与IgA的含量。无菌采集脾脏，同时无菌收集抗凝血，利用CCK-8测定法检测其脾脏T淋巴细胞及外周血T淋巴细胞的增殖效果。

方法

1、小鼠外周血中IFN-γ和IL-4的检测

采用双抗体夹心ELISA法测定IFN-γ和IL-4，操作步骤按Mouse IFN-gama与IL-4Enzyme immunoassay Kit说明书进行，具体操作步骤如下：

(1)将IFN-γ或IL-4标准品(试剂盒内带)按说明书依次稀释，稀释度分别是800pg/mL、400pg/mL、200pg/mL、100pg/mL、50pg/mL、0pg/mL，将其按顺序加入ELISA板中；

(2)分别设空白对照孔、标准品孔和待测样品孔，加不同浓度标准品50μL至ELISA板中，空白对照孔不加样品、酶标试剂及生物素标记的抗IFN-γ抗体，待测样品孔中先加入40μL样品，然后再加生物素标记的抗IFN-γ抗体或IL-4抗体10μL；

(3)每孔加入酶标试剂50μL，空白对照孔除外；

(4)封板膜封板后置37℃温育30min；

(5)将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用；

(6)小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此反复5次，拍干；

(7)按每孔先加入显色剂A 50μL，再加入显色剂B 50μL，轻轻振荡混匀，37℃避光显色10min；

(8)每孔加终止液50μL，此时溶液由蓝色立即转为黄色；

(9)用空白孔调零，测定450nm波长下各孔的吸光度，用标准品的浓度为横坐标，以吸光值作为纵坐标，在坐标纸上绘制标准曲线，用标准品的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式将OD450nm值转换成IFN-γ或IL-4的量(pg/mL)。

2、小鼠外周血IgG与IgA检测

间接酶联免疫吸附测定(ELISA)用于检测血清中的HSV-1特异性IgA和IgG抗体。

(1)包被：用包被液(pH 9.6、0.05moL/mL碳酸盐缓冲液)将纯化后的HSV-1gD蛋白(100μg/mL)包被到96孔酶标板上，4℃包被过夜；

(2)洗涤：弃去包被液，拍干，每孔加入洗涤液(含0.05％Tween20、0.01mol/LpH7.4PBS、PBST)，洗涤3次，每次5min，在吸水纸上将酶标板拍干；

(3)封闭：每孔加入含5％脱脂奶粉的PBST 100μL，37℃作用2h，甩干，洗板同上；

(4)加入待检测样品：加入100μL 1:200稀释的待检血清样品，37℃作用1h，同时设置对照，洗涤同上；

(5)加入HRP标记二抗：每孔加入1:5000稀释的HRP标记的山羊抗鼠IgG或IgA抗体100μL，37℃作用1h，同上洗涤；

(6)显色：加底物显色液(TMB)100μL避光显色10～20min；

(7)终止：每孔加50μL，浓度为2mol/L的浓硫酸终止液，作用5min；

(8)酶标仪检测OD

3、小鼠脾脏与外周血T淋巴细胞增殖活性检测

(1)无菌条件下采取脾脏，用无菌研磨杵将小鼠脾脏研磨挤压制成单细胞悬液，细胞悬浮于匀浆冲洗液中，将组织研磨液通过70μm细胞筛网滴加至离心管中，450g，离心10min，弃上清；如果是血液，将细胞分离专用抗凝剂与全血按1:6的比例混合，无菌采集抗凝血；加入与抗凝血等体积的样本稀释液混匀；

(2)取一支新的离心管，加入不少于4ml的分离液，小心吸取单细胞悬液加于分离液液面上，500g离心30min；

(3)离心后小心吸取第二层的环状乳白色淋巴细胞层到另一15ml离心管中，向离心管中加入5～10ml洗涤液，混匀细胞，400g，离心10min弃上清；

(4)用5ml清洗液重悬细胞沉淀，250g离心10min弃上清；

(5)用5ml清洗液重悬细胞沉淀，250g离心10min弃上清；

(6)用0.5ml RPMI-1640完全培养液重悬细胞。

(7)用0.4％台盼蓝染色法检测细胞活力>95％，同时进行细胞计数，调细胞浓度至1×10

(8)向每组T淋巴细胞悬液中加入50μL含HSV-1的RPMI-1640培养液(MOI＝1)，Vero细胞培养上清液，50μL 20μg/ml ConA的RPMI-1640完全培养液，对照孔只加RPMI-1640完全培养液；设三个重复孔；

(9)将淋巴细胞置于37℃、5％CO

(10)弃掉培养液，每孔加入100μL含有10ml CCK-8的RPMI-1640培养液，再培养3～4h；

(11)用酶联免疫检测仪检测，用空白对照孔调零，检测450nm波长下的光吸收度值(OD450nm)，结果以三重复孔平均值表示。

结果

用重组乳酸乳球菌免疫小鼠后，采集免疫30d小鼠外周血分离血清，通过双抗体夹心ELISA的方法测定小鼠外周血中的IFN-γ、IL-4、IgG与IgA的含量。如图4、5(A)所示，与对照组PBS、pNZ8148比较，pNZ8148-gD-IL-2和pNZ8148-gD-IL-2-Fc组中IFN-γ、IL-4、IgG与IgA水平较高且有极显著的差异(P﹤0.01)，且pNZ8148-gD-IL-2-Fc组显著高于pNZ8148-gD-IL-2组(P﹤0.01)。结果表明，以gD为靶标、IL-2为佐剂的重组乳酸乳球菌融合了Fc片段后效果更好。

采集免疫30d小鼠脾脏，用HSV-1刺激分离的脾脏T淋巴细胞，利用CCK-8测定法检测其脾脏T淋巴细胞的增殖效果。如图5所示，与对照组PBS、pNZ8148比较，pNZ8148-gD-IL-2和pNZ8148-gD-IL-2-Fc组中水平较高且有极显著的差异(P﹤0.01)。

表明本发明所构建的重组乳酸乳球菌疫苗具有良好的免疫原性，能显著提高机体的细胞和体液免疫应答水平。

实施例3

HSV-1gD-IL-2-Fc融合基因重组乳酸菌的病毒攻击实验

按照“制造免疫动物模型免疫”的分组与免疫程序：两组为实验组(pNZ8148-gD-IL-2组、pNZ8148-gD-IL-2-Fc组)，另外两组为对照组(空白组、pNZ8148组)；首次免疫(1～3d)、加强免疫(11～13d)、最后1次免疫(21～23d)，每次免疫连续日服3d，每天1次。免疫结束后对小鼠进行麻醉后攻毒，四组小鼠分别滴鼻感染HSV-1(10

方法：

1)HSV-1的拷贝数检测

将小鼠肺组织研磨后提取DNA。标准品为拷贝数为1×10

2)病理切片制备：

(1)脱水：浸泡24h的组织从10％的福尔马林溶液中取出，用洁净的去离子水漂洗两遍，然后放入浓度为70％的乙醇中，之后每过2h依次取出放入80％、90％及100％浓度的乙醇中，完成脱水过程；

(2)透明：将组织转入无水乙醇和二甲苯(1:1)的混合液中浸渍1.5h，然后转入二甲苯中浸渍，至组织呈透明状态；

(3)浸蜡与包埋：取出透明的组织放入融化的的石蜡内浸蜡，将浸蜡后的组织放入融化的固体石蜡中，待其凝固成含组织蜡块，即为包埋；

(4)切片和拷片：将蜡块稍稍修整后放入切片机上切成若干4～6μm的蜡带，待其在温水面上展平后，放于载玻片上在60℃温箱内烤片30min；

(5)染色：干燥的切片经二甲苯脱蜡，不同浓度酒精逐级脱苯，蒸馏水复水后进行HE染色，将染色后的切片经酒精梯度脱水，二甲苯透明；

(6)封片：在切片的中央加一滴中性树胶，缓缓将盖玻片放下。然后将制作好的切片置于普通倒置显微镜下观察。

结果

相对于对照组(PBS组、pNZ8148组)，pNZ8148-gD-IL-2组与pNZ8148-gD-IL-2-Fc组小鼠的HSV-1gD拷贝数明显降低，pNZ8148-gD-IL-2-Fc组更低(图6)，表明重组乳酸菌组能够抵抗HSV-1的感染。对照组小鼠感染HSV-1，可见组织结构破坏更严重，肺间质增厚，大量炎性细胞浸润，肺泡间隔减小，伴随组织液渗出等现象，重组乳酸菌免疫组小鼠感染HSV-1，肺组织结构基本完好，未见明显的炎性细胞浸润、组织液渗出等现像(图7)。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。