用于改善T细胞受体测序的方法
文献发布时间：2024-04-18 20:02:18
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技术领域
本公开提供了用于制备包括全长T细胞受体(TCR)序列的互补脱氧核糖核酸(cDNA)分子和确定那些TCR的核酸序列的方法。
背景技术
准确鉴定全长TCR序列为用于各种应用的重要步骤，包括但不限于，开发个性化药品和过继性细胞疗法，其中TCR多样性的丧失可导致无法鉴定治疗有效的分子。用于克隆TCR的常规方法基于逆转录聚合酶链式反应(PCR)随后第一轮和第二轮巢式PCR反应(其扩增TCRα链的VJ区段和TCRβ链的VDJ区段)的组合。这些区段可然后计算机分析，以允许全长TCR序列的重构。然而，以该方式重构的大部分的TCR序列展示不确定的结果。这种不确定性可，例如，与在扩增步骤期间掩盖TCR序列变异的巢式引物的使用相关。因此，仍需要开发能够提供精确的全长TCR序列的相对低成本的、高通量测序技术。
发明内容
本公开提供了用于制备包括全长TCR序列的cDNA和确定那些TCR的核酸序列的方法。在某些非限制性实施方式中，本公开提供了制备包括全长T细胞受体(TCR)序列的脱氧核糖核酸(DNA)的方法。在某些实施方式中，方法包括：通过将核糖核酸(RNA)分子以及与TCR编码序列的RNA分子3’的区域互补的cDNA合成引物、模板转换寡核苷酸(TSO)和逆转录酶在足够逆转录酶产生cDNA序列的条件下组合，获得TCR互补DNA(cDNA)序列；和通过将cDNA与包括与TSO序列退火的外引物和与TCR恒定序列退火的引物的第一组扩增引物和聚合酶在足够聚合酶产生包括全长TCR序列的DNA的条件下组合，制备包括全长TCR序列的DNA。在某些实施方式中，方法进一步包括对包括全长TCR序列的DNA测序。
在某些实施方式中，RNA分子提取自包括T细胞的样品。在某些实施方式中，样品收集自受试者。在某些实施方式中，cDNA合成引物为寡聚dT引物。在某些实施方式中，寡聚dT引物包括具有SEQ ID NO:1或2中列出的序列的多核苷酸。在某些实施方式中，TSO包括扩增引物位点、条形码和独特分子标识符(UMI)。在某些实施方式中，TSO包括具有SEQ ID NO:3-5中的任一条中列出的序列的多核苷酸。在某些实施方式中，逆转录酶为模板转换逆转录酶。
在某些实施方式中，外引物包括具有SEQ ID NO:6中列出的序列的多核苷酸。在某些实施方式中，内引物包括具有SEQ ID NO:11中列出的序列的多核苷酸。在某些实施方式中，与TCR恒定序列退火的引物包括具有SEQ ID NO:7、8、12和13中列出的序列的多核苷酸。在某些实施方式中，使用第二组扩增引物进一步扩增包括全长TCR序列的DNA，其中一条或两条引物包括条形码序列。在某些实施方式中，全长TCR受体包括TCRα链和/或TCRβ链。在某些实施方式中，全长TCR受体包括TCRγ链和/或TCRδ链。
在某些实施方式中，方法包括约20秒至约90秒的延伸阶段。在某些实施方式中，扩增引物包括浓度为约0.1μM至约0.6μM的正向引物。
在某些非限制性实施方式中，本公开也提供了通过在本文中公开的方法产生的cDNA文库。
在某些非限制性实施方式中，本公开进一步提供了分析单个T细胞以确定全长TCR序列的核酸序列的方法。在某些实施方式中，方法包括从包括多个T细胞的样品中分拣单个T细胞；制备包括全长TCR序列的DNA，包括：通过将核糖核酸(RNA)分子以及与TCR编码序列的RNA分子的3’区域互补的cDNA合成引物、模板转换寡核苷酸(TSO)和逆转录酶在足够逆转录酶产生cDNA序列的条件下组合，获得TCR互补DNA(cDNA)序列；和通过将cDNA与包括与TSO序列退火的外引物和与TCR恒定序列退火的引物的第一组扩增引物和聚合酶在足够聚合酶产生包括全长TCR序列的DNA的条件下组合，制备包括全长TCR序列的DNA；以及对包括全长TCR序列的DNA测序。在某些实施方式中，样品收集自受试者。
在某些实施方式中，cDNA合成引物为寡聚dT引物。在某些实施方式中，寡聚dT引物包括具有SEQ ID NO:1或2中列出的序列的多核苷酸。在某些实施方式中，TSO包括扩增引物位点、识别标签和独特分子标识符(UMI)。在某些实施方式中，TSO包括具有SEQ ID NO:3-5中的任一条中列出的序列的多核苷酸。在某些实施方式中，逆转录酶为模板转换逆转录酶。在某些实施方式中，外引物包括具有SEQ ID NO:6中的任一条列出的序列的多核苷酸。在某些实施方式中，内引物包括具有SEQ ID NO:11中列出的序列的多核苷酸。在某些实施方式中，与TCR恒定序列退火的引物包括具有SEQ ID NO:7、8、12和13中的任一条中列出的序列的多核苷酸。在某些实施方式中，扩增引物包括条形码序列。
在某些实施方式中，全长TCR受体包括TCRα链和/或TCRβ链。在某些实施方式中，全长TCR受体包括TCRγ链和/或TCRδ链。在某些实施方式中，方法包括约20秒至约90秒的延伸阶段。在某些实施方式中，扩增引物包括浓度为约0.1μM至约0.6μM的正向引物。
在某些实施方式中，方法进一步包括分析单个T细胞的全转录组。在某些实施方式中，方法进一步包括分析单个T细胞的体细胞突变或遗传多态性。
在某些实施方式中，分拣包括使样品接触多个肽/MHC复合物，其中每个肽/MHC复合物包括相关的条形码。在某些实施方式中，方法进一步包括对与每个肽/MHC复合物相关的条形码测序。在某些实施方式中，方法进一步包括确定与第一肽/MHC复合物相关的第一条形码和与第二肽/MHC复合物相关的第二条形码的比例。在某些实施方式中，方法进一步包括基于第一条形码和第二条形码的比例确定T细胞的抗原特异性。
附图说明
图1A和图1B阐释了示例性SMART-TCR方法以生成全长TCR转录物的序列。图1A示出了由TCR mRNA模板产生包括5’和3’扩增序列的cDNA的过程的一般性概述。图1B示出了用于由图1A中产生的cDNA扩增全长TCR序列的过程的详细描述。
图2阐释了用SMART-TCR方法和常规方法获得的TCR回收率、信噪比和平均NeoID读数。NeoID：标记独特的pHLA(肽-HLA)四聚物的独特的寡核苷酸序列。信噪比：通过将独特的pHLA四聚物的读数除以不同的pHLA四聚物鉴定的读数计算的TCR对于pHLA的特异性的评估。临床imPACT方法：本领域中常用的TCR的巢式多路引物反应的对照组。
图3阐释了在不同的实验条件下用SMART-TCR方法获得的TCR回收率、信噪比和平均NeoID读数。临床TCR方法：本领域中常用的TCR的巢式多路引物反应的对照组。SMART-TCR清洁RT：在TCR扩增之前对RT产物进行的珠纯化(图1B中示出)。SMART-TCR酶Spikein：将新的聚合酶添加至RT反应混合物中以促进TCR模板形成。SMART-TCR 1.5XNeoID：添加增加量的NeoID引物，以增加信噪比和NeoID读数。SMART-TCR低延伸：减少用于TCR扩增的延伸时间以促进更小的产物形成(比如TCR或NeoID产物)。
图4A-图4B阐释了减少延伸和增加引物的浓度对TCR回收率、信噪比和平均NeoID读数的效果。图4A示出了TCR回收率。图4B示出了信噪比和平均NeoID读数。
图5A-图5B阐释了在两个不同的样品(LP356和LP169)中减少延伸和增加NeoID引物的浓度对TCR回收率、信噪比和平均NeoID读数的效果。图5A示出了TCR回收率。图5B示出了信噪比和平均NeoID读数。NeoID：标记独特的pHLA(肽-HLA)四聚物的独特的寡核苷酸序列。信噪比：通过将独特的pHLA四聚物的读数除以不同的pHLA四聚物鉴定的读数计算的TCR对于pHLA的特异性的评估。临床imPACT方法：本领域中常用的TCR的巢式多路引物反应的对照组。SMART-TCR 1.5xNeoID 3分钟延伸，SMART-TCR过程的变化，其中NeoID引物随着反应的延伸时间减少至3分钟而增加。SMART-TCR 2xNeoID 1.5分钟延伸：SMART-TCR过程的变化，其中NeoID引物随着反应的延伸时间减少至1.5分钟而增加。SMART-TCR 2xNeoID 1.5分钟延伸低5’引物：SMART-TCR过程的变化，其中NeoID引物随着减少5’引物(图1B中示出)和反应的延伸时间减少至1.5分钟而增加。
图6阐释了SMART-TCR方法产生与临床imPACT方法相当的HLA匹配的comPACT分布。
具体实施方式
本公开提供了用于制备包括全长T细胞受体(TCR)的互补脱氧核糖核酸(cDNA)分子的方法和组合物。本公开部分基于发现了用于对TCR基因测序并且所以使用多重扩增和深度测序分析T细胞的试剂和方法。最后，本公开也提供了使用在本文中公开的方法和组合物用于产生过继性细胞疗法(例如，T细胞产物)的方法。通过本描述和实施例描述本公开的非限制性实施方式。为了公开的清楚的目的并且不是限制性的，将详细描述划分成下述章节：
1、定义；
2、制备DNA的方法；
3、分析T细胞的方法；
4、组合物和试剂盒；
5、T细胞产物；和
6、示例性实施方式。
1、定义
除非另外定义，否则在本文中使用的所有技术术语和科技术语具有本领域技术人员通常理解的含义。下述参考文件为本领域技术人员提供了本公开主题中使用的许多术语的一般定义：Concise Medical Dictionary，Law和Martin编，牛津大学出版社，2020；ADictionary of Biology，Hine编，牛津大学出版社，2019；A Dictionary of Chemistry，Law和Rennie编，牛津大学出版社，2020；Oxford Dictionary of Biochemistry andMolecular Biology，Cammack、Atwood、Campbell、Parish、Smith、Vella和Stirling编，牛津大学出版社，2006；Paul，William.2013.Fundamental Immunology.Philadelphia，PA：Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams&Wilkins；和Wong，Lee-Jun C.2013.NextGeneration Sequencing：Translation to Clinical Diagnostics.New York，NY：SpringerLink。如在本文中使用的，除非指出以其他方式，否则下述术语具有下面提供给它们的含义。
应理解，在本文中描述的本发明的方面和实施方式包括“包括方面和实施方式”、“由方面和实施方式组成”和“基本上由方面和实施方式组成”。术语“包括(comprises)”和“包括(comprising)”旨在具有美国专利法中赋予它们的宽的含义，并且可意指“包含(includes)”、“包含(including)”等。
如在本文中使用的，在权利要求和/或说明书中当结合术语“包括”使用的词语“一个(a)”或“一个(an)”的使用可意指“一个”，但是其也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或大于一个”的含义一致。
除非从上下文中具体地叙述或以其他方式显而易见，如在本文中使用的，术语“约”或“近似”理解为在本领域的正常公差范围以内，例如在平均值的2个标准偏差内。“约”可理解为在叙述值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％以内。可选地，术语可意指在值的一个数量级以内，优选地在值的5倍以内，并且更优选地在值的2倍以内。
如在本文中使用的，术语“多核苷酸”和“核酸”互换使用并且包括：包括核苷酸的聚合物的任何化合物和/或物质。每个核苷酸由碱基，具体地碱基嘌呤或嘧啶碱基(即胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘌呤(T)或尿嘧啶(U))、糖(即脱氧核糖或核糖)和磷酸基团组成。通常，通过碱基的序列来描述核酸分子，由此所述碱基表示核酸分子的一级结构(链状结构)。碱基的序列通常从5’至3’来表示。多核苷酸指任何DNA(包括但不限于cDNA、ssDNA和dsDNA)和任何RNA(包括但不限于ssRNA、dsRNA和mRNA)并且进一步包括DNA和RNA的合成形式以及包括这些分子中的两种或更多种的混合聚合物。多核苷酸可为链状的或环形的。另外，术语多核苷酸包括有义链和反义链二者，以及单链形式和双链形式。多核苷酸可含有天然存在的核苷酸或非天然存在的核苷酸。非天然存在的核苷酸的示例包括具有衍生化糖或磷酸骨架键或化学修饰残基的修饰的核苷酸碱基。多核苷酸囊括适合作为用于体外和/或体内直接表达本发明的多肽的载体的DNA分子和RNA分子。
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中互换使用，指通过至少两个氨基酸的连接而形成的分子。一个氨基酸残基和下一个氨基酸残基之间的连接为酰胺键并且有时称为肽键。可通过本领域已知的适当的方法获得多肽，包括从天然来源中分离、在重组表达系统中表达、化学合成或酶合成。术语可应用于其中一个或多个氨基酸残基为对应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及可应用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
术语“百分数序列同一性”在两条或更多条核酸序列或多肽序列的上下文中，指当对于最大对应而比较和比对(如使用下面描述的一种序列比较算法(例如，BLASTP和BLASTN或本领域技术人员可用的其他算法)或通过视觉检查测量的)时，具有指定的百分数的相同核苷酸或氨基酸残基的两条或更多条序列或子序列。取决于应用，“百分数序列同一性”可存在于被比较的序列的区上，例如，功能结构域上，或，可选地，存在于待比较的两条序列的全长上。对于序列比较，通常一条序列充当与其比较的测试序列的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机中，如果必要的话，标注子序列坐标，并且标注序列算法程序参数。然后，基于标注的程序参数，序列比较算法计算测试序列相对于参考序列的百分数序列同一性。可，例如，通过Smith&Waterman，Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法、通过Needleman&Wunsch，J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法、通过Pearson&Lipman，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的用于相似性方法的检索、通过这些算法的计算机化实施(Wisconsin Genetics软件包，Genetics ComputerGroup，575ScienceDr.，Madison，Wis.的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或通过视觉检查(一般见，Ausubel等，下文)，进行用于比较的序列的最佳比对。适合确定百分数序列同一性和序列相似性的算法的一个示例是BLAST算法，其描述在Altschul等，J.Mol.Biol.215:403-410(1990)中。通过国家生物技术信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov/)，公众可获取用于进行BLAST分析的软件。
如在本文中使用的，术语“引物”一般指天然的或合成的寡核苷酸分子，当与多核苷酸模板形成双链体时，其能够充当核酸合成的启动的点并且沿着模板从其3’端延伸，以便形成延伸的双链体。可通过模板多核苷酸的序列来确定在延伸过程期间添加的核苷酸的序列。通过聚合酶将引物延伸。引物的长度一般与它们在合成引物延伸产物的用于相容并且长度通常在约8个至约100个核苷酸的范围内。“引物”与模板互补，并且通过氢键合或杂交与模板复合而产生用于通过聚合酶启动合成的引物/模板复合物，通过在核酸合成的过程中，添加连接在其与模板互补的3’端的共价键合的碱基而延伸。
如在本文中使用的，术语“扩增(amplifying)”或“扩增(amplification)”一般指合成与模板核酸的一条链或两条链互补的核酸分子的过程。扩增核酸分子可包括使模板核酸变性，在低于引物的解链温度的温度下使引物与模板核酸退火，并且从引物进行酶延伸以生成扩增产物。在某些实施方式中，变性、退火和延伸步骤进行多个次，使得增加扩增产物的量。扩增通常要求存在脱氧核苷三磷酸、聚合酶和用于聚合酶的最佳活性的适当的缓冲液和/或辅助因子。术语“扩增产物”指由如在本文中定义的扩增过程产生的核酸。
如在本文中使用的，术语“测序”一般指用于确定一个或多个多核苷酸中核苷酸碱基的序列的方法和技术。多核苷酸可为，例如，核酸分子比如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，包括其变体或衍生物(例如，单链DNA)。可通过目前可用的各种系统进行测序，例如，但不限于，
如在本文中使用的，术语“下一代测序”或“高通量测序”一般指并行合成测序平台或连接测序平台。下一代测序方法的非限制性示例包括纳米孔测序方法、基于电子检测的方法或基于单分子荧光的方法。
如在本文中使用的，“聚合酶”指使用DNA或RNA作为模板，通过将核苷酸单位添加至核苷酸链，催化多核苷酸合成的酶。术语指如自然中出现的完全酶，或分离的活性催化结构域或片段。在某些实施方式中，聚合酶可为热稳定的。“热稳定的聚合酶”为当与，例如，来自大肠埃希杆菌的核苷酸聚合酶比较时，对热相对稳定，并且催化核苷三磷酸的模板依赖性聚合的酶。当遭受在PCR中使用的重复加热和冷却循环时，“热稳定的聚合酶”保留用于聚合的酶活性和核酸外切酶活性。在某些实施方式中，聚合酶可为“DNA聚合酶”。在某些实施方式中，DNA聚合酶为“高保真度DNA聚合酶”。例如，而没有任何限制，聚合酶可为PRIMESTAR GXL聚合酶I、ADVANTAGE HD聚合酶、
如在本文中使用的，术语“逆转录酶”指催化由RNA模板形成DNA的酶。在某些实施方式中，逆转录酶为可用于从RNA模板第一链cDNA合成的DNA聚合酶。RNA模板可为信使RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)、核糖体RNA(rRNA)、病毒RNA、总RNA等，而没有任何限制。在某些实施方式中，例如，并且没有任何限制，逆转录酶指模板转换逆转录酶，比如鼠白血病病毒逆转录酶。
可使用同义术语“接头(adapter)”、“接头(adaptor)”和“标签”。接头或标签可联接至待通过任何方法，包括连接、杂交或其他方法“贴标签”的多核苷酸序列。
如在本文中使用的，术语“条形码”、“条形码序列”、“NeoID”或“分子条形码”一般指传输或能够传输有关分子，例如，核酸分子或蛋白质分子的信息的标记或标识符。在某些实施方式中，条形码可为分子的一部分，例如，包含在更大的核酸序列中的独特的核苷酸配置或序列。在某些实施方式中，条形码可为附接至分子(比如，更大的蛋白质)的标签。在某些实施方式中，条形码可为独特的。在某些非限制性实施方式中，条形码可包括多核苷酸条形码；随机核酸和/或氨基酸序列；和合成核酸和/或氨基酸序列。在某些非限制性实施方式中，条形码可在样品的测序之前、期间和/或之后，添加至脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)样品的片段。条形码可允许鉴定和/或量化单个测序读数，条形码如果附接至对应的分子，则表示通过条形码的序列来鉴定该分子。
如在本文中使用的，术语“独特的分子标识符”指在测序期间提供错误校正和增加准确度的分子条形码的类型。使用UMI减少了假阳性变体检出的比率并且增加变体检测的灵敏度。UMI的计算机分析可提供具有高水平的准确度和报道独特的读数，去除潜在错误的计算机分析。有关UMI的进一步细节可见Islam等，Nature methods 11.2(2014)：163中，通过引用以其整体并入本文。
如在本文中使用的，术语“模板转换寡核苷酸(template-switchingoligonucleotide)”或“TSO”(也称为“模板转换寡核苷酸(template switcholigonucleotide)”)指在核酸聚合反应期间，聚合酶从初始模板(例如，如在本文中描述的模板mRNA)转换的寡核苷酸模板。TSO可包括修饰的或以其他方式非天然存在的一个或多个核苷酸(或其类似物)。例如，而没有任何限制，模板转换寡核苷酸可包括一个或多个核苷酸类似物(例如，LNA、FANA、2’-O-甲基核糖核苷酸、2’-氟核糖核苷酸等)、连接修饰(例如，硫代磷酸酯、3’-3’和5’-5’颠倒键)、5’端和/或3’端修饰(例如，5’和/或3’氨基、生物素、DIG、磷酸盐、硫醇、染料、淬灭剂等)、一个或多个荧光标记核苷酸，或为模板转换寡核苷酸提供期望的功能的任何其他特征。
如在本文中使用的，术语“T细胞受体”或“TCR”指在CD4+和CD8+T淋巴细胞的膜表面上表达的多肽。TCR为用作免疫系统的组分的抗原受体，用于识别结合至抗原呈递细胞的表面上的自体主要组织相容性复合物(MHC)分子的肽。TCR可为两个二硫化物连接的跨膜多肽链，α和β或γ和δ的异源二聚体。这四个TCR多肽链中的每一个由含有多个不连续基因区段的不同基因座编码。这些包括可变(V)区基因区段，接合(J)区基因区段和恒定(C)区基因区段。β和δ链含有称为多样性(D)基因区段的另外的元件。可变区有助于确定TCR已经特异性结合的具体的抗原和MHC分子。如在本文中使用的，术语TCR包括四条多肽链中的单独每一条，以及其生物活性片段，包括一条链或接合的两条链的可溶于水溶液中的片段。生物活性片段可保持与具体的抗原特异性结合的能力。
如在本文中使用的，“NeoTCR”指，例如，通过基因编辑方法引入T细胞中的外源T细胞受体(TCR)。
如在本文中使用的，“T细胞产物”指包括一个或多个包括外源TCR的T细胞的组合物。在某些实施方式中，T细胞产物包括自体精密基因组工程化的CD8
如在本文中使用的，术语“内源”指在细胞或组织中正常表达的核酸分子或多肽。
如在本文中使用的，术语“外源”指不是细胞中内源存在的核酸分子或多肽。因此，术语“外源”将囊括细胞中表达的任何重组核酸分子或多肽，比如外源、异源和过表达的核酸分子和多肽。“外源”核酸意指不是天然野生型细胞中存在的核酸；例如，外源核酸与内源对应核酸的不同可在于序列、位置/定位或二者。为了清楚起见，外源核酸相对于其天然内源对应核酸可具有相同或不同的序列；其可通过基因工程引入细胞本身中或其祖细胞中，并且可任选地连接至可选的对照序列，比如非自然启动子或分泌序列。
如在本文中使用的，术语“抗原肽”指结合至或能够结合至MHC1类或MHC2类的结合沟中的肽(例如，9-mer、10-mer等)。
如在本文中使用的，术语“肽/MHC复合物”指包括MHC蛋白和抗原肽的功能分子。在某些实施方式中，MHC蛋白可为MHCI类蛋白。在某些实施方式中，肽/MHC复合物包括MHC蛋白、β-2微球蛋白和抗原肽。在某些实施方式中，MHC蛋白可为MHCII类蛋白。
2、制备cDNA的方法
本公开提供了用于改善包括全长TCR序列的cDNA的制备的组合物和方法以及它们在确定那些TCR的全长核酸序列中的用途。
图1A和图1B阐释了本公开主题的某些实施方式。例如，在某些实施方式中，图1A中标出的mRNA转录物最初是从样品(例如包含TCR表达细胞的单个T细胞)中提取的。这种mRNA转录物群体将包括全长TCR序列。在某些实施方式中，mRNA转录物与cDNA合成引物和逆转录酶组合，以产生如步骤2中阐释的cDNA-RNA中间体。尽管cDNA合成引物可包括在下游(即，相对于TCR的编码序列朝向mRNA转录物的3’端)存在的任何序列，但是在某些实施方式中，cDNA合成引物为寡聚dT寡核苷酸。在某些实施方式中，寡聚dT寡核苷酸包括具有SEQ IDNO:1或2中列出的序列的多核苷酸。下面提供了SEQ ID NO:1和2：
在某些实施方式中，通过将cDNA-RNA中间体与TSO组合来进行第二逆转录酶反应，以产生包括全长TCR序列的cDNA。在某些实施方式中，并且如图1A的步骤3中阐释的，TSO可以与通过逆转录酶掺入到cDNA分子3’端的非模板化胞嘧啶核苷酸延伸杂交。TSO与cDNA的这种杂交提供了用于通过逆转录酶进一步延伸的模板，从而将TSO的互补序列掺入进一步延伸的cDNA分子中，如图1A的步骤4中阐释的。
在某些实施方式中，cDNA合成引物和/或TSO可包括扩增引物位点。在某些实施方式中，cDNA合成引物和/或TSO可包括识别标签，例如，条形码。在某些实施方式中，cDNA合成引物和/或TSO可包括独特分子标识符(UMI)。在某些实施方式中，TSO包括具有SEQ ID NO:3-5中的任一条中列出的序列的多核苷酸。下面提供SEQ ID NO:3-5。
在某些实施方式中，逆转录酶具有模板转换活性。在某些实施方式中，逆转录酶可在其达到模板(例如，RNA)的5’端之后添加几个非模板化的核苷酸。在某些实施方式中，逆转录酶为野生型莫洛尼鼠白血病病毒或其变体。例如，而没有任何限制，逆转录酶可为SUPERSCRIPT
如图1B中示出的，在逆转录之后，cDNA可与第一组引物和DNA聚合酶组合，以获得用于测序的全长TCR。
在某些实施方式中，图1B中概述的cDNA的扩增可包括多轮PCR。在某些实施方式中，可采用不同组的扩增引物。在某些实施方式中，不同组的扩增引物可与不同部分的cDNA分子或由其衍生和/或包括不同的序列，例如，UMI或其他类型的条形码和/或扩增序列的扩增产物杂交。
例如，而没有任何限制，本公开的某些实施方式将包括产生包括全长TCR序列的第一PCR产物的第一PCR反应(PCR1)。第一组引物可包括与TSO的外扩增引物位点退火的正向引物，例如，外引物，和与TCR恒定序列退火的反向引物。在某些实施方式中，外引物与TSO的外扩增结合位点退火。在某些实施方式中，外引物与TSO退火。在某些实施方式中，外引物与在TCR可变区的上游的区域退火。例如，而没有任何限制，外引物与图1B中设计为“L”的TCR前导序列退火。在某些实施方式中，外引物包括具有SEQ ID NO:6中的任一条中列出的序列的多核苷酸或由具有SEQ ID NO:6中的任一条中列出的序列的多核苷酸组成。
在某些实施方式中，反向引物与TRAC序列或TRBC序列退火。在某些实施方式中，反向引物与TCRα序列的保守序列退火。在某些实施方式中，反向引物与TCRβ序列的保守序列退火。在某些实施方式中，反向引物与TCRα序列和TCRβ序列的保守序列退火。例如，而没有任何限制，反向引物与TRBC1基因和TRBC2基因二者退火。在某些实施方式中，反向引物与在TRAC序列的下游的区域退火。在某些实施方式中，反向引物与在TRBC序列的下游的区域退火。在某些实施方式中，反向引物与在TCRα序列的V-J-C接合区的下游的区域退火。例如，而没有任何限制，反向引物与在TCRα序列的V-J-C接合区下游约200bp的区域退火。在某些实施方式中，反向引物与在TCRβ序列的V-D-J-C接合区下游的区域退火。例如，而没有任何限制，反向引物与在TCRβ序列的V-D-J-C接合区下游的约200bp的区域退火。在某些实施方式中，反向引物包括具有SEQ ID NO:7或8中的任一个中列出的序列的多核苷酸或由具有SEQID NO:7或8中的任一个中列出的序列的多核苷酸组成。下面提供SEQ ID NO:6-8：
在某些实施方式中，第一PCR反应(PCR1)进一步产生包括NeoID序列的第一PCR产物。第一组引物可包括与在NeoID序列侧翼的区域退火的正向引物和反向引物。在某些实施方式中，引物包括具有SEQ ID NO:9和10中列出的序列的多核苷酸或由具有SEQ ID NO:9和10中列出的序列的多核苷酸组成。下面提供SEQ ID NO:9和10：
在某些实施方式中，一旦获得第一PCR产物，可进行第二PCR反应和第三PCR反应(分别PCR2和PCR3)。在某些实施方式中，第二PCR包括扩增TCRα序列、TCRβ序列和/或NeoID序列。在某些实施方式中，第二PCR包括将第一PCR产物与第二组引物组合，以产生第二PCR产物。第二组引物包括与TSO的内扩增引物位点退火的正向引物，例如，内引物，和与TCR恒定序列退火的反向引物。在某些实施方式中，内引物与TSO接头序列退火。在某些实施方式中，内引物与TSO退火。在某些实施方式中，内引物与在TSO下游和在TCR可变区上游的区域退火。例如，而没有任何限制，内引物与TCR前导序列退火。在某些实施方式中，内引物包括接头序列。在某些非限制性实施方式中，接头序列为与TCR模板非同源的多核苷酸。在某些实施方式中，接头序列可为用于进一步扩增，例如，PCR3的结合位点。在某些实施方式中，内引物包括具有SEQ ID NO:11中列出的序列的多核苷酸或由具有SEQ ID NO:11中列出的序列的多核苷酸组成。在某些实施方式中，反向引物与TRAC序列或TRBC序列退火。在某些实施方式中，反向引物与TCRα序列的保守序列退火。在某些实施方式中，反向引物与TCRβ序列的保守序列退火。在某些实施方式中，反向引物与TCRα序列和TCRβ序列的保守序列退火。在某些实施方式中，反向引物与在TRAC序列的下游的区域退火。在某些实施方式中，反向引物与在TRBC序列的下游的区域退火。在某些实施方式中，反向引物与在TCRα序列的V-J-C接合区的下游的区域退火。在某些实施方式中，反向引物与在TCRβ序列的V-D-J-C接合区的下游的区域退火。在某些实施方式中，反向引物与在PCR1中使用的反向引物的结合区的上游的区域退火。在某些实施方式中，反向引物包括接头序列。在某些非限制性实施方式中，接头序列为与TCR模板非同源的多核苷酸。在某些实施方式中，接头序列可为用于进一步扩增，例如，PCR3的结合位点。在某些实施方式中，反向引物包括具有SEQ ID NO:7-8中的任何一个中列出的序列的多核苷酸或由具有SEQ ID NO:7-8中的任何一个中列出的序列的多核苷酸组成。在某些实施方式中，反向引物包括具有SEQ ID NO:12-13中列出的序列的多核苷酸或由具有SEQ ID NO:12-13中列出的序列的多核苷酸组成。下面提供SEQ ID NO:11-13：
在某些实施方式中，第二PCR反应(PCR2)进一步产生包括NeoID序列的第二PCR产物。第二组引物可包括嵌套在NeoID模板上的正向引物和反向引物。在某些实施方式中，引物包括接头序列。在某些实施方式中，接头序列可为用于进一步扩增，例如，PCR3的结合位点。在某些实施方式中，引物包括具有SEQ ID NO:14和15中列出的序列的多核苷酸或由具有SEQ ID NO:14和15中列出的序列的多核苷酸组成。下面提供SEQ ID NO:14和15：
在某些实施方式中，第三PCR反应(PCR3)包括扩增TCRα序列、TCRβ序列和/或NeoID序列。在某些实施方式中，第三PCR包括将第二PCR产物与第三组引物组合，以产生第三PCR产物。第三组引物包括正向引物。在某些实施方式中，正向引物与TSO接头序列退火。在某些实施方式中，正向引物与TSO退火。在某些实施方式中，正向引物与在TSO的下游的区域退火。例如，而没有任何限制，正向引物与TCR前导序列退火。在某些实施方式中，正向引物与内引物的接头序列退火。例如，而没有任何限制，正向引物与第二TCR反应中使用的内引物的接头序列退火。在某些实施方式中，正向引物包括在5’的接头序列。在某些实施方式中，在5’的接头序列与DNA测序系统相容。与DNA测序系统相容的非限制性示例接头序列包括P7接头。在某些实施方式中，正向引物包括条形码。条形码的非限制性示例包括i7条形码。在某些实施方式中，在NeoID序列的第二PCR扩增期间添加与接头退火的正向引物。有关用于扩增NeoID序列的正向引物的另外的信息可见实施例章节。在某些实施方式中，正向引物包括具有SEQ ID NO:18和19中列出的序列的多核苷酸或由具有SEQ ID NO:18和19中列出的序列的多核苷酸组成。第三组引物也包括反向引物。在某些实施方式中，反向引物与TRAC序列或TRBC序列退火。在某些实施方式中，反向引物与TCRα序列的保守序列退火。在某些实施方式中，反向引物与TCRβ序列的保守序列退火。在某些实施方式中，反向引物与TCRα序列和TCRβ序列的保守序列退火。在某些实施方式中，反向引物与在TRAC序列的下游的区域退火。在某些实施方式中，反向引物与在TRBC序列的下游的区域退火。在某些实施方式中，反向引物与在TCRα序列的V-J-C接合区的下游的区域退火。在某些实施方式中，反向引物与在TCRβ序列的V-D-J-C接合区的下游的区域退火。在某些实施方式中，反向引物与在PCR1中使用的反向引物的结合区的上游的区域退火。在某些实施方式中，反向引物与在PCR2中使用的反向引物的结合区的上游的区域退火。在某些实施方式中，反向引物包括在5’的接头序列。在某些实施方式中，在5’的接头序列与DNA测序系统相容。与DNA测序系统相容的接头序列的非限制性示例包括P5接头。在某些实施方式中，正向引物包括条形码。条形码的非限制性示例包括i5条形码。在某些实施方式中，在NeoID序列的第二PCR扩增期间添加与接头退火的反向引物。有关用于扩增NeoID序列的反向引物的另外的信息可见实施例章节。在某些实施方式中，反向引物包括具有SEQ ID NO:16、17和20中列出的序列的多核苷酸或由具有SEQID NO:16、17和20中列出的序列的多核苷酸组成。
在某些实施方式中，可分别使用第三PCR产物和第四PCR产物进行第四PCR反应和第五PCR反应(分别PCR4和PCR5)。可通过将第三PCR产物与第四组引物组合进行第四PCR，以添加接头序列，可从而改善包括高通量测序的测序输出或测序效率(尽管这种接头序列可在任何前述步骤中并入)。在某些实施方式中，可通过将第四PCR产物与第四组引物组合进行第五PCR，以添加接头序列，从而改善包括高通量测序的测序读数(尽管，再一次，可在任何前述步骤添加这种接头)。第四组引物可包括与第二PCR产物和第三PCR产物的5’序列退火的正向引物以及与第二PCR产物和第三PCR产物的TCR恒定序列退火的反向引物。
在某些实施方式中，在本文中描述的一个或多个扩增步骤中的DNA聚合酶为约0.001单位/μl至约10单位/μl的终浓度。在某些实施方式中，DNA聚合酶为约0.001单位/μl至约1单位/μl的终浓度。在某些实施方式中，DNA聚合酶为约0.001单位/μl至约0.1单位/μl的终浓度。在某些实施方式中，DNA聚合酶为约0.01单位/μl至约1单位/μl的终浓度。在某些实施方式中，DNA聚合酶为约0.01单位/μl至约0.1单位/μl的终浓度。在某些实施方式中，DNA聚合酶为约0.02单位/μl至约0.08单位/μl的终浓度。在某些实施方式中，在本文中描述的一个或多个扩增步骤的DNA聚合酶可添加至反应。例如，而没有任何限制，如果酶活性和/或TCR回收似乎为低的，则另外的DNA聚合酶可补充至反应中。
在某些实施方式中，方法包括包含终浓度为约0.02单位/μl的DNA聚合酶的第一PCR反应(PCR1)。在某些实施方式中，方法包括包含终浓度为约0.04单位/μl的DNA聚合酶的第二PCR反应(PCR2)。在某些实施方式中，方法包括包含终浓度为约0.04单位/μl的DNA聚合酶的第三PCR反应(PCR3)。在某些实施方式中，方法包括包含终浓度为约0.04单位/μl的DNA聚合酶的第四PCR反应(PCR4)。在某些实施方式中，方法包括包含终浓度为约0.04单位/μl的DNA聚合酶的第五PCR反应(PCR5)。
在某些实施方式中，第一PCR反应、第二PCR反应、第三PCR反应、第四PCR反应和第五PCR反应包括延伸步骤。在某些实施方式中，第一PCR(PCR1)的延伸步骤具有约90秒至约6分钟的时间。在某些实施方式中，第二PCR(PCR2)的延伸步骤具有约20秒至约1分钟的时间。在某些实施方式中，第三PCR(PCR3)的延伸步骤具有约20秒至约1分钟的时间。在某些实施方式中，第四PCR(PCR4)的延伸步骤具有约20秒至约1分钟的时间。在某些实施方式中，第五PCR(PCR5)的延伸步骤具有约20秒至约1分钟的时间。
在某些实施方式中，在本文中公开的任何反应的引物可具有约0.01μM至约1μM的浓度。在某些实施方式中，方法包括具有浓度为约0.01μM至约1μM的正向引物的第一PCR(PCR1)。在某些实施方式中，方法包括具有浓度为约0.01μM至约1μM的反向引物的第一PCR(PCR1)。在某些实施方式中，方法包括具有浓度为约0.01μM至约1μM的正向引物的第二PCR(PCR2)。在某些实施方式中，方法包括具有浓度为约0.01μM至约1μM的反向引物的第二PCR(PCR2)。在某些实施方式中，方法包括具有浓度为约0.01μM至约1μM的正向引物的第三PCR(PCR3)。在某些实施方式中，方法包括具有浓度为约0.1μM的正向引物的第三PCR(PCR3)。在某些实施方式中，方法包括具有浓度为约0.01μM至约1μM的反向引物的第三PCR(PCR3)。在某些实施方式中，方法包括具有浓度为约0.3μM的正向引物的第三PCR(PCR3)。在某些实施方式中，方法包括具有浓度为约0.01μM至约1μM的正向引物的第四PCR(PCR4)。在某些实施方式中，方法包括具有浓度为约0.01μM至约1μM的反向引物的第四PCR(PCR4)。在某些实施方式中，方法包括具有浓度为约0.01μM至约1μM的正向引物的第五PCR(PCR5)。在某些实施方式中，方法包括具有浓度为约0.1μM的正向引物的第五PCR(PCR5)。在某些实施方式中，方法包括具有浓度为约0.01μM至约1μM的反向引物的第五PCR(PCR5)。在某些实施方式中，方法包括具有浓度为约0.3μM的正向引物的第五PCR(PCR5)。
在某些实施方式中，方法包括第三PCR、第四PCR和第五PCR的产物可通过下一代测序方法进行测序。可在本公开主题内使用的测序平台的非限制性示例包括Roche GS20、Roche GS FLX、Solexa平台、支持寡核苷酸连接和检测(SOLiD)平台、HeliScope平台和Oxford Nanopore Technologies平台。在某些实施方式中，方法包括获得用于TCRα序列和TCRβ序列的读数。
3、分析T细胞的方法
本公开提供了用于分析单个细胞，例如，T细胞的组合物和方法。T细胞和TCR集合的理解可用于改善个性化的和定制的疗法，例如，过继性细胞转移。在某些实施方式中，本公开包括来自样品的分拣的T细胞。在某些实施方式中，样品包括收集自受试者的T细胞。样品可为含有T细胞的体液或组织的任何样品。流体或组织的非限制性示例包括血液、胸腺、脾、淋巴结、骨髓、肿瘤活体组织切片或炎症性损伤活体组织切片。在某些实施方式中，样品可收集自病理学位点。例如，而没有任何限制，样品可收集自肿瘤组织。在某些实施方式中，样品可包括收集自受试者和在体外细胞培养物生长之后的细胞。
在某些实施方式中，从样品分离并且分拣T细胞。在某些实施方式中，T细胞可分拣至容器中分开的位置。例如，而没有任何限制，T细胞可分拣在多孔板(例如，384孔板)或微孔阵列、毛细管或管(例如，0.2mL管)或微流体装置中的腔室中。在某些实施方式中，T细胞可分拣在空间上分开的细胞的乳滴中。例如，而没有任何限制，可使用流式细胞计数器分拣T细胞。在某些实施方式中，可在分拣之前标记T细胞。在某些实施方式中，可用特异性结合T细胞蛋白的抗体(例如，抗CD3抗体)标记T细胞。在某些实施方式中，可用多个试剂标记T细胞，以将T细胞亚型进行分类(例如，CD8 T细胞、CD4 T细胞等)。在某些实施方式中，样品中的子集T细胞可分拣为分开的位置(例如，分开的乳滴)中的单个细胞。例如，可分拣子集CD3
在某些实施方式中，使用肽/MHC复合物分拣T细胞。在某些实施方式中，肽/MHC复合物包括抗原肽、β2-微球蛋白和MHC I类重链。在某些实施方式中，用条形码或NeoID标记肽/MHC复合物。在某些实施方式中，肽/MHC复合物为comPACT多肽，如国际专利公开号WO2019/195310中描述的，其内容通过参考以其整体并入。
在某些实施方式中，将T细胞裂解以释放分子，比如RNA。裂解T细胞的方法的非限制性示例包括渗透休克、热裂解、机械裂解、化学裂解或光学裂解。
在某些实施方式中，本公开包括用于从样品分离核酸分子，例如，RNA分子的方法。在某些非限制性实施方式中，可通过苯酚/氯仿提取、乙醇沉淀、电泳和/或色谱进行核酸分子的分离。
在某些实施方式中，用于分析单个T细胞的本公开的方法包括在本文中在章节2中描述的任何方法。
在某些实施方式中，用于分析单个T细胞的本公开方法包括用于分析T细胞全转录组的方法。如在本文中使用的，“全转录组分析”指评估样品，例如，单个T细胞的所有或部分转录组。在某些实施方式中，全转录组分析包括使用各种PCR或非PCR类方法扩增转录物。例如，可使用结合多种RNA(比如mRNA分子)的一个或多个通用引物，扩增转录物例如，mRNA、微RNA、siRNA、tRNA、rRNA和其任何组合。
在某些实施方式中，本公开提供了用于分析对于抗原肽特异性的单个T细胞的方法。在本文中公开的方法的某些实施方式中，首先使用包括NeoID的肽/MHC复合物分拣T细胞。在某些实施方式中，通过在本文中在章节2中描述的任何方法分析T细胞。在某些实施方式中，用于分析单个T细胞的本公开方法包括对TCRα序列、TCRβ序列和NeoID测序。在某些实施方式中，本公开方法进一步包括去除假阳性T细胞(例如，对于抗原肽不是特异性的T细胞)。例如，而没有任何限制，可通过与分拣的T细胞结合的NeoID的序列分析去除假阳性T细胞。与非特异性结合的NeoID相比，多个拷贝的相同NeoID的存在产生高比例的特异性的NeoID条形码物种。这将产生更高的NeoID信噪比(例如，S/N比)。在某些实施方式中，S/N比高于阈值。在某些实施方式中，阈值为约10。在某些实施方式中，非特异性的T细胞将结合相对等量的不同肽/MHC复合物，导致降低比例的不同的NeoID。在某些实施方式中，非特异性的T细胞将具有低于阈值(例如，低于约10的阈值)的S/N比。
在某些实施方式中，分拣的T细胞可识别两种不同的肽/MHC复合物。在这些情况下，计算的NeoID信噪比可低于阈值(例如，低于约10的阈值)。在某些实施方式中，可计算第一NeoID信噪比(S/N1)和第二NeoID信噪比(S/N2)。
在某些实施方式中，S/N1为最高信号除以第二最高的信号。在某些实施方式中，S/N2为来自一种肽/MHC复合物的最高信号除以来自不同肽/MHC复合物的最高信号。在某些实施方式中，来自不同肽/MHC复合物的最高信号不是样品中的第二最高信号。
4、组合物和试剂盒
本公开也提供了用于进行在本文中公开的方法的组合物。在某些实施方式中，本公开包括酶、引物、缓冲液、盐和其他组分。例如，而没有任何限制，组合物可包括一种或多种对照(例如，阳性对照或阴性对照)、逆转录酶、TSO、dNTP、缓冲液和辅助因子(例如，盐、金属辅助因子等)、一种或多种酶稳定组分(例如，DTT)，和任何其他所需的反应混合物组分。在某些实施方式中，组合物可存在于一个或多个反应管中。
本公开也提供了用于进行在本文中公开的方法的试剂盒。在某些实施方式中，试剂盒可用于制备包括全长TCR序列的cDNA。在某些非限制性实施方式中，在本文中公开的试剂盒可包括cDNA合成引物(例如，寡聚dT)、逆转录酶、dNTP、缓冲液和辅助因子、引物、TSO、一种或多种酶稳定组分(例如，DTT)和/或用于进行测序的任何其他试剂。在某些实施方式中，试剂盒包括用于从核酸来源分离RNA的试剂。
主题试剂盒的组分可存在于分开的容器中，或多个组分可存在于单个容器中。例如，而没有任何限制，cDNA合成引物和逆转录酶缓冲液可提供在分开的容器中或可提供在单个容器中。在某些实施方式中，以冷冻干燥形式提供一种或多种试剂盒组分，使得组分易于使用并且可在室温下常规存储。
除了上面提到的组分，受试者试剂盒可进一步包括用于使用试剂盒的组分，例如，实践主题方法的说明书。用于实践主题方法的说明书一般记录在适当的记录介质上。例如，说明书可印刷在基材，比如纸或塑料等上。例如，而没有任何限制，说明书可作为包装插页存在于试剂盒中，存在于试剂盒或其组分的容器的标签中(即，与包装或子包装相关联)等。在某些实施方式中，说明书可获得自远程来源，例如从网站进行下载。
5、T细胞产物
在某些实施方式中，使用PCT/US2020/17887和PCT/US2019/025415中描述的基因编辑技术和TCR分离技术(以它们的整体并入本文)，通过在本文中公开的方法鉴定的TCR(见上面章节2和3)可通过精密基因组工程化克隆在来自患有癌症的相同受试者的自体CD8
描述这些“幼小”或“更幼小”或较少分化的T细胞表型，以赋予改善的移植潜能和延长的输注后持久性。因此，施用这些T细胞产物，包括“幼小”T细胞，具有通过改善的移植潜能、延长的输注后持久性和快速分化成效应T细胞，使患有癌症的患者受益的潜能，以根除遍及身体的肿瘤细胞。
在某些实施方式中，这些T细胞产物(例如，包括通过在本文中公开的方法鉴定的外源TCR)的制造过程涉及与引导RNA序列结合的CRISPR-Cas9核酸酶的双核糖核蛋白物质的电穿孔，每种物质靶向基因组TCRα基因座和基因组TCRβ基因座。T细胞产物和精密基因组工程化过程的综合评估指示NeoTCR产物在输注回到患者后将是良好耐受的。
在本文中描述的基因组工程化方法确保高效生成定制的表达通过在本文中公开的方法鉴定的TCR的T细胞，用于患有实体瘤和液体瘤的患者的个性化过继性细胞疗法。此外，工程化方法不限于在T细胞中使用并且也已经成功地应用与其他原代细胞类型，包括天然杀伤细胞和造血干细胞。有关用于使用通过在本文中公开的方法鉴定的TCR生成T细胞产物的方法的另外的信息可见国际专利公开号WO 2019/089610。
6、示例实施方式
A1、在某些非限制性实施方式中，本公开提供了制备包括全长T细胞受体(TCR)序列的脱氧核糖核酸(DNA)的方法，方法包括：a)通过将核糖核酸(RNA)分子以及与TCR编码序列的RNA分子的3’区域互补的cDNA合成引物、模板转换寡核苷酸(TSO)和逆转录酶在足够逆转录酶产生cDNA序列的条件下组合，获得TCR互补DNA(cDNA)序列；和b)通过将cDNA与包括与TSO序列退火的外引物和与TCR恒定序列退火的引物的第一组扩增引物和聚合酶在足够聚合酶产生包括全长TCR序列的DNA的条件下组合，制备包括全长TCR序列的DNA。
A2、A1的前述方法，进一步包括对包括全长TCR序列的DNA测序。
A3、A1的前述方法，其中RNA分子提取自包括T细胞的样品。
A4、A3的前述方法，其中样品收集自受试者。
A5、A1-A4中任何一个的前述方法，其中cDNA合成引物为寡聚dT引物。
A6、A5的前述方法，其中寡聚dT引物包括具有SEQ ID NO:1或2中列出的序列的多核苷酸。
A7、A1-A6的前述方法，其中TSO包括扩增引物位点、条形码和独特分子标识符(UMI)。
A8、A1-A7的前述方法，其中TSO包括具有SEQ ID NO:3-5中的任一条中列出的序列的多核苷酸。
A9、A1-A8的前述方法，其中逆转录酶为模板转换逆转录酶。
A10、A1-A9中任何一个的前述方法，其中外引物包括具有SEQ ID NO:6中列出的序列的多核苷酸。
A11、A1-A10中任何一个的前述方法，其中内引物包括具有SEQ ID NO:11中列出的序列的多核苷酸。
A12、A1-A11中任何一个的前述方法，其中与TCR恒定序列退火的引物包括具有SEQID NO:7、8、12和13中列出的序列的多核苷酸。
A13、A1-A12中任何一个的前述方法，其中使用第二组扩增引物进一步扩增包括全长TCR序列的DNA，其中一条或两条引物包括条形码序列。
A14、A1-A13中任何一个的前述方法，其中全长TCR受体包括TCRα链和/或TCRβ链。
A15、A1-A13中任何一个的前述方法，其中全长TCR受体包括TCRγ链和/或TCRδ链。
A16、A1-A15中任何一个的前述方法，其中b)包括约20秒至约90秒的延伸阶段。
A17、A1-A16中任何一个的前述方法，其中扩增引物包括浓度为约0.1μM至约0.6μM的正向引物。
B1、在某些非限制性实施方式中，本公开提供了通过A1-A17中任何一项的前述方法产生的cDNA文库。
C1、在某些非限制性实施方式中，本公开提供了分析单个T细胞以确定全长TCR序列的核酸序列的方法，包括：a)从包括多个T细胞的样品中分拣单个T细胞；b)制备包括全长TCR序列的DNA；和c)对包括全长TCR序列的DNA测序。
C2、C1的前述方法，其中制备包括全长TCR序列的DNA包括：i)通过将核糖核酸(RNA)分子以及与TCR编码序列的RNA分子的3’区域互补的cDNA合成引物、模板转换寡核苷酸(TSO)和逆转录酶在足够逆转录酶产生cDNA序列的条件下组合，获得TCR互补DNA(cDNA)序列；和ii)通过将cDNA与包括与TSO序列退火的外引物和与TCR恒定序列退火的引物的第一组扩增引物和聚合酶在足够聚合酶产生包括全长TCR序列的DNA的条件下组合，制备包括全长TCR序列的DNA。
C3、C1或C2的前述方法，其中样品收集自受试者。
C4、C1-C3中任何一个的前述方法，其中cDNA合成引物为寡聚dT引物。
C5、C4的前述方法，其中寡聚dT引物包括具有SEQ ID NO:1或2中列出的序列的多核苷酸。
C6、C1-C5中任何一个的前述方法，其中TSO包括扩增引物位点、识别标签和独特分子标识符(UMI)。
C7、C1-C6中任何一个的前述方法，其中TSO包括具有SEQ ID NO:3-5中的任一条中列出的序列的多核苷酸。
C8、C1-C7中任何一个的前述方法，其中逆转录酶为模板转换逆转录酶。
C9、C1-C8中任何一个的前述方法，其中外引物包括具有SEQ ID NO:6中的任一条列出的序列的多核苷酸。
C10、C1-C9中任何一个的前述方法，其中内引物包括具有SEQ ID NO:11中列出的序列的多核苷酸。
C11、C1-C10中任何一个的前述方法，其中与TCR恒定序列退火的引物包括具有SEQID NO:7、8、12和13中的任一条中列出的序列的多核苷酸。
C12、C1-C11中任何一个的前述方法，其中扩增引物包括条形码序列。
C13、C1-C12中任何一个的前述方法，其中全长TCR受体包括TCRα链和/或TCRβ链。
C14、C1-C12中任何一个的前述方法，其中全长TCR受体包括TCRγ链和/或TCRδ链。
C15、C1-C14中任何一个的前述方法，其中b)包括约20秒至约90秒的延伸阶段。
C16、C1-C15中任何一个的前述方法，其中扩增引物包括浓度为约0.1μM至约0.6μM的正向引物。
C17、C1-C16中任何一个的前述方法，进一步包括分析单个T细胞的全转录组。
C18、C1-C17中任何一个的前述方法，进一步包括分析单个T细胞的体细胞突变或遗传多态性。
C19、C1-C18中任何一个的前述方法，其中分拣包括使样品接触多个肽/MHC复合物，其中每个肽/MHC复合物包括相关的条形码。
C20、C19的前述方法，进一步包括对与每个肽/MHC复合物相关的条形码测序。
C21、C20的前述方法，进一步包括确定与第一肽/MHC复合物相关的第一条形码和与第二肽/MHC复合物相关的第二条形码的比例。
C22、C21的前述方法，进一步包括基于第一条形码和第二条形码的比例确定T细胞的抗原特异性。
实施例
通过参考下述实施例将更好地理解本公开主题，实施例提供为本公开主题的示例，并且不为限制性的。
实施例1
用于克隆TCR的传统方法基于逆转录PCR和随后扩增TCRα链的VJ区段和TCRβ链的VDJ区段的第一轮和第二轮巢式PCR反应的组合。然后，这些区段进行计算机分析，以允许全长TCR的重构。然而，这些方法的使用受限。如下面的表中指示的，大约12％的TCR克隆示出不确定的结果。该不确定性可与在扩增步骤期间可掩盖某些变异的引物的特征相关。因此，克服该限制是重要的。
材料和方法：
细胞分拣。基于T细胞表型并且与肽/MHC复合物结合分拣细胞。将细胞分拣至含有下面表中描述的裂解缓冲液的96孔板中。有关用于细胞分选的方法的另外的信息可见国际专利申请号PCT/US20/17887，通过参考以其整体并入其内容。
SMART-TCR，步骤1：逆转录(RT)。
在开始RT反应之前，将含有细胞和分拣试剂(如上面“细胞分拣”章节中描述的)的混合物放置在具有加热的盖子的热循环仪中并且如下面表中详述的进行温育:
对于每个RT反应，将下述组分添加至单个PCR反应:
如下面表中详述的，在具有加热盖子的热循环仪中进行温育每个反应：
SMART-TCR，步骤2：PCR扩增1。对于每个反应，使用在TSO-序列上退火的5’扩增引物和在TCR的恒定区上退火的3’扩增引物进行第一PCR扩增。在第一PCR(PCR1)中，如下准备每个反应:
S0009和a0017引物设计为靶向NeoID的侧翼(一个5’和一个3’)序列。a0001和a0003引物设计为结合TCR恒定区(a0001结合TCRα恒定区，并且a0003结合TCRβ恒定区)。sP239设计为结合在RT步骤中引入的TSO序列(sP238)。下面提供引物序列：
sP239：
a0001：
a0003：
S0009：
a0017：
如下面表中详述的，每个反应在具有加热的盖子的热循环仪中进行温育：
SMART-TCR，步骤3：PCR扩增2。进行第二PCR，以通过使用巢式5’扩增序列引物和在TCR的恒定区上退火的3’引物进一步扩增PCR1产物。在第二PCR中，无论靶为TCRα序列或TCRβ序列或NeoID序列，使用不同的条件和引物。对于TCRα扩增如下准备每个反应：
sP259引物设计为与来自PCR1步骤(sP239)的TSO序列退火并且将小的接头序列添加至5’端(由SEQ ID NO:11中的N指示)。接头序列将在第三PCR扩增步骤期间用作用于正向引物的结合位点。TRAC_Primer2结合TCRα恒定区，其相对于PCR1步骤中使用的a0001引物的稍微5’(向内嵌套)。下面提供引物序列：
sP259：ACTCGCGAGGGACGTGAAGCN
TRAC_Primer2：GACAAAACTGTGCTAGACATGAGG[SEQ ID NO:12]
对于TCRβ扩增，如下准备每个反应：
aP0042引物设计为结合TCRβ恒定区，其相对于PCR1步骤中使用的a0003引物的稍微5’(向内嵌套)。下面提供引物序列：
aP0042：CAGGGAAGAAGCCTGTGGCCAGG[SEQ ID NO:13]
对于TCRα和TCRβ扩增，如下面表中详述的，在具有加热的盖子的热循环仪中温育每个反应:
对于NeoID扩增，如下准备每个反应：
S0010设计为与来自第一PCR步骤中的S0009的原始结合位点的NeoID模板上的稍微3’(巢式)区域退火。aP0043设计为结合来自第一PCR步骤中的a0017的原始结合位点的NeoID模板上的稍微5’(巢式)区。S0010和aP0043包括5’端(对于S0010)或3’端(对于aP0043)的小的接头序列，将在第三PCR扩增期间用作引物结合位点。下面提供引物序列：
S0010：
对于NeoID扩增，如下面表中详述的，在具有加热的盖子的热循环仪中温育每个反应:
SMART-TCR，步骤4：PCR扩增3-测序接头添加。将测序接头和索引引物添加至PCR扩增2的扩增产物。对于接头添加至PCR扩增2中获得的PCR产物(PCR2产物)，如下准备反应：
用于TCRα和TCRβ的PCR3条形码引物包括2个种类的引物的混合物。正向引物设计为结合在第二PCR扩增(sP259)期间的添加的接头序列并且设计为添加特异性良好的条形码(i7条形码)以及易于Illumina测序的P7序列。反向引物设计为结合嵌套TCR恒定区(TRAC_Primer2序列或aP0042序列的5’序列)并且设计为添加特异性良好的条形码(i5条形码)以及易于Illumina测序的P5序列。
对于NeoID引物，正向引物设计为结合在第二PCR扩增期间添加的5’接头序列(S0010)并且反向引物结合在第二PCR扩增期间添加的3’接头序列(aP0043)。NeoID正向引物包括特异性良好的条形码(i7条形码)以及易于Illumina测序的P7序列。NeoID反向引物包括特异性良好的条形码(i5条形码)以及易于Illumina测序的P5序列。下面提供在第三轮PCR引物中使用的引物的通式结构：
用于TCRα恒定区的反向引物：
用于TCRβ恒定区的反向引物：
用于TCRα和TCRβ的正向引物：
用于NeoID的正向引物：
用于NeoID的反向引物：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[i5条形码]TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGN
对于TCRα和TCRβ扩增(PCR3)，如下面表中详述的，在具有加热的盖子的热循环仪中温育每个反应:
对于NeoID扩增(PCR3)，如下面表中详述的，在具有加热的盖子的热循环仪中温育每个反应:
SMART-TCR，步骤5：DNA纯化。将来自PCR扩增3的PCR产物合并并且通过琼脂糖电泳分离。TCRα和TCRβ序列示出近似650-750bp的分子量，而NeoID示出200bp的分子量。鉴定的条带切割并且处理用于纯化。将纯化的DNA量化并且浓缩用于进一步的处理。
SMART-TCR，步骤6：测序和数据分析。接着，将纯化和浓缩的DNA进一步处理用于文库制备和使用EQ-005Illumina
结果：
为了确定在本文中公开的SMART-TCR方案的性能特征，进行传统的巢式PCR方法(下称“临床imPACT方法”)和SMART-TCR方案之间的比较。如图2中阐释的，与imPACT方案相比，SMART-TCR方案示出了更高的TCR回收率、更低的S/N比和减少的NeoID读数计数。
为了改善S/N比和NeoID读数计数，根据下面的表修改SMART-TCR方案的几个步骤：
如图3中示出的，与SMART-TCR方案相比，增加NeoID引物的量并且减少延伸时间改善了S/N比和NeoID读数计数，而清洁和增加酶量基本上不增加S/N比或NeoID读数计数。
接下来，确定减少延伸时间和增加NeoID引物的浓度一起是否将产生更好的TCR序列回收。不被任何特别的理论限制，减少延伸时间可去掉要求更长延伸时间的其他竞争转录物。令人吃惊地，如图4A和图4B中所示，在常规的延伸时间和NeoID引物浓度下，与SMART-TCR方案相比，该方法产生更好的TCR回收率(图4A)和显著改善的S/N比和NeoID读数计数(图4B)。
在从人受试者中获得的原代细胞(LP356和LP169)中重复该方法。除了增加NeoID引物的量和减少延伸时间，通过减少步骤2(PCR1)中5’引物的量来修改SMART-TCR方案。如图5A和图5B中示出的，该新的方法显著增加了TCR回收率(图5A)，S/N比和NeoID读数计数(图5B)。
最后，确认了与临床imPACT方法相比，SMART-TCR方案产生相当的HLA匹配的comPACT分布(图6)。总体上，这些数据表明了出乎意料的和更优异的质量的SMART-TCR方案，包括与减少延伸时间、增加NeoID引物浓度和/或减少5’引物浓度相关的变化。如在本文中描述的，该方法可提供高质量和无偏倚的T细胞受体的序列，无论序列是否在数据库中。进一步，该方法允许从相同的样品中鉴定抗原特异性并且可容易适应任何个性化药物管道。
实施例2
可选的引物可用于在本文中和实施例1中公开的方法。在第一选项(选项A)中，用于TSO的DNA序列的一部分(sP238)和寡聚dT相同(例如，SEQ ID NO:1-5)。可选地(选项B)，用于TSO的DNA序列和寡聚dT不同。
在选项B中，不同寡聚dT序列的使用减少了步骤2中的正向引物(sP239)和步骤3中的正向引物(sP259)的脱结合效果。在选项B中，sP238、sP239和sP259与替换下面任何寡聚dT序列同时使用。在这种情形下，使用下述序列：
S-寡聚dT：
W-寡聚dT：
N-寡聚dT：
B-寡聚dT：
K-寡聚dT：
可选的TSO和正向引物序列与上面的任何寡聚dT序列互换使用，只要TSO的主序列、用于步骤2的正向引物和用于步骤3的正向引物某些程度的重叠即可。TSO和正向引物按照对应于上面为寡聚dT序列印刷的字母的字母分组。每个反应中的TSO和正向引物来自相同的字母并且在DNA序列中共有一些程度的重叠：
S3-PCR1-正向引物：
S3-PCR2-正向引物：
W-TSO：
W-PCR1-正向引物：
W-PCR2-正向引物：
N-TSO：
N-PCR1-正向引物：
N-PCR2-正向引物：
B-TSO：
B-PCR1-正向引物：
B-PCR2-正向引物：
K-TSO：
K-PCR1-正向引物：
K-PCR2-正向引物：
***
尽管已经结合几个描述的实施方式在一些程度上和以一些细节描述了本发明，但是不期限其应限于任何这些细节或实施方式或任何特别的实施方式，而是参考所附的权利要求解释，以便从现有技术的角度，提供这种权利要求的最宽的可能的解释，并且因此，有效囊括本发明期望的范围。
在本文中提到的所有的公开、专利申请、专利和其他参考文献通过引用以它们的整体并入。在有冲突的情况，将以本说明书，包括定义为准。另外，章节标题、材料、方法和实施例仅仅为阐释性的并且不旨在是限制性的。
序列表
<110>PACT制药公司
<120>用于改善T细胞受体测序的方法
<130>087520.0254 PCT
<150>US 63/212,286
<151>2021-06-17
<160>40
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>57
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的
<220>
<221>misc_feature
<222>(57)..(57)
<223>n为a、c、g或t
<400>1
aagcagtggt atcaacgcag agtacttttt tttttttttt tttttttttt tttttvn 57
<210>2
<211>65
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的
<220>
<221>misc_feature
<222>(26)..(33)
<223>n为a、c、g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(65)..(65)
<223>n为a、c、g或t
<400>2
aagcagtggt atcaacgcag agtacnnnnn nnnttttttt tttttttttt tttttttttt60
tttvn65
<210>3
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的
<220>
<221>rRNA
<222>(28)..(29)
<223>rG
<220>
<221>misc_feature
<222>(30)..(30)
<223>锁核酸(LNA)鸟苷酸
<400>3
aagcagtggt atcaacgcag agtacatggg 30
<210>4
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(1)..(1)
<223>5Bios
<220>
<221>rRNA
<222>(28)..(29)
<223>rG
<220>
<221>misc_feature
<222>(30)..(30)
<223>锁核酸(LNA)鸟苷酸
<400>4
ragcagtggt atcaacgcag agtacatggg 30
<210>5
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的
<220>
<221>misc_feature
<222>(36)..(43)
<223>n为a、c、g或t
<220>
<221>rRNA
<222>(44)..(45)
<223>rG
<220>
<221>misc_feature
<222>(46)..(46)
<223>锁核酸(LNA)鸟苷酸
<400>5
agagacagaa gcagtggtat caacgcagag tacatnnnnn nnnggg 46
<210>6
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的: sP239
<400>6
aagcagtggt atcaacgcag agt23
<210>7
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的: a0001
<400>7
gccacagcac tgttgctctt gaagtcc27
<210>8
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的: a0003
<400>8
ccaccagctc agctccacgt g21
<210>9
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的: S0009
<400>9
ctcgccacgt cggctatcct g21
<210>10
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的: a0017
<400>10
gaggtcgctg tagcttgctc acg23
<210>11
<211>73
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的: sP259
<220>
<221>misc_feature
<222>(21)..(50)
<223>n存在至少4次并且可重复达30次
<220>
<221>misc_feature
<222>(21)..(50)
<223>如果存在，n为a、c、g或t
<400>11
actcgcgagg gacgtgaagc nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn aagcagtggt60
atcaacgcag agt 73
<210>12
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的: TRAC_Primer2
<400>12
gacaaaactg tgctagacat gagg 24
<210>13
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的: aP0042
<400>13
cagggaagaa gcctgtggcc agg23
<210>14
<211>99
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的: S0010
<220>
<221>misc_feature
<222>(23)..(52)
<223>n存在至少4次并且可重复达30次
<220>
<221>misc_feature
<222>(23)..(52)
<223>如果存在，n为a、c、g或t
<400>14
ccagggtttt cccagtcacg acnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nncacgtcgg60
ctatcctgat cggatgaagc agtggtatca acgcagagt 99
<210>15
<211>77
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的: aP0043
<220>
<221>misc_feature
<222>(25)..(54)
<223>n存在至少4次并且可重复达30次
<220>
<221>misc_feature
<222>(25)..(54)
<223>如果存在，n为a、c、g或t
<400>15
agcggataac aatttcacac aggannnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnncgctgt60
agcttgctca cgtccag 77
<210>16
<211>112
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的: 用于TCR α恒定区的反向引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(29)..(30)
<223>i5条形码的定位
<220>
<221>misc_feature
<222>(63)..(92)
<223>n存在至少4次并且可重复达30次
<220>
<221>misc_feature
<222>(63)..(92)
<223>如果存在，n为a、c、g或t
<400>16
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact cgtcggcagc gtcagatgtg tataagagac60
agnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnacggcagg gtcagggttc tg 112
<210>17
<211>112
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的: 用于TCR β恒定区的反向引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(29)..(30)
<223>i5条形码的定位
<220>
<221>misc_feature
<222>(63)..(92)
<223>n存在至少4次并且可重复达30次
<220>
<221>misc_feature
<222>(63)..(92)
<223>如果存在，n为a、c、g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(93)..(93)
<223>n为a、c、g或t
<400>17
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact cgtcggcagc gtcagatgtg tataagagac60
agnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnagcgacc tcgggtggga ac 112
<210>18
<211>108
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的: TCRα和TCRβ的正向引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(24)..(25)
<223>i7条形码的定位
<220>
<221>misc_feature
<222>(59)..(88)
<223>n存在至少4次并且可重复达30次
<220>
<221>misc_feature
<222>(59)..(88)
<223>如果存在，n为a、c、g或t
<400>18
caagcagaag acggcatacg agatgtctcg tgggctcgga gatgtgtata agagacagnn60
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnac tcgcgaggga cgtgaagc108
<210>19
<211>110
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的: 用于NeoID的正向引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(24)..(25)
<223>i7条形码的定位
<220>
<221>misc_feature
<222>(59)..(88)
<223>n存在至少4次并且可重复达30次
<220>
<221>misc_feature
<222>(59)..(88)
<223>如果存在，n为a、c、g或t
<400>19
caagcagaag acggcatacg agatgtctcg tgggctcgga gatgtgtata agagacagnn60
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnncc agggttttcc cagtcacgac110
<210>20
<211>116
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的: 用于NeoID的反向引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(29)..(30)
<223>i5条形码的定位
<220>
<221>misc_feature
<222>(63)..(92)
<223>n存在至少4次并且可重复达30次
<220>
<221>misc_feature
<222>(63)..(92)
<223>如果存在，n为a、c、g或t
<400>20
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact cgtcggcagc gtcagatgtg tataagagac60
agnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnagcggata acaatttcac acagga 116
<210>21
<211>53
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的: S-寡聚dT
<220>
<221>misc_feature
<222>(53)..(53)
<223>n为a、c、g或t
<400>21
acgagcatca gcagcatacg attttttttt tttttttttt tttttttttt tvn 53
<210>22
<211>67
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的: W-寡聚dT
<220>
<221>misc_feature
<222>(28)..(35)
<223>n为a、c、g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(67)..(67)
<223>n为a、c、g或t
<400>22
attctagagg ccgaggcggc cgacatgnnn nnnnnttttt tttttttttt tttttttttt60
tttttvn67
<210>23
<211>58
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的: N-寡聚dT
<220>
<221>misc_feature
<222>(19)..(26)
<223>n为a、c、g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(58)..(58)
<223>n为a、c、g或t
<400>23
actatctaga gcggccgcnn nnnnnntttt tttttttttt tttttttttt ttttttvn58
<210>24
<211>73
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的: B-寡聚dT
<220>
<221>misc_feature
<222>(34)..(41)
<223>n为a、c、g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(73)..(73)
<223>n为a、c、g或t
<400>24
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnnnnn nttttttttt tttttttttt60
tttttttttt tvn 73
<210>25
<211>63
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的: K-寡聚dT
<220>
<221>misc_feature
<222>(24)..(31)
<223>n为a、c、g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(63)..(63)
<223>n为a、c、g或t
<400>25
tagaggccga ggcggccgac atgnnnnnnn nttttttttt tttttttttt tttttttttt60
tvn63
<210>26
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的: S-TSO
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(1)..(1)
<223>5Bios
<220>
<221>misc_feature
<222>(20)..(27)
<223>n为a、c、g或t
<400>26
rgagacagat tgcgcaatgn nnnnnnnrgr grg 33
<210>27
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的: S3-PCR1正向引物
<400>27
agagacagat tgcgcaatg 19
<210>28
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的: S3-PCR2正向引物
<400>28
actcgcgagg gacgtgaagc agagacagat tgcgcaatg 39
<210>29
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的: W-TSO
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(1)..(1)
<223>5Bios
<400>29
rttctagagg ccgaggcggc cgacatgrgr grg 33
<210>30
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的: W-PCR1正向引物
<400>30
attctagagg ccgaggcggc cgacatg27
<210>31
<211>77
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的: W-PCR2正向引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(21)..(50)
<223>n存在至少4次并且可重复达30次
<220>
<221>misc_feature
<222>(21)..(50)
<223>如果存在，n为a、c、g或t
<400>31
actcgcgagg gacgtgaagc nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn attctagagg60
ccgaggcggc cgacatg 77
<210>32
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的: N-TSO
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(1)..(1)
<223>5Bios
<400>32
rctatctaga gcggccgcrg rgrg 24
<210>33
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的: N-PCR1正向引物
<400>33
actatctaga gcggccgc18
<210>34
<211>68
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的: N-PCR2正向引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(21)..(50)
<223>n存在至少4次并且可重复达30次
<220>
<221>misc_feature
<222>(21)..(50)
<223>如果存在，n为a、c、g或t
<400>34
actcgcgagg gacgtgaagc nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn actatctaga60
gcggccgc 68
<210>35
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的: B-TSO
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(1)..(1)
<223>5Bios
<400>35
rcactctttc cctacacgac gctcttccga tctrgrgrg 39
<210>36
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的: B-PCR1正向引物
<400>36
acactctttc cctacacgac gctcttccga tct 33
<210>37
<211>53
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的: B-PCR2正向引物
<400>37
actcgcgagg gacgtgaagc acactctttc cctacacgac gctcttccga tct 53
<210>38
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的: K-TSO
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(1)..(1)
<223>5Bios
<400>38
kagaggccga ggcggccgac atgrgrgrg29
<210>39
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的: K-PCR1正向引物
<400>39
tagaggccga ggcggccgac atg23
<210>40
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的: K-PCR2正向引物
<400>40
actcgcgagg gacgtgaagc tagaggccga ggcggccgac atg43